田宇曦，陳 凌，閔 勇，楊自文

（湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心，武漢 430064）

絮凝是將分散的小顆粒聚攏形成大絮凝物的過程，絮凝劑廣泛應(yīng)用于可飲用水凈化、廢水處理、下游處理、食品發(fā)酵工業(yè)等［1，2］。絮凝劑一般能分成3類，即無機(jī)絮凝劑、有機(jī)合成絮凝劑和天然產(chǎn)生的絮凝劑，其中，天然產(chǎn)生的絮凝劑包括海藻酸鈉、殼聚糖和微生物源絮凝劑。細(xì)菌、真菌、藻類和放線菌都能產(chǎn)生微生物絮凝劑，包括多聚糖、功能蛋白和糖蛋白等［3］。產(chǎn)生微生物絮凝劑的微生物分離自淡水環(huán)境、活性污泥、土壤、啤酒廢水和海洋沉積物等［4-6］。在絮凝領(lǐng)域，化學(xué)合成絮凝劑因為廉價和絮凝率高被廣泛應(yīng)用，但是其使用會引起一些環(huán)境問題和老年癡呆癥等健康隱患［7，8］。用環(huán)境友好型、可生物降解的微生物源絮凝劑替代化學(xué)合成絮凝劑越來越受到關(guān)注，微生物源絮凝劑通過絮凝過程修復(fù)污染的水體，相比普通的化學(xué)絮凝更經(jīng)濟(jì)且環(huán)保［9］。農(nóng)村污水分散，不像城市有完善的污水收集和處理系統(tǒng)，農(nóng)村污水污染物毒性較低，可生化性好，且農(nóng)村對環(huán)境安全的要求更高，微生物源絮凝劑綠色無污染，能很好地滿足農(nóng)村污水處理的環(huán)保要求，甚至實現(xiàn)資源的循環(huán)利用［10］。但是，盡管有大量微生物被發(fā)現(xiàn)能產(chǎn)生生物絮凝劑，真正商業(yè)應(yīng)用的卻幾乎沒有［11，12］。

為了開發(fā)用于農(nóng)村污水治理的高絮凝活性菌株，擬對高絮凝活性放線菌ws75382進(jìn)行16SrDNA鑒定，為了降低絮凝劑的生產(chǎn)成本，并利用單因素試驗和正交試驗對其培養(yǎng)基組分進(jìn)行優(yōu)化，以期獲得最節(jié)省的培養(yǎng)組分，為今后將其在農(nóng)村污水治理領(lǐng)域規(guī)模化應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株為湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心菌種保藏中心保藏的放線菌。

培養(yǎng)基：①ISP2固體培養(yǎng)基：葡萄糖4 g/L，酵母粉4 g/L，麥芽浸出粉10 g/L，碳酸鈣2 g/L，瓊脂18 g/L，自然pH。②種子培養(yǎng)基：大豆粉20 g/L，葡萄糖20 g/L，硫酸銨5 g/L，氯化鈉8 g/L，碳酸鈣2 g/L，pH 7.0［13］。③發(fā)酵培養(yǎng)基：碳源、氮源、氯化鈉，碳酸鈣，pH 7.0。

細(xì)菌基因組提取試劑盒購自上海賽百盛基因技術(shù)有限公司，引物27F和1492R由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，高嶺土和EasyTaq混合酶購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 放線菌的培養(yǎng)條件和絮凝率的測定

將湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心保存的放線菌ws75382斜面在ISP2固體平板上劃線活化，30℃倒置培養(yǎng)3～5 d。從活化平板挑菌塊1 cm2接入裝有50 mL種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，30℃搖床培養(yǎng)2 d，后將發(fā)酵液0.5 mL轉(zhuǎn)接入裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，30℃搖床培養(yǎng)2～3 d，鏡檢無污染后，取發(fā)酵液1.5 mL，12 000 r/min離心1 min，將發(fā)酵液上清液500μL加入20 mL 5 g/L高嶺土（加有40μL 1 mol/L CaCl2，均置于帶橡膠軟塞的玻璃試管中）上下顛倒混勻5 min，靜置3 min，取液面下1～2 cm處液體100μL至96孔板，用酶標(biāo)儀在550 nm處測定吸光度OD550nm。對照是沒有發(fā)酵的發(fā)酵培養(yǎng) 基 上清 液。絮凝 率=（OD樣品-OD對照）/（OD對照-OD背景）×100%。

1.3 菌株的16S rDNA鑒定

采用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取菌株ws75382基因組，使用細(xì)菌16SrRNA通用引物對其進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物 序列如下，27F：5′-AGAGTTTGATCCT GGCTCAG-3′和1492R：5′-ACGGCTACCTTGTTACG ACTT-3′。擴(kuò)增體系：2×EasyTaq混合酶體系25μL，DNA模板1μL，上下游引物各1μL，加入ddH2O補(bǔ)足體積至50μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：94℃2 min；94℃30 s，58℃30 s，72℃90 s，30個循環(huán)；72℃10 min，4℃無限循環(huán)終止反應(yīng)。使用濃度為1%（W/V）的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增后的產(chǎn)物，然后送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序，獲得16SrDNA完整序列信息。登錄NCBI網(wǎng)站（www.ncbi.nlm.nih.gov），將獲得的基因序列與GenBank中已知的序列進(jìn)行同源性比對分析，根據(jù)所獲得的相似性序列，用軟件MEGA-X采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 發(fā)酵培養(yǎng)基組分的優(yōu)化

找到種子發(fā)酵液條件下絮凝率為50%左右的發(fā)酵液稀釋度，在此稀釋度下進(jìn)行碳氮源優(yōu)化試驗。①氮源試驗：以種子培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，只改變氮源，考察20、15 g/L大豆粉分別與5 g/L蛋白胨、酵母浸粉和硫酸銨配合作氮源對放線菌ws75382絮凝率的影響，選出最佳氮源。②碳源試驗：以種子培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，只改變碳源，考察20 g/L葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和可溶性淀粉作碳源對放線菌ws75382絮凝率的影響，選出最佳碳源。使用SPSS17.0統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行單因素方差分析（Turkey′s HSD test，P<0.05），分析數(shù)據(jù)間的差異顯著性。

正交試驗同樣使用相同比例稀釋后的發(fā)酵液，將試驗獲得的最佳氮、碳源及氯化鈉和碳酸鈣進(jìn)行正交試驗L16（45），獲得最佳培養(yǎng)基配方。

2 結(jié)果與分析

2.1 ws75382菌株的鑒定

湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心保存的放線菌ws75382在種子培養(yǎng)基中發(fā)酵可以達(dá)91.9%的絮凝活性。種子培養(yǎng)基有5種培養(yǎng)組分且各組分濃度都偏高。ws75382的16SrDNA擴(kuò)增長度為1 433 bp，通過NCBI BLAST顯示其與Streptomyces cyslabdani?cusstrain K04-0144同源性最高，相似度為99.22%。ws75382的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1）顯示，其與Streptomy?cescyslabdanicusstrain K04-0144親緣關(guān)系最近。

圖1 ws75382 16Sr DNA系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基組分的優(yōu)化

2.2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮、碳源對放線菌ws75382絮凝率的影響 種子發(fā)酵液發(fā)酵條件下，ws75382發(fā)酵液和去離子水按30∶1（V/V）稀釋，稀釋后的發(fā)酵液上清絮凝率為64.9%，將單因素試驗中各發(fā)酵液均按發(fā)酵液∶水為30∶1稀釋，氮源優(yōu)化結(jié)果見圖2，碳源優(yōu)化結(jié)果見圖3。由圖2可以看出，大豆粉單獨作為氮源，放線菌ws75382發(fā)酵上清液絮凝率最高，顯著優(yōu)于在大豆粉基礎(chǔ)上添加其他氮源，而大豆粉添加蛋白胨和酵母粉又顯著優(yōu)于大豆粉+硫酸銨。所以，作為氮源，大豆粉最有利于放線菌ws75382產(chǎn)生絮凝劑。由圖3可以看出，4種碳源之間沒有顯著性差異，麥芽糖最有利于放線菌ws75382產(chǎn)生絮凝劑，其次是葡萄糖，考慮到麥芽糖成本較高，選擇葡萄糖作為放線菌ws75382發(fā)酵碳源。

圖2 N源優(yōu)化結(jié)果

圖3 C源優(yōu)化結(jié)果

2.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果 根據(jù)氮、碳源單因素試驗結(jié)果，選取大豆粉、葡萄糖及其他培養(yǎng)基成分，按L16正交表安排試驗，考察各培養(yǎng)基組分對放線菌ws75382絮凝率的綜合影響。正交試驗因素與水平見表1，正交試驗結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表1 優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基組分的正交試驗因素水平（單位：g/L）

由表2直觀極差分析可以看出，以絮凝率為評價指標(biāo)，各因素對放線菌ws75382絮凝率的影響大小表現(xiàn)為A>C>D>B。最優(yōu)組合為A3B3C4D2，即培養(yǎng)基最佳配方為大豆粉15 g/L，葡萄糖14 g/L，氯化鈉8 g/L和碳酸鈣3 g/L。由表3方差分析可見，大豆粉和氯化鈉對放線菌ws75382絮凝率的影響極顯著，與直觀分析結(jié)果一致。以A3B3C4D2培養(yǎng)基配方進(jìn)行3次驗證試驗，所得絮凝率接近100%，證明其是優(yōu)配方。

表2 正交試驗結(jié)果

表3 極差分析結(jié)果

3 小結(jié)與討論

未優(yōu)化前，培養(yǎng)基配方為大豆粉20 g/L、葡萄糖20 g/L、硫酸銨5 g/L、氯化鈉8 g/L、碳酸鈣2 g/L，放線菌ws75382絮凝率為91.9%。經(jīng)過優(yōu)化，培養(yǎng)基配方為大豆粉15 g/L、葡萄糖14 g/L、氯化鈉8 g/L和碳酸鈣3 g/L，放線菌ws75382絮凝率為100%。相對初始培養(yǎng)基，優(yōu)化后的培養(yǎng)基不僅組分簡化，氮源只需采用一種組分大豆粉，此外氮源和碳源的量分別降低了40%和30%。