朱孔飛，吳榕珍，吳子威，程麗娜，宋 茹

（浙江海洋大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江 舟山 316022）

藜麥（Chenopodium quinoaWilld.）屬于藜科植物，起源于安第斯地區(qū)，距今已有五千多年的種植歷史。1987年引入中國后，在西藏、寧夏、山西和四川等地皆有種植［1］。藜麥?zhǔn)且环N營養(yǎng)價(jià)值很高的偽谷物，富含蛋白質(zhì)、脂類、纖維、維生素和礦物質(zhì)等物質(zhì)。此外，藜麥還富含多酚、類黃酮、皂苷和植物甾醇類物質(zhì)，具有多種保健功效?；谄湄S富的營養(yǎng)價(jià)值和保健功能被聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）認(rèn)定為惟一一種單體植物就可滿足人體基本營養(yǎng)需求的食物，被國際營養(yǎng)學(xué)家稱為營養(yǎng)黃金、超級谷物［2］。有研究表明，藜麥中含有的多酚具有抗氧化、抑菌及調(diào)節(jié)人體免疫力等多種功能活性，在食品、醫(yī)藥、保健品等領(lǐng)域應(yīng)用前景廣闊［3，4］?，F(xiàn)已有研究對提取藜麥多酚的工藝大多采用乙醇—水溶液為提取劑，乙醇水溶液提取得到多酚含量高，但不利于工業(yè)安全。采用以水為提取劑，更加安全，且原料來源廣，價(jià)格低廉，有利于工業(yè)生產(chǎn)。所以本研究以紅藜麥為原材料，采用超聲輔助水浸提法提取藜麥多酚，以多酚提取率為指標(biāo)，探究物料粒度、液料比、提取時(shí)間和提取溫度對多酚提取率的影響，優(yōu)化多酚提取工藝參數(shù)，旨在提供一種高效清潔型的藜麥多酚提取方法，并對藜麥多酚抗氧化性進(jìn)行研究，為藜麥多酚工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅藜麥，山西省靜樂縣田園農(nóng)業(yè)綜合開發(fā)有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），北京索萊寶科技有限公司；總抗氧化能力（T-AOC）測試盒，南京建成生物研究所；福林酚、沒食子酸、無水碳酸鈉、抗壞血酸、無水乙醇等均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TGL-16G高速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；721可見分光光度計(jì)，上海菁華科技儀器有限公司；KQ5200E超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；TM-767攪拌機(jī)—專業(yè)沙冰調(diào)理機(jī)，中山市海盤電器有限公司；RE2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；DLSB-5/20低溫冷卻液循環(huán)泵，杭州惠創(chuàng)儀器設(shè)備有限公司；LGJ-10冷凍干燥機(jī)，河南兄弟儀器設(shè)備有限公司；SM800型酶標(biāo)儀，上海永創(chuàng)醫(yī)療器械有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 沒食子酸工作曲線的繪制 根據(jù)陳樹俊等［5］的方法進(jìn)行測定，稍作修改。具體如下：稱取0.01g沒食子酸，加水溶解，定容至100 mL。分別吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL沒食子酸溶液于10 mL比色管中，加入0.5 mL福林酚試劑，混勻，反應(yīng)5 min，然后加入1 mL的7%Na2CO3，用水定容至10 mL，放置室溫避光反應(yīng)1 h后，測定760 nm波長下的吸光值。以沒食子酸質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)（x）、吸光度值為縱坐標(biāo)（y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，經(jīng)擬合得到線性回歸方程y=0.051 9x+0.000 6（R2=0.998 2），用于計(jì)算提取液中多酚濃度。

1.3.2 樣品預(yù)處理 將紅藜麥粉碎，按照質(zhì)量加入5倍體積的石油醚，浸提24 h脫脂，干燥至恒重，密封袋中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 超聲輔助提取藜麥多酚單因素試驗(yàn) 以藜麥多酚提取率為指標(biāo)，在物料粒度60目、液料比100∶1（mL/g，下同）、提取時(shí)間20 min、提取溫度60℃的基礎(chǔ)上，分別研究物料粒度20、40、60、80、100、120目，液料比25∶1、50∶1、75∶1、100∶1、125∶1、150∶1，提取時(shí)間5、10、20、30、40、50、60 min，提取溫度24、30、40、50、60、70、80℃對藜麥多酚提取率的影響。

1.3.4 藜麥多酚類化合物提取率計(jì)算 參考闕淼琳等［6］方法，具體如下：取1 mL提取液，參照“1.3.1”標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法，測定提取液中多酚類化合物含量，計(jì)算藜麥多酚提取率。

式中，C為沒食子酸濃度（μg/mL），由“1.3.1”標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得；V為樣品提取液體積（mL）；N為提取液稀釋倍數(shù)；M為樣品質(zhì)量（g）。

1.3.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，確定超聲提取溫度為常溫，選擇物料粒度（A）、液料比（B）、提取時(shí)間（C）進(jìn)行三因素三水平Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)分析［7］，以藜麥多酚提取率為響應(yīng)值，采用Design-Expert 12軟件對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行擬合分析，具體因素水平及水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素和水平

1.3.6 抗氧化活性的測定

1）DPPH自由基清除率的測定。參照Bersuder等［8］的方法進(jìn)行改進(jìn)，將不同濃度的藜麥多酚提取液、去離子水和0.02%DPPH乙醇液，體積比為1∶4∶1混合，室溫下避光放置1 h，去離子水調(diào)零，在波長510 nm處測其吸光質(zhì)（A樣品），A對照是用等體積去離子水代替樣品的吸光質(zhì)，A樣品空白是用等體積無水乙醇代替0.02%DPPH乙醇液的吸光值。DPPH自由基清除率按照式（2）計(jì)算。

2）總抗氧化能力的測定。使用總抗氧化能力測試盒進(jìn)行測定。按要求準(zhǔn)備工作液，取藜麥多酚粗提物配制成一定質(zhì)量濃度的提取液備用，按操作步驟加入試劑，于520 nm處測定吸收度值（OD）。在37℃時(shí)，每分鐘每毫升樣品液使反應(yīng)體系的吸光度值每增加0.01時(shí)，為一個(gè)抗氧化能力單位，總抗氧化能力按照式（3）計(jì)算。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)用Excel 2018軟件進(jìn)行處理，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示（n=3）。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲輔助提取藜麥多酚單因素試驗(yàn)

由圖1a可知，當(dāng)物料粒度從20目到60目時(shí)（目數(shù)越大，固體顆粒粒徑越?。?，多酚提取率隨著藜麥粒徑的減小而明顯上升。由于物料粒徑減小，致使藜麥顆粒表面積增大，超聲時(shí)與溶劑的接觸面積增大［9］，對細(xì)胞壁的破壞作用增強(qiáng)，促進(jìn)多酚化合物的溶解，提高了多酚提取率。在60～120目，當(dāng)物料粒徑繼續(xù)減小時(shí)，多酚提取率趨向平緩，可能是由于超聲波在該條件下對藜麥細(xì)胞壁的破壞作用相差不大，或藜麥多酚已較完全地溶出，繼續(xù)減小物料粒徑對多酚提取率幾乎不產(chǎn)生影響［10］。由于固體顆粒粒徑過小，篩選不易，因此提取藜麥多酚要控制適合的粉碎粒度。

由圖1b可知，當(dāng)液料比從25∶1到100∶1時(shí)，多酚提取率隨著溶劑量的增加而快速上升。這是由于溶劑量較低時(shí)，藜麥顆粒和溶劑接觸不充分，造成提取不完全。隨著溶劑量的加大，樣品顆粒與溶劑接觸更為充分，提高了多酚的提取率。當(dāng)液料比從100∶1到150∶1時(shí)，提取率穩(wěn)定在一定范圍。溶劑量過高會增加藜麥顆粒中其他水溶性雜質(zhì)溶出［11］，降低多酚的提取率，且溶劑量過大也不利于后續(xù)濃縮處理。

由圖1c可知，當(dāng)超聲提取溫度從24℃（室溫）升高到60℃時(shí)，多酚提取率總體變化不大。當(dāng)提取溫度為70℃時(shí)，多酚提取率達(dá)到0.51%，可能是因?yàn)闇囟壬咴黾尤軇┓肿优c溶質(zhì)分子間動(dòng)能，促進(jìn)多酚溶解，從而提高了多酚提取率。但是當(dāng)提取溫度大于70℃時(shí)，多酚的提取率出現(xiàn)下降趨勢，可能與溫度過高導(dǎo)致多酚類化合物發(fā)生氧化或降解有關(guān)［12］。

由圖1d可知，當(dāng)超聲提取時(shí)間從5 min增加到10 min時(shí)，多酚提取率隨時(shí)間增加而上升，在提取時(shí)間10 min時(shí)，多酚提取率最高達(dá)到0.49%。當(dāng)提取時(shí)間大于10 min時(shí)，多酚提取率出現(xiàn)下降趨勢，可能是由于超聲波機(jī)械振動(dòng)產(chǎn)生熱能促進(jìn)多酚化合物的降解或促使其他物質(zhì)的溶出［13］，從而降低多酚的提取率。

圖1 不同提取條件對藜麥多酚提取率的影響

2.2 超聲輔助提取藜麥多酚響應(yīng)面試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果與方差分析 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇對藜麥多酚提取率影響大的液料比（A）、物料粒度（B）和提取時(shí)間（C）進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面分析試驗(yàn)，結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

經(jīng)Design-Expert 12軟件對表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸方程分析，得到Y(jié)（多酚提取率）、A（液料比），B（物料粒度），C（提取時(shí)間）的回歸線方程：Y=0.410 6+0.042 4A+0.085 8B+0.004 4C+0.006 2AB+0.0085AC-0.0093BC+0.0017A2-0.0271B2+0.0092C2?；貧w方程中各項(xiàng)系數(shù)絕對值的大小和正負(fù)，分別反映各單因素對響應(yīng)值的影響程度和影響方向［14］。表3方差分析結(jié)果顯示模型P為0.000 2小于0.05，失擬項(xiàng)值0.352 8大于0.05，且模型R2=0.963 5，表示試驗(yàn)?zāi)Ｐ陀行Э尚?，可用于預(yù)測超聲輔助藜麥提取率的高低。當(dāng)P<0.05時(shí)，說明該因素對響應(yīng)值影響顯著。由此可知，液料比、物料粒度對藜麥多酚提取率有顯著影響，而提取時(shí)間影響不顯著。

2.2.2 響應(yīng)面交互作用 液料比和物料粒度（AB），液料比和提取時(shí)間（AC），物料粒度和提取時(shí)間（BC）的交互作用與藜麥多酚提取率的關(guān)系見圖2。由圖2a可知，當(dāng)液料比一定時(shí)，隨著目數(shù)增大，即物料粒徑減小，藜麥多酚提取率顯著增大，說明物料粒度對藜麥多酚提取率有顯著線性影響，即物料粒徑越小，與提取液的接觸面積增大，有利于提取溶劑與藜麥的充分反應(yīng)，且多酚從物料內(nèi)部擴(kuò)散到溶劑所需時(shí)間越短，因而提取率增高，這與表3方差分析結(jié)果一致；當(dāng)物料粒度一定時(shí)，藜麥多酚的提取率隨著料液比的增大而增大，說明增大提取劑用量有助于多酚從物料內(nèi)部擴(kuò)散到溶劑中，可能與增大物料內(nèi)外多酚濃度差有關(guān)。由圖2b可知，當(dāng)提取時(shí)間一定時(shí)，液料比增大有利于提高藜麥多酚提取率；當(dāng)液料比一定時(shí)，隨著超聲提取時(shí)間的增大，藜麥多酚提取率的變化平緩，說明超聲提取時(shí)間對藜麥提取率并無顯著影響。由圖3c可知，當(dāng)物料粒度一定時(shí)，藜麥多酚的提取率沒有隨著超聲提取時(shí)間的變化而發(fā)生明顯改變；當(dāng)提取時(shí)間一定時(shí)，藜麥多酚的提取率隨著物料粒度目數(shù)的增大而顯著提高，進(jìn)一步說明了物料粒度對藜麥多酚提取率有顯著影響，與圖2a結(jié)果一致。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析

由軟件分析得出超聲輔助提取藜麥多酚最佳工藝參數(shù)為液料比100∶1，物料粒度80目，超聲提取時(shí)間20.0 min，在此條件下，藜麥多酚的提取率理論值達(dá)0.532%。在優(yōu)化提取條件下進(jìn)行了3組平行試驗(yàn)，驗(yàn)證藜麥多酚實(shí)際平均提取率達(dá)到0.526%，與理論預(yù)期值接近，表明試驗(yàn)確定的優(yōu)化條件是合理的，可以推廣用于藜麥多酚的超聲輔助提取。

2.3 抗氧化能力的測定

2.3.1 DPPH自由基清除能力的測定 由圖3可知，藜麥多酚和抗壞血酸清除DPPH自由基的能力在一定范圍內(nèi)隨著質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)。擬合可得藜麥多酚和抗壞血酸線性回歸方程分別為Y藜麥多酚=4.474 2X（R2=0.983）和Y抗壞血酸=4.711 5X（R2=0.985 1），計(jì)算得出藜麥多酚與抗壞血酸清除DPPH自由基的IC50分別為11.18、10.61μg/mL，說明藜麥多酚對DPPH自由基清除能力與抗壞血酸近似，其具有較好的DPPH自由基清除能力。

圖3 藜麥多酚與抗壞血酸對DPPH清除率的影響

2.3.2 總抗氧化能力的測定 從表4可以看出，藜麥多酚提取液的總抗氧化能力與抗壞血酸相近，說明以水為提取劑，采用超聲輔助浸提法得到的藜麥多酚提取液具有較好的總抗氧化能力。藜麥水提液中存在多種具有抗氧化活性成分，如多酚、黃酮、皂苷等，但最主要的是多酚類物質(zhì)，研究表明多酚類發(fā)揮強(qiáng)抗氧化作用與其為自由基提供供體，阻斷自由基連鎖反應(yīng)有關(guān)［2］。

表4 總抗氧化能力對比

3 小結(jié)

超聲輔助水浸提藜麥多酚具有快速、安全、無污染優(yōu)點(diǎn)，在研究物料粒度、液料比、提取時(shí)間和提取溫度對藜麥多酚提取率影響基礎(chǔ)上，選用物料粒度、液料比、提取時(shí)間進(jìn)行三因素三水平Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)，確定室溫下超聲輔助水浸提藜麥多酚的最佳工藝條件為物料粒度80目、液料比100∶1、提取時(shí)間20 min，該條件下藜麥多酚的提取率達(dá)到0.53%。藜麥多酚提取液對DPPH自由基清除率和總抗氧化能力與抗壞血酸的抗氧化能力相當(dāng)。因此，藜麥多酚提取液有進(jìn)一步開發(fā)作為天然抗氧化劑的應(yīng)用前景。