王 丹，崔衛(wèi)濤，王 純，況世昌，許青榮，肖運才，李自力，周祖濤

（華中農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院/湖北省預防獸醫(yī)學重點實驗室/生物發(fā)酵制劑湖北省工程研究中心，武漢 430070）

抗生素自1950年開始被應用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)，在一定時期和程度上對全球畜牧業(yè)的發(fā)展作出了卓越貢獻。然而由于抗生素的不規(guī)范使用導致的危害日益凸顯，如耐藥菌株增加、畜禽腸道正常菌群紊亂、動物免疫力下降以及畜禽產(chǎn)品抗生素殘留等［1］。因此，在畜牧業(yè)生產(chǎn)中，尋找無副作用、促生長效果良好的綠色無公害的抗生素替代品是必然趨勢。

中草藥是中國5 000多年歷史的傳承，中草藥飼料添加劑具有純天然、無抗藥性、較低或無毒副作用等優(yōu)點。中藥含有多糖、生物堿、有機酸、苷類等有效成分，可促進動物生長發(fā)育、提高免疫力，同時對動物腸道微生物菌群和胃腸道結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響［2］。然而中草藥使用也存在一定的限制：使用劑量大、性味苦澀和有效成分利用率較低，因此衍生出益生菌發(fā)酵中藥制劑。研究表明，中草藥經(jīng)微生物發(fā)酵后，其有效成分提高，藥效增強，毒副作用降低，口感改善［3］。因此，本試驗采用益生菌發(fā)酵中藥制劑（黃芪、杜仲、五味子、訶子），將其添加于肉雞的飼糧中，評價對肉雞生產(chǎn)性能、血清抗氧化指標、免疫器官指數(shù)、免疫因子、黏膜sIgA水平、腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)和腸道菌群的影響，為益生菌發(fā)酵中藥制劑替代肉雞日糧中抗生素的可行性提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

益生菌發(fā)酵中藥制劑：經(jīng)薄層色譜鑒定為合格的發(fā)酵中藥制劑，主要成分為黃芪、杜仲、五味子和訶子，由湖北華大瑞爾科技有限公司提供；15%金霉素購自金河生物科技股份有限公司。

1.2 試驗動物與試驗設計

288只1日齡AA肉雞，隨機分為3個組，每組8個重復，每個重復12只雞，公母各半。基礎日糧為玉米豆粕型日糧，參照NRC（1994）營養(yǎng)需要配制。對照組飼喂基礎日糧，抗生素組飼喂含有50 g/t金霉素的基礎日糧，發(fā)酵中藥制劑組飼喂添加3 kg/t益生菌發(fā)酵中藥制劑的基礎日糧。試驗周期為42 d，按照肉雞飼喂標準進行管理。

1.3 指標測定及方法

1.3.1 生長性能指標測定 試驗期間，每天記錄各組采食量和雞群數(shù)量；在試驗第1天和第42天8：00分別對各組雞群空腹稱重，計算各組平均體重、平均日增重、平均日釆食量和料肉比。平均體重（g）=稱重總重量/稱重只數(shù)；平均日增重（g）=（末重-初重）/試驗天數(shù)；料肉比=總耗料（kg）/出欄雞總重量（kg）。1.3.2 血清指標測定 試驗第42天時，每組隨機抽取9只雞，翅下靜脈采血3 mL，將促凝管血樣傾斜置于冰上2 h，待血液凝固血清析出后，3 000 r/min離心5 min，去除雜質(zhì)取上清液，于-80℃保存。血清抗氧化指標：總超氧化物歧化酶（T-SOD）、丙二醛（MDA）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）按試劑盒說明書方法檢測，試劑盒購自南京建成生物科技有限公司。血清細胞因子與內(nèi)毒素：內(nèi)毒素（EDT）、IL-1β、IL-6、IL-10按試劑盒說明書上的方法檢測，試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.3.3 免疫器官指數(shù)檢測 試驗第42天時，每組隨機抽取9只雞，稱取每只采樣雞空腹活體重量后頸部靜脈放血處死。依次摘取胸腺、脾臟、法氏囊，用吸水紙吸取血漬，剝離表面結(jié)締組織和脂肪后稱鮮重，計算免疫器官指數(shù)：免疫器官指數(shù)（g/kg）=免疫器官重（g）/宰前活重（kg）。

1.3.4 腸道形態(tài)檢測 從盲腸和回腸中段小心切取約2 cm長的組織樣品，石蠟包埋切片后進行蘇木素-伊紅（HE）染色封片，使用日本Nikon 80i生物光學顯微鏡并結(jié)合NIS-Elements高清晰度彩色圖文分析系統(tǒng)進行測量、觀察和取圖。每組各腸道選取6張切片測定絨毛髙度（VH）和隱窩深度（CD），并計算絨毛高度與隱窩深度的比值（VH/CD）。

1.3.5 黏膜sIgA檢測 石蠟切片脫蠟后，置于檸檬酸抗原修復緩沖液（pH 6.0）進行抗原修復，放入3%過氧化氫溶液用于阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，3%BSA均勻覆蓋組織封閉。封閉后加一抗羊抗雞IgA抗體，4℃反應過夜。切片稍甩干后滴加與二抗HRP標記兔抗羊IgG抗體反應，室溫孵育50 min。DAB顯色，復染細胞核，脫水封片，顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。

1.3.6 盲腸菌群檢測 取固定位置和長度的盲腸，置于50 mL滅菌離心管中保存，于無菌超凈臺中稱取腸道內(nèi)容物，每組采集的糞便樣品混合。糞便樣品使用OMAGE E.Z.N.A.Bacterial DNA試劑盒提取細菌總基因組DNA。用SYBR Green I Real-time PCR檢測法檢測盲腸內(nèi)容物中乳酸桿菌、沙門氏菌和普氏糞桿菌的含量，具體方法參考Walter等［4］、張敬平等［5］和蔣曼等［6］。每個樣品3個重復，根據(jù)標準曲線計算定量結(jié)果。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理 試驗數(shù)據(jù)通過Excel 2013軟件進行處理，并采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析，利用ANOVA、LSD進行差異顯著性檢驗和Duncan多重比較，試驗結(jié)果以平均值±標準差（Mean±SD）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵中藥制劑對肉雞生長性能的影響

發(fā)酵中藥制劑對肉雞生產(chǎn)性能的影響結(jié)果見表1。由表1可知，在試驗階段，抗生素組、發(fā)酵中藥制劑組肉雞的出欄均重顯著高于對照組（P<0.05），發(fā)酵中藥制劑組出欄均重比抗生素組提高了4.51%。發(fā)酵中藥制劑組平均日增重比對照組和抗生素組顯著提高了8.19%和4.61%（P<0.05）。在平均日采食量方面，各組差異不顯著。與對照組相比，發(fā)酵中藥制劑組的料肉比降低0.17（P<0.05），與抗生素組相比，發(fā)酵中藥制劑組料肉比降低0.02（P>0.05）。

表1 發(fā)酵中藥制劑對肉雞生產(chǎn)性能的影響

2.2 發(fā)酵中藥制劑對肉雞血清抗氧化指標的影響

發(fā)酵中藥制劑對肉雞血清抗氧化指標的影響結(jié)果見表2。由表2可知，發(fā)酵中藥制劑組總超氧化物歧化酶的含量高于對照組和抗生素組，但差異不顯著；丙二醛含量比對照組、抗生素組分別顯著降低32.22%（P<0.05）、45.63%（P<0.05）。發(fā)酵中藥制劑組谷胱甘肽過氧化物酶較對照組顯著提高9.77%（P<0.05），與抗生素組相比差異不顯著。

表2 發(fā)酵中藥制劑對肉雞血清抗氧化指標的影響

2.3 發(fā)酵中藥制劑對肉雞免疫功能的影響

2.3.1 發(fā)酵中藥制劑對肉雞免疫器官的影響 發(fā)酵中藥制劑對肉雞免疫器官的影響結(jié)果見表3。發(fā)酵中藥制劑組脾臟指數(shù)比對照組、抗生素組分別提高了22.92%（P>0.05）、9.26%（P>0.05）。法氏囊指數(shù)上，發(fā)酵中藥制劑組法氏囊指數(shù)最高，但差異不顯著（P>0.05）。抗生素組、發(fā)酵中藥制劑組的胸腺指數(shù)顯著比對照組提高了10.18%、78.44%（P<0.05），發(fā)酵中藥制劑組比抗生素組提高了61.96%（P<0.05）。結(jié)果表明，肉雞日糧中添加發(fā)酵中藥制劑可以顯著提高胸腺指數(shù)，增加肉雞免疫器官比重，增強肉雞免疫功能。

表3 發(fā)酵中藥制劑對肉雞免疫器官的影響

2.3.2 發(fā)酵中藥制劑對肉雞血清細胞因子和內(nèi)毒素的影響 發(fā)酵中藥制劑對肉雞血清細胞因子和內(nèi)毒素的影響結(jié)果見表4。由表4可知，發(fā)酵中藥制劑組IL-1β含量較對照組、抗生素組降低34.40%（P<0.05）、28.73%（P<0.05）；發(fā)酵中藥制劑組IL-6含量最高，比對照組、抗生素組提高了132.61%（P<0.05）、117.63%（P<0.05）。發(fā)酵中藥制劑組IL-10含量比對照組、抗生素組提高67.88%（P<0.05）、36.85%（P>0.05）；發(fā)酵中藥制劑組EDT含量較對照組、抗生素組降低了48.28%（P<0.05）、23.36%（P>0.05）。結(jié)果表明，在肉雞日糧中添加發(fā)酵中藥制劑可降低IL-Iβ、EDT含量同時，提高IL-6、IL-10的含量。

表4 發(fā)酵中藥制劑對免疫細胞因子的影響

2.3.3 發(fā)酵中藥制劑對肉雞腸道黏膜sIgA的影響發(fā)酵中藥制劑對肉雞腸道黏膜sIgA的影響結(jié)果見圖1。由圖1可知，發(fā)酵中藥制劑組回腸黏膜sIgA比對照組的提高了44.2%（P<0.05），比抗生素組的提高了43.4%（P<0.05）；發(fā)酵中藥制劑組盲腸黏膜sIgA比對照組的提高了66.9%（P<0.05），比抗生素組的提高了65.5%（P<0.05）。

圖1 發(fā)酵中藥制劑對肉雞腸道黏膜sIgA的影響

2.4 發(fā)酵中藥制劑對肉雞腸道結(jié)構(gòu)的影響

發(fā)酵中藥制劑對肉雞腸道結(jié)構(gòu)的影響結(jié)果見表5。由表5可知，抗生素組、發(fā)酵中藥制劑組回腸VH/VD比對照組分別提高了100.72%（P<0.01）、156.94%（P<0.01），發(fā)酵中藥制劑組比抗生素組提高了28.00%（P<0.01）；抗生素組、發(fā)酵中藥制劑組盲腸VH/VD比對照組分別提高了25.32%（P<0.05）、66.06%（P<0.05），發(fā)酵中藥制劑組比抗生素組提高了32.50%（P<0.05）。結(jié)果表明，在肉雞日糧中添加發(fā)酵中藥制劑可以顯著提高盲腸以及回腸的絨毛高度，降低隱窩深度數(shù)值，提高VH/CD的比值。

表5 發(fā)酵中藥制劑對肉雞腸道結(jié)構(gòu)的影響

2.5 發(fā)酵中藥制劑對肉雞盲腸菌群的影響

將乳酸桿菌、沙門氏菌和普氏糞桿菌的質(zhì)粒標準品進行熒光定量PCR擴增，構(gòu)建標準曲線（圖2）。乳酸桿菌的標準曲線回歸方程為y=-3.479 7x+49.346，R2為0.992 6；沙門氏菌的標準曲線回歸方程為y=-1.899 4x+40.92，R2為0.992 3；普氏糞桿菌的標準曲線回歸方程為y=-3.380 4x+50.819，R2為0.993 7。結(jié)果表明，線性關系好，符合試驗要求，可用于后續(xù)定量分析。

圖2 乳酸桿菌、沙門氏菌標曲和普氏糞桿菌的標準曲線

發(fā)酵中藥制劑對肉雞盲腸內(nèi)容物菌群影響結(jié)果見表6。發(fā)酵中藥制劑組乳酸桿菌含量最高，比對照組提高了40.66%（P<0.05），比抗生素組提高了24.27%（P>0.05）。抗生素組沙門氏菌含量相對于對照組增加了4.05%（P>0.05），發(fā)酵中藥制劑組比對照組和抗生素組分別降低了17.76%（P>0.05）、20.96%（P<0.05）。發(fā)酵中藥制劑組普氏糞桿菌數(shù)量為最高，相對于對照組提高了12.44%（P<0.05），比抗生素組提高了3.42%（P>0.05）。

表6 發(fā)酵中藥制劑對肉雞盲腸菌群的影響［單位：log（copies/g）］

3 小結(jié)與討論

在動物養(yǎng)殖中，生產(chǎn)性能是衡量動物生長發(fā)育優(yōu)劣與否的最重要指標。李雪雁等［7］使用乳酸菌發(fā)酵中藥飼喂麻黃雜雛雞，發(fā)酵中藥組在試驗0～3周和4～5周兩個時間段的生長性能好于中藥組和對照組。李宗杰［8］研究發(fā)現(xiàn)，復方發(fā)酵中藥可以提高肉雞的平均日增重，降低料肉比，提高特異性免疫抗體水平。賀永康等［9］用0.5%、1.0%、1.5%和2.0%的中草藥添加劑（組方：白頭翁、黃芪、黃連、黨參、大黃等）飼喂1日齡羅氏308肉雞，試驗期42 d，試驗結(jié)束后2.0%中草藥添加劑組十二指腸和空腸VH/CD值較對照組提高32.02%（P<0.01）和15.44%（P<0.01）。本試驗中發(fā)酵中藥制劑組的平均日增重相對于對照組和抗生素組均顯著提高，與對照組相比，發(fā)酵中藥制劑組料肉比降低0.17（P<0.05），比抗生素組降低0.02（P>0.05），顯示良好的促生長性能。小腸是機體消化和吸收的主要部位，腸壁形態(tài)結(jié)構(gòu)的完整性是影響腸道健康和機體消化吸收的關鍵。在腸道結(jié)構(gòu)方面，發(fā)酵中藥制劑組回腸VH/VD值比對照組提高156.94%（P<0.01），較抗生素組增加28.00%（P<0.01）；發(fā)酵中藥制劑組盲腸VH/VD值比對照組、抗生素組分別提高了66.06%（P<0.01）、32.50%（P<0.05）。本試驗結(jié)果與前人研究報道一致，證實了發(fā)酵中藥制劑可改善肉雞腸道結(jié)構(gòu)，促進營養(yǎng)物質(zhì)吸收，提高肉雞生長性能［10］。

肉雞的免疫器官主要有胸腺、脾臟和法氏囊，其中胸腺和法氏囊為初級免疫中樞器官，脾臟為次級淋巴器官。免疫器官系數(shù)可反映動物的免疫功能狀態(tài)［11］。本試驗中肉雞日糧中添加發(fā)酵中藥制劑，試驗42 d時，發(fā)酵中藥制劑組的脾臟指數(shù)、法氏囊指數(shù)和胸腺指數(shù)比抗生素組均提高，分別增加9.26%（P>0.05）、7.69%（P>0.05）和61.95%（P<0.05）。相比抗生素組，發(fā)酵中藥制劑組血清IL-1β含量降低28.73%（P<0.05）、IL-6含量提高117.63%（P<0.05）、IL-10含量提高36.85%（P>0.05）、EDT含量降低23.36%（P>0.05）。血清中IL-1β含量降低、IL-6含量升高，IL-10的含量升高以及EDT的含量較少，說明機體的炎癥反應減少，機體肝臟受到的損傷機率降低［12］。分泌型IgA（sIgA）是機體防御系統(tǒng)的主要組成成分，由漿細胞產(chǎn)生，能抑制微生物在呼吸道上皮附著，尤其可以減緩細菌病毒等的生長速度，第一時間啟動機制保護機體免受損傷［13］?；啬c黏膜sIgA和盲腸黏膜sI?gA含量均提高。動物體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的代謝產(chǎn)物包括MDA，能夠反映機體受自由基攻擊所受損傷的嚴重程度，而T-SOD可以間接反映機體清除自由基的能力，所以通常MDA含量的測定常與T-SOD活性相互配合［14］。GSH-Px是動物機體內(nèi)普遍存在的一種過氧化物分解酶，可以保護細胞膜的結(jié)構(gòu)及功能不受過氧化物的干擾及損害［15］。本試驗中發(fā)酵中藥制劑組T-SOD和GSH-Px含量較抗生素組都有提高，但差異不顯著，而MDA含量降低45.6%（P<0.05）。結(jié)果表明，發(fā)酵中藥制劑可增強肉雞的免疫功能，提高抗氧化能力。

腸道菌群通過基因的演化，菌株水平基因的轉(zhuǎn)移等方式在機體的健康中扮演重要的角色，起到了調(diào)節(jié)機體平衡的生物屏障作用。但是，目前濫用抗生素使得腸道菌群的平衡發(fā)生紊亂。通過研究發(fā)現(xiàn)益生菌可以改善腸道內(nèi)微生物菌群的失調(diào)狀況，通過調(diào)節(jié)菌群在機體內(nèi)的作用進而降低疾病的發(fā)生幾率［16］。普氏糞桿菌在動物腸道內(nèi)也很常見，普氏糞桿菌在動物腸道內(nèi)與動物的免疫作用息息相關，對動物的免疫功能起不可忽視的作用。陳柯源［17］將當歸補血湯（DBT）使用枯草芽孢桿菌發(fā)酵，DBT發(fā)酵產(chǎn)物飼喂SD大鼠，對糞便微生物進行高通量測序，結(jié)果表明，DBT發(fā)酵產(chǎn)物顯著上調(diào)植物乳桿菌含量，下調(diào)另枝菌屬和副擬桿菌屬等病原菌的含量［18］。本試驗中發(fā)酵中藥制劑組乳酸桿菌含量最高，比抗生素組提高了24.27%（P<0.05），沙門氏菌含量比抗生素組降低了20.96%（P<0.05）。發(fā)酵中藥制劑組的普氏糞桿菌的數(shù)量為最高，相對于對照組提高了12.44%（P<0.05）。結(jié)果表明，發(fā)酵中藥制劑提高肉雞腸道有益菌含量，降低抑制致病菌含量，維持了肉雞腸道菌群平衡。