李戰(zhàn)軍，張建柏，曹亞男，陳坤，劉蓬，徐惠章，王鶴*

(1.山東省漁業(yè)發(fā)展和資源養(yǎng)護(hù)總站，山東 煙臺(tái) 264003； 2.煙臺(tái)市海洋經(jīng)濟(jì)研究院，山東 煙臺(tái) 264006)

副乳房鏈球菌Streptococcusparauberis最初被認(rèn)為是乳房鏈球菌S.uberisⅡ型[1]，直到1990年Williams等[2]通過反轉(zhuǎn)錄酶序列分析，發(fā)現(xiàn)二者在系統(tǒng)發(fā)育上不同，并通過DNA雜交驗(yàn)證了二者的差異，由此命名。副乳房鏈球菌作為魚類鏈球菌病原是在1993年西班牙養(yǎng)殖大菱鲆Scophthalmusmaximus暴發(fā)鏈球菌感染之后[3]，而此前一直認(rèn)為該菌是引起牛乳房炎的主要病原之一[4]。目前，除牛、豬等[5-6]畜禽外，副乳房鏈球菌在水生動(dòng)物中的主要感染對(duì)象有牙鲆Paralichthysolivaceus、虹鱒Oncorhynchusmykiss和星斑川鰈Platichthysstellatus等[7-9]，該菌是引起日韓養(yǎng)殖牙鲆鏈球菌病的主要病原，曾造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[7,10]。中國(guó)魚源副乳房鏈球菌感染鮮有報(bào)道，筆者于2019年曾在山東省大菱鲆主產(chǎn)區(qū)分離到自然感染致病的副乳房鏈球菌菌株。結(jié)合項(xiàng)目組的研究及國(guó)內(nèi)外有關(guān)副乳房鏈球菌的研究概況，本研究中主要從副乳房鏈球菌的病原學(xué)、流行病學(xué)與臨床癥狀、致病機(jī)制、檢測(cè)方法、耐藥性、疾病防治等方面進(jìn)行綜述，并對(duì)未來(lái)深入開展的研究?jī)?nèi)容進(jìn)行了展望，旨在為養(yǎng)殖生產(chǎn)中魚源副乳房鏈球菌病的防控提供科學(xué)參考。

1 副乳房鏈球菌的病原學(xué)

1.1 病原特征

1)鏈球菌病病原及分類。鏈球菌屬革蘭氏陽(yáng)性球菌，是一類可引起世界范圍海淡水、野生或養(yǎng)殖魚類發(fā)生類似敗血病癥的病原菌[11]。1958年報(bào)道了首例日本養(yǎng)殖虹鱒魚感染鏈球菌[12]，此后眾多魚類感染鏈球菌案例相繼被報(bào)道，鏈球菌病已成為威脅魚類產(chǎn)業(yè)并造成嚴(yán)重?fù)p失的重要疾病。研究表明，鏈球菌病可由鏈球菌屬Streptococcus、乳球菌屬Lactococci和漫游球菌屬Vagococci等革蘭氏陽(yáng)性菌感染引起[13]。魚類鏈球菌病可分為溫水性和冷水性兩大類，其中，鮭漫游球菌Vagococcussalmoninarum、魚乳球菌Lactococcuspiscium、格氏乳球菌L.garvieae、無(wú)乳鏈球菌S.agalactiac、海豚鏈球菌S.iniae和副乳房鏈球菌S.parauberis等至少6種病原菌均可引起溫水性鏈球菌病[8]。溫水性鏈球菌病可表現(xiàn)出相似的癥狀和臨床特征，僅通過表觀癥狀無(wú)法準(zhǔn)確區(qū)分病原，且溫水性鏈球菌是潛在的人畜共患病原菌，目前尚未有研究證實(shí)人源感染的菌株源于畜禽，故研究溫水性鏈球菌對(duì)鏈球菌病本身及人畜共患病的防治意義重大。

2)副乳房鏈球菌的形態(tài)及生化特征。副乳房鏈球菌隸屬于芽孢桿菌綱Bacilli乳桿菌目Lactobacillales鏈球菌科Streptococcaceae鏈球菌屬Streptococcus，是一類兼性厭氧的革蘭氏陽(yáng)性菌，呈球形，直徑為0.2～0.8 μm，具莢膜，無(wú)鞭毛，鏡檢呈短鏈狀排列；在BHI平板中菌落形態(tài)為圓形、乳白色，菌落光滑、濕潤(rùn)、邊緣清晰，直徑約為1.2 mm(圖1A、圖2)；該菌能在含4% NaCl培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，在含6.5% NaCl培養(yǎng)基或pH 9.6環(huán)境下不能生長(zhǎng)，能利用果糖、半乳糖、麥芽糖、葡萄糖、核糖、蔗糖等產(chǎn)酸，不能利用肌醇、鼠李糖、山梨糖等，可水解七葉靈，VP試驗(yàn)呈陽(yáng)性[2]。因其與乳房鏈球菌的相似性，拉丁名以para-為前綴，加上乳房鏈球菌的種名uberis，定名為副乳房鏈球菌S.parauberis。Williams等[2]最初對(duì)其血平板溶血特性的描述為弱的α溶血或不溶血，但后續(xù)關(guān)于副乳房鏈球菌溶血特性的報(bào)道多為α溶血[8-9,13-14]，筆者分離到的山東地區(qū)魚源菌株表現(xiàn)為不溶血[15](圖1B)。Nho等[7]從具有典型鏈球菌癥狀患病牙鲆中分離到的副乳房鏈球菌菌株為α溶血，但回歸感染后再次分離的菌株則不溶血。有研究表明，海豚鏈球菌中的溶血特性與基礎(chǔ)培養(yǎng)基及血平板中添加的血液類型有關(guān)[16]。海豚鏈球菌在添加5%牛血或人血的平板中呈α溶血，而在添加羊血的平板中則呈β溶血；在3%馬血心浸液平板中呈β溶血，而在添加同種同等比例血液的Todd-Hewitt平板中則呈α溶血[17]。

A—BHI培養(yǎng)基中菌落形態(tài)；B—5%羊血培養(yǎng)基中菌落形態(tài)。A—colony morphology cultured with BHI culture medium； B—colony morphology cultured with 5% sheep blood plate.圖1 副乳房鏈球菌在培養(yǎng)基中的形態(tài)[15]Fig.1 Colony morphology of Streptococcus parauberis in culture medium[15]

圖2 副乳房鏈球菌的革蘭氏染色形態(tài)[15]Fig.2 Micro-morphology of Streptococcus parauberis staining with Gram[15]

1.2 分子血清型

1)血清型分型。有學(xué)者基于莢膜多糖結(jié)構(gòu)和糖苷鍵將日本牙鲆源副乳房鏈球菌血清型分為Ⅰ型、Ⅱ型和未分型(non-typed, NT)3種類型[18-20]，未分型是指與血清型Ⅰ或Ⅱ抗體均發(fā)生凝集反應(yīng)的血清型，其中，血清型Ⅰ又可分為Ⅰa、Ⅰb、Ⅰc 3種亞型[21]。血清型Ⅰ和Ⅱ可通過Tu等[22]基于多糖聚合酶(polysaccharide polymerase gen)基因WZY設(shè)計(jì)的引物有效鑒別，其中，Ⅰa型可擴(kuò)增獲得213 bp產(chǎn)物，Ⅰb/Ⅰc型可擴(kuò)增出303 bp產(chǎn)物，Ⅱ型可擴(kuò)增出413 bp產(chǎn)物。然而，Yolanda等[20]用基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時(shí)間質(zhì)譜法(matrix-assisted laser desorption Ionization-time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS)對(duì)不同來(lái)源副乳房鏈球菌血清型研究時(shí)，檢測(cè)到大菱鲆源的副乳房鏈球菌存在不同于牙鲆源和牛源菌株的特異性質(zhì)量峰，結(jié)合重復(fù)序列PCR(repetitive sequence-based PCR, Rep-PCR)、特異性蛋白生物標(biāo)記物等結(jié)果，認(rèn)為除了上述3種分型外，大菱鲆源菌株屬于新的血清型Ⅲ，并且可通過擴(kuò)增莢膜多糖基因(130 bp)與其他血清型加以辨別[23]。

2)血清型毒力。不同血清型的副乳房鏈球菌毒力表現(xiàn)不同。在同一條件下，僅血清型Ⅲ及Ⅰ菌株能感染大菱鲆發(fā)病，其中，血清型Ⅲ菌株(大菱鲆來(lái)源)對(duì)大菱鲆的致病力最強(qiáng)，半致死濃度為103CFU/mL；牙鲆來(lái)源的Ⅰa、Ⅰc血清亞型分離株對(duì)大菱鲆的半致死濃度約為108CFU/mL，牙鲆來(lái)源的Ⅰb血清亞型分離株對(duì)大菱鲆的半致死濃度超過1010CFU/mL[20]。韓國(guó)牙鲆源分離株血清型Ⅰ毒力較強(qiáng)，平均凝集滴度、累計(jì)死亡率均高于Ⅱ型，對(duì)牙鲆的半致死濃度分別為107、108CFU/mL[24]。此外，用105CFU/mL條紋鱸源副乳房鏈球菌感染斑馬魚Daniorerio，不能導(dǎo)致其致病，剖解其脾臟組織，并不能分離到病原菌[14]，提示不同來(lái)源的分離株可能存在一定的宿主特異性。

2 副乳房鏈球菌流行病學(xué)與臨床癥狀

2.1 流行病學(xué)

已有報(bào)道顯示，副乳房鏈球菌可以感染10余種魚類致病(表1)。近年來(lái)，副乳房鏈球菌病在西班牙[3]、日本[9]、韓國(guó)[4]、美國(guó)、以色列、南非等多個(gè)國(guó)家和地區(qū)的魚類養(yǎng)殖場(chǎng)中暴發(fā)流行[8]，此外，也有野生魚類檢出該菌的報(bào)道[14]。在牙鲆的細(xì)菌性病害中，副乳房鏈球菌是引起鏈球菌病并導(dǎo)致牙鲆急性死亡的最主要病原[25]，死亡率超過70%[26]。水溫是鏈球菌病暴發(fā)的最主要誘因[27]，Won等[28]報(bào)道，牙鲆26 ℃時(shí)注射副乳房鏈球菌的死亡率遠(yuǎn)高于22 ℃，23～24 ℃水溫下副乳房鏈球菌感染牙鲆的半致死濃度為4.5×103CFU/mL[29]，而Hwang[30]報(bào)道的21 ℃時(shí)副乳房鏈球菌不同株感染牙鲆的半致死濃度為107～109CFU/mL，低于20 ℃時(shí)的預(yù)試驗(yàn)中并未導(dǎo)致牙鲆致病[31]。盡管不同來(lái)源菌株的半致死濃度存在差異，但溫度仍是影響副乳房鏈球菌病發(fā)生、流行的主要因素。副乳房鏈球菌的致病分為急性感染和慢性感染兩種，急性感染3～7 d內(nèi)死亡率超過50%，慢性感染數(shù)周內(nèi)只有少量死亡[10]。筆者分離到副乳房鏈球菌的季節(jié)是7月，水溫為19 ℃，10日內(nèi)患病個(gè)體死亡率約為75%。從患病個(gè)體肝、腎、脾等內(nèi)臟分離出副乳房鏈球菌，且回歸感染出現(xiàn)與自然感染發(fā)病相似的病征。此外，體表潰瘍處也分離出羅氏假單胞菌、腐生葡萄球菌等繼發(fā)感染的條件致病菌。

表1 部分魚類感染副乳房鏈球菌的報(bào)道Tab.1 Infection report of Streptococcus parauberis in fish

2.2 臨床癥狀

副乳房鏈球菌感染后表現(xiàn)為鏈球菌病的典型臨床癥狀，病魚一般出現(xiàn)食欲減退、不規(guī)則游動(dòng)、體表發(fā)黑(圖3C1)、眼球突出(圖3A1)、敗血性出血(內(nèi)出血或兼有外源性出血，圖3B1、A2、B2)、腹水腹脹(圖3A3)、脾臟腎臟腫脹、內(nèi)臟出血等癥狀[3,28-29,31]。組織病理變化主要表現(xiàn)在心臟和腦：心肌纖維被炎癥細(xì)胞取代，單核淋巴細(xì)胞樣細(xì)胞伴有結(jié)締組織擴(kuò)張和心肌細(xì)胞缺失，腦組織呈現(xiàn)嚴(yán)重的單核浸潤(rùn)和濃縮[29](圖4)，肝、腎、肌肉組織亦出現(xiàn)了不同程度的巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)[36]。筆者分離到副乳房鏈球菌感染的自然發(fā)病大菱鲆，表現(xiàn)為眼球突出、下頜紅腫，剖解發(fā)現(xiàn)其肝臟出血、脾臟腫大、腸道無(wú)食物或充滿淡黃色積液。回歸感染發(fā)現(xiàn)，不同濃度組個(gè)體反應(yīng)不甚相同[15]：注射菌液濃度為6.3×109～6.3×1010CFU/mL時(shí)，受試魚死亡率較高，14 d內(nèi)累計(jì)死亡率超過90%，多數(shù)表現(xiàn)出腹部膨大紅腫、腸壁稀薄透明狀、脾臟腫大等急性感染臨床癥狀，也有癥狀不明顯的急性死亡病例；而6.3×107～6.3×108CFU/mL濃度組則多表現(xiàn)出眼球突出、肌肉點(diǎn)狀出血、內(nèi)臟充血出血等慢性癥狀。

Kim等[29]應(yīng)用熒光定量PCR監(jiān)測(cè)副乳房鏈球菌感染牙鲆后主要攻擊靶器官時(shí)，發(fā)現(xiàn)感染后第3天、第7天時(shí)，心臟及腦組織中細(xì)菌拷貝數(shù)最高，脾、腎、腸、肌肉等組織細(xì)菌拷貝數(shù)依次降低。該研究結(jié)果表明：感染后腦組織和心臟中細(xì)菌拷貝數(shù) 量最大，且組織出現(xiàn)明顯病變，二者是副乳房鏈球菌感染的主要靶器官；感染后7 d內(nèi)，細(xì)菌定植以心、腦為主逐漸變?yōu)槿硐到y(tǒng)感染；在感染初期，脾臟中細(xì)菌增殖快，是初期的最佳取樣組織。

3 副乳房鏈球菌的致病機(jī)制

鏈球菌的毒力因子一般分為孔毒素、促進(jìn)免疫逃避因子、黏附因子等幾大類[37]。有研究表明，鏈球菌的致病力取決于細(xì)菌在宿主免疫細(xì)胞中的存活及避免被宿主細(xì)胞殺死而建立感染，以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力[38]。已有研究表明，某些毒力基因在海豚鏈球菌[39]、無(wú)乳鏈球菌[40]等細(xì)菌致病力方面發(fā)揮了重要作用，對(duì)菌株致病力強(qiáng)弱的判斷可以通過檢測(cè)其毒力因子加以辨別，而副乳房鏈球菌的相關(guān)研究報(bào)道較少，其致病機(jī)理與毒力基因關(guān)聯(lián)度有待進(jìn)一步研究。筆者結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)副乳房鏈球菌分離株毒力基因攜帶情況，歸納總結(jié)了幾種毒力因子的研究進(jìn)展。

A1—患病虹鱒眼球突出；B1—患病虹鱒出血；C1—患病虹鱒體色發(fā)黑；A2—患病牙鲆眼及胸鰭出血；B2—患病牙鲆下頜充血發(fā)紅；A3、B3—患病大菱鲆腹部膨大。A1—exophthalmos of rainbow trout；B1—hemorrhage of rainbow trout；C1—darkening of the skin of rainbow trout；A2—hemorrhage of eyes and pectoral fin in olive flounder；B2—red swelling and congestion of jaw in olive flounder; A3 and B3—abdominal distension in turbot.圖3 虹鱒[8]、牙鲆[27]、大菱鲆副乳房鏈球菌感染典型癥狀Fig.3 Typical symptoms of Streptococcus parauberis infection in rainbow trout Oncorhynchus mykiss[8], olive flounder Paralichy solivaceus[27] and turbot Scophthalmus maximus

3.1 莢膜多糖

莢膜是位于某些細(xì)菌細(xì)胞壁表面，包圍整個(gè)菌體的特殊結(jié)構(gòu)[41-42]，因其具有抗原性，在血清型分型系統(tǒng)中可作為細(xì)菌鑒定的依據(jù)[43]。El Aamri等[44]認(rèn)為，鏈球菌的莢膜在逃避宿主吞噬細(xì)胞的吞噬作用中起到了關(guān)鍵作用。副乳房鏈球菌亦不例外，其莢膜結(jié)構(gòu)與抗血清殺傷活性、抗巨噬細(xì)胞吞噬能力直接相關(guān)[30]。此外，這些莢膜結(jié)構(gòu)可抑制補(bǔ)體或抗體結(jié)合在細(xì)菌表面[45]。鏈球菌不同菌株有無(wú)莢膜導(dǎo)致毒力不同，有莢膜層的細(xì)菌類型毒力普遍高于無(wú)莢膜層的細(xì)菌類型，如格氏乳球菌KG-型(有莢膜層)毒力強(qiáng)于KG+型(無(wú)莢膜層)[25,37]；海豚鏈球菌有莢膜的K+型菌株可感染牙鲆致病，而無(wú)莢膜的K-血清型則對(duì)牙鲆不具致病性[18]。

A—正常心臟組織切片；B—人工感染第7天時(shí)的心臟組織切片，箭頭處示炎癥區(qū)細(xì)胞浸潤(rùn)灶；C—正常腦組織切片；D—人工感染第7天時(shí)的腦組織，箭頭處示炎癥區(qū)細(xì)胞浸潤(rùn)灶。A—normal heart tissue；B—infected heart tissue sampled 7 days post challenge，the arrow shows several small foci of celluar infiltrations in the inflammatory region；C—normal brain issue；D—infected brain tissue sampled 7 days post challenge，and the arrow shows several small foci of cellular infiltration.圖4 牙鲆副乳房鏈球菌感染后心、腦組織切片圖[29]Fig.4 Histopathological changes of the heart and brain after infection (H.E staining) in olive flounder Paralichys olivaceus[29]

鏈球菌的莢膜成分主要為莢膜多糖(polysaccharide capsules，CPS)[38]，作為細(xì)菌的毒力因子，其結(jié)構(gòu)差異對(duì)致病力至關(guān)重要，并在宿主免疫系統(tǒng)的逃逸、抗血清吸附、炎癥及生物膜形成等方面發(fā)揮著重要作用[46-48]，負(fù)責(zé)合成莢膜多糖的基因通常為聚集在染色體dexB和aliA間的一個(gè)完整轉(zhuǎn)錄單位[21]。革蘭氏陽(yáng)性菌莢膜多糖普遍存在一種特殊的盒裝基因簇結(jié)構(gòu)[49]，即特異性基因位于中間區(qū)域，兩側(cè)是血清型高度同源的保守序列[50]。在研究副乳房鏈球菌不同血清型莢膜多糖結(jié)構(gòu)時(shí)發(fā)現(xiàn)，其盒狀基因簇結(jié)構(gòu)由如下基因組成：在CPS保守區(qū)域的5′端，有一組包括lysR、cpsA、cpsB、cpsC和cpsD在內(nèi)的5個(gè)調(diào)控基因，以及1個(gè)加工基因cpsE；在保守區(qū)域3′端有1個(gè)調(diào)控基因cpsQ和1個(gè)假設(shè)基因cpsR；CPS位點(diǎn)的中間可變區(qū)則包括糖基轉(zhuǎn)移酶、乙酰轉(zhuǎn)移酶、氨基轉(zhuǎn)移酶等酶編碼基因[20](圖5)。應(yīng)用莢膜多糖的結(jié)構(gòu)差異可對(duì)副乳房鏈球菌不同血清型進(jìn)行鑒別，其中，血清型Ⅰ與Ⅱ盒裝基因簇結(jié)構(gòu)相似度最高，Ⅰb與Ⅰc亞型因結(jié)構(gòu)相同無(wú)法通過該基因結(jié)構(gòu)差異有效區(qū)分[23]。

黑色區(qū)域?yàn)榍v膜多糖保守區(qū)基因；灰色區(qū)域?yàn)榇嬖谟趦蓚€(gè)或兩個(gè)以上血清型中的基因；白色區(qū)域?yàn)榭勺儏^(qū)基因。Conserved regions of the cps locus of S.parauberis are shown in black color,genes in two or more serotypes are shown in gray color, and serotype-specific regions are shown in white.圖5 副乳房鏈球菌不同血清型莢膜多糖基因結(jié)構(gòu)示意圖[24]Fig.5 Structure of loci cps gene of Streptococcus parauberis[24]

3.2 免疫相關(guān)蛋白

表面免疫原性蛋白(surface immunogenic protein，sip)是暴露于菌體表面的一類免疫相關(guān)蛋白，與細(xì)菌在宿主體內(nèi)的黏附、定植有關(guān)[51]。最初是由Brodeur等[52]對(duì)人源無(wú)乳鏈球菌基因文庫(kù)免疫學(xué)篩選時(shí)發(fā)現(xiàn)并命名。該蛋白存在于不同無(wú)乳鏈球菌血清型代表菌株中，且在對(duì)不同血清型致死劑量攻擊的多種動(dòng)物模型研究中均有較好的交叉免疫保護(hù)作用[53-54]，因此，被列為研究無(wú)乳鏈球菌疫苗的良好候選靶抗原[55]。該基因具有高度的保守性，在147株牛源無(wú)乳鏈球菌中，僅發(fā)現(xiàn)4株LysM基因缺失[56]；18株中國(guó)牛源分離株sip基因序列與另外13條GenBank下載序列間的核苷酸同源性在97.8%以上[57]。

某些鏈球菌細(xì)胞表面可產(chǎn)生免疫原性黏附蛋白(GBS immunogenic bacterial adhesion)基因bibA，以促進(jìn)其在宿主細(xì)胞表面的吸附[58]，且通過補(bǔ)體抑制劑C4b結(jié)合蛋白，對(duì)抵抗機(jī)體吞噬及毒理作用發(fā)揮具有關(guān)鍵作用，是一類新的革蘭氏陽(yáng)性表面黏附素[59]，缺失bibA基因的菌株存活及抗吞噬作用明顯降低[60-61]。

3.3 酶

透明質(zhì)酸酶(hyaluronidase，hyl)屬堿性糖蛋白類蛋白水解酶，可以特異性分解細(xì)胞外基質(zhì)透明質(zhì)酸(hyaluronidase acid)，為細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖提供必需的能量并協(xié)助細(xì)菌在組織中散播[62-63]，是細(xì)菌致病的重要毒力因子之一，又稱擴(kuò)散因子，尤其在鏈球菌等革蘭氏陽(yáng)性菌致病機(jī)制中發(fā)揮了重要作用[64]。研究表明，透明質(zhì)酸酶B(hylB)作為無(wú)乳鏈球菌重要的毒力因子之一，是破壞血腦屏障誘發(fā)魚源感染的重要因子[65]，且不同來(lái)源的無(wú)乳鏈球菌hylB基因具有高度的保守性，通過對(duì)其蛋白表達(dá)及抗原性分析可為疫苗研制提供良好基礎(chǔ)[66]。

超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)是一類能夠催化超氧離子通過歧化反應(yīng)轉(zhuǎn)化為氧氣和過氧化氫的酶，其作為重要的抗氧化劑廣泛存在于動(dòng)植物與微生物中[67]。細(xì)菌中的SOD主要作用是中和超氧離子，從而抵御宿主活性物質(zhì)的損害以達(dá)到在宿主體內(nèi)存活、繁殖并感染宿主的目的[68]。

筆者曾檢測(cè)到山東大菱鲆源副乳房鏈球菌分離株攜帶sip、bibA、hylB等酶和免疫相關(guān)蛋白類毒力基因[15]，而SodA基因則是副乳房鏈球菌特異性檢測(cè)的首選基因。由于副乳房鏈球菌毒力基因相關(guān)的研究報(bào)道較少，筆者結(jié)合自主分離株毒力基因攜帶情況闡述了上述基因在鏈球菌屬其他菌種毒力發(fā)揮中的重要作用，鑒于其相對(duì)保守性及在其他致病菌疫苗研發(fā)方面的應(yīng)用[51,60,69]，研究者對(duì)副乳房鏈球菌上述毒力基因開展深入研究，將會(huì)為副乳房鏈球菌致病機(jī)制研究、基因疫苗的篩選與研發(fā)提供科學(xué)參考。

4 副乳房鏈球菌的檢測(cè)方法

細(xì)菌的快速鑒定及準(zhǔn)確分型對(duì)于分離株親緣關(guān)系評(píng)估及病害防控均具有重要意義[20]。常規(guī)細(xì)菌鑒定技術(shù)是臨床實(shí)驗(yàn)室對(duì)病原菌檢測(cè)的最常用方法，主要包括分離培養(yǎng)、菌落特征觀察、顯微觀察及生理生化測(cè)試等。對(duì)鏈球菌而言，該方法僅能初步確定檢測(cè)目標(biāo)，較難準(zhǔn)確鑒別到種屬水平[70-71]。商業(yè)化的鑒定系統(tǒng)由于種種缺陷亦難準(zhǔn)確鑒別，對(duì)鏈球菌鑒定置信區(qū)間僅為79%～100%[14]，尤其對(duì)副乳房鏈球菌的鑒別更有待商榷[13-14,72]。鑒于此，基于PCR技術(shù)的分子鑒定被廣泛應(yīng)用，已成為檢測(cè)、鑒定細(xì)菌病原體的最常用技術(shù)。

4.1 生理生化特征檢測(cè)技術(shù)

副乳房鏈球菌與乳房鏈球菌在生理生化、血清學(xué)等方面相似度較高，較難基于上述指標(biāo)對(duì)二者有效區(qū)分[2]。Watts等[73]曾提出將β-葡萄糖醛酸苷酶作為區(qū)分二者的生化指標(biāo)，但有學(xué)者對(duì)乳房鏈球菌、副乳房鏈球菌模式株及24株乳房鏈球菌疑似株進(jìn)行鑒定時(shí)，發(fā)現(xiàn)上述菌株該指標(biāo)的測(cè)試結(jié)果確有不同，但在限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)中進(jìn)一步證實(shí)，乳房鏈球菌不同株產(chǎn)β-葡萄糖醛酸苷酶的結(jié)果存在差異，并不能將其作為鑒別依據(jù)[74]。副乳房鏈球菌、海豚鏈球菌、無(wú)乳鏈球菌部分生理生化特征見表2。

表2 副乳房鏈球菌、海豚鏈球菌、無(wú)乳鏈球菌生理生化特征Tab.2 Physiological and biochemical characteristics of Streptococcus parauberis, S.agalactiac and S.iniae

4.2 基因檢測(cè)技術(shù)

PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)了DNA預(yù)選區(qū)域擴(kuò)增，直觀呈現(xiàn)了分子水平差異，成為檢測(cè)病原菌最常用的工具。16S rRNA是細(xì)菌鑒定最常用的基因[1,39]，Bentley等[75-76]認(rèn)為，根據(jù)16S rRNA V2區(qū)序列變異可實(shí)現(xiàn)鏈球菌屬31種病原菌的有效鑒別，包括乳房鏈球菌和副乳房鏈球菌。Hassan等[1]根據(jù)16S-23S rRNA特異性區(qū)域及間隔區(qū)構(gòu)建的引物，擴(kuò)增乳房鏈球菌和副乳房鏈球菌分別得到445、884 bp產(chǎn)物。目前，用于鑒定副乳房鏈球菌的候選基因主要有23S rRNA(Spa2152/Spa2870)[13]、乳酸氧化酶lctO(LOX-1/LOX-2)[13]、伴侶蛋白HSP 60(cpn60F/cpn60R)[15]、超氧化物歧化酶A(SodAF/SodAR)[15]等，常規(guī)PCR檢測(cè)靈敏度一般為1 pg，熒光定量PCR靈敏度為0.1 pg[77]。Kitao[33]基于23S rRNA、16S rRNA、gyrB設(shè)計(jì)了多重PCR，可檢測(cè)褐牙鲆3種重要的病原菌——副乳房鏈球菌、海豚鏈球菌、遲緩愛德華氏菌，分別得到718、300、415 bp的產(chǎn)物，最高檢出限靈敏度為1 ng。Nguyen等[78]以gyrB基因序列為靶點(diǎn)，采用TaqMan探針法開發(fā)了副乳房鏈球菌的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，該方法靈敏度高、變異系數(shù)低，與親緣關(guān)系較近的海豚鏈球菌亦無(wú)交叉反應(yīng)，可用于副乳房鏈球菌的定量檢測(cè)。

4.3 全基因組測(cè)序技術(shù)

通過對(duì)細(xì)菌全基因組DNA測(cè)序、拼接、組裝，可以獲得完整的基因組信息。該技術(shù)成本較高，但獲得的生物信息為深入挖掘基因功能，以及致病機(jī)制與免疫機(jī)制研究提供了可能[81]。Liu等[82]獲得了牛源副乳房鏈球菌株SP-llh全基因組序列，包含2 522 235 bp堿基及2 620個(gè)編碼蛋白的基因。Lee等[4]獲得了牙鲆源多重耐藥副乳房鏈球菌株SPOF3K的全基因組序列，該序列包含2 128 740 bp的圓形染色體及23 538 bp質(zhì)粒，分別包含2 123和24個(gè)編碼蛋白的基因。Halnes等[83]測(cè)定了7株野生條紋鱸魚源副乳房鏈球菌全基因組序列信息，片段長(zhǎng)度為1 999 273～2 031 135 bp，編碼蛋白的基因數(shù)為1 972～2 057，G+C含量為35.5%～39.0%。

5 副乳房鏈球菌的耐藥性

5.1 藥物敏感性

目前，對(duì)鏈球菌的防治主要以抗菌藥物為主，病原菌對(duì)抗菌藥物的耐受程度直接決定了藥物防治效果，而抗菌藥物的頻繁使用又增加了病原菌對(duì)該藥物或同類藥物的耐藥性。近年來(lái)，眾多學(xué)者對(duì)不同國(guó)家或地區(qū)分離到的魚源副乳房鏈球菌株開展了耐藥性測(cè)試。研究表明，韓國(guó)牙鲆源分離株對(duì)氨芐西林、阿莫西林、多西環(huán)素、復(fù)方新諾明、土霉素、慶大霉素、紅霉素等藥物存在多重耐藥[4]；土耳其虹鱒源分離株對(duì)依諾沙星、土霉素和氯霉素耐藥，對(duì)多西環(huán)素、氟苯尼考、恩諾沙星、萬(wàn)古霉素、紅霉素、青霉素敏感[8]；美國(guó)野生條紋鱸魚源分離株對(duì)復(fù)方新諾明耐藥，對(duì)磺胺類藥物普遍中介，對(duì)四環(huán)素、萬(wàn)古霉素、紅霉素、青霉素敏感[14]。不同分離株對(duì)藥物的耐受程度與該地區(qū)抗生素類藥物的使用頻率與使用量有關(guān)，分離株的耐藥表現(xiàn)提示，在該病的藥物防治中應(yīng)更加科學(xué)且和針對(duì)性，謹(jǐn)防多重耐藥加劇。此外，多數(shù)副乳房鏈球菌分離株對(duì)青霉素敏感，證實(shí)了Cameron等[84]關(guān)于環(huán)境鏈球菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類藥物敏感的論斷。

5.2 耐藥基因檢測(cè)

細(xì)菌耐藥基因檢測(cè)是研究細(xì)菌耐藥機(jī)制的重要手段。Zhang等[85]報(bào)道了16株乳房鏈球菌和11株副乳房鏈球菌對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類(mefA、ermA、ermB、ermC)、四環(huán)素類(tetO、tetL、tetM、tetK、tetS)、氨基糖苷類(aacA-aphD)、β-內(nèi)酰胺類(blaZ)、黏附分子(sua)、纖維酶原激活物(pauA/skc)、表面脫氫酶(gapC)、乳鐵蛋白結(jié)合蛋白(lbp)、CAMP因子(cfu)和透明質(zhì)酸酶(hasA、hasB、hasC)等10類耐藥基因及毒力相關(guān)基因的攜帶情況。藥物敏感性檢測(cè)結(jié)果對(duì)比發(fā)現(xiàn)，盡管90.9%的副乳房鏈球菌分離株對(duì)紅霉素耐藥，但其耐藥基因ermB的攜帶率僅為27.3%，耐藥表現(xiàn)與耐藥基因檢測(cè)結(jié)果不完全一致，這種差異可能與耐藥機(jī)制有關(guān)。鏈球菌耐藥性的產(chǎn)生主要有兩種機(jī)制，即耐藥質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移或核糖體的保護(hù)[77]，上述差異可能與抗生素物質(zhì)的外排或核糖體差異有關(guān)[86]。

6 副乳房鏈球菌的其他防治措施

6.1 疫苗

疫苗不僅是防控養(yǎng)殖動(dòng)物發(fā)病的有效途徑，也是保障水產(chǎn)品質(zhì)量及環(huán)境安全的重要途徑之一。魚源副乳房鏈球菌疫苗主要是全細(xì)胞滅活疫苗，傳統(tǒng)福爾馬林滅活全細(xì)胞疫苗免疫保護(hù)作用明顯[87-88]，相對(duì)免疫保護(hù)率可達(dá)100%。但添加聚D,L-丙交酯-羥基乙酸(PLGA)包埋后的滅活疫苗效力更長(zhǎng)，免疫保護(hù)率更高，且成本較低，適應(yīng)性免疫應(yīng)答和免疫持續(xù)時(shí)間是該類疫苗商業(yè)化應(yīng)用前的研究方向之一[89]。副乳房鏈球菌疫苗的接種方式一般為腹腔注射[90]，盡管口服方式可以消除注射方式勞動(dòng)量大、對(duì)魚體有應(yīng)激或損傷等弊端，更適用于水生動(dòng)物，但該方式受攝食行為、養(yǎng)殖環(huán)境影響較大。Kim等[91]采用海藻酸鹽離子凝膠包埋法制作了福爾馬林滅活口服疫苗，對(duì)牙鲆幼魚免疫保護(hù)率更高，適用于仔魚階段免疫。此外，有研究團(tuán)隊(duì)對(duì)副乳房鏈球菌聯(lián)合疫苗開展了相關(guān)研究，如海豚鏈球菌與副乳房鏈球菌血清型Ⅰ、Ⅱ[92]，遲緩愛德華氏菌、海豚鏈球菌與副乳房鏈球菌[93]，遲緩愛德華氏菌運(yùn)動(dòng)與非運(yùn)動(dòng)型、海豚鏈球菌、副乳房鏈球菌不同血清型[94]等三聯(lián)、五聯(lián)疫苗，均對(duì)此類細(xì)菌病有一定的免疫保護(hù)作用。

6.1 噬菌體

噬菌體是一類細(xì)菌性病毒，專以細(xì)菌為宿主，能引起宿主菌的裂解，從而達(dá)到抗菌效果，被認(rèn)為是極具潛力的抗生素替代品。與傳統(tǒng)抗生素相比，噬菌體具有專一性強(qiáng)、可自我復(fù)制增殖、來(lái)源豐富、篩選方便等優(yōu)勢(shì)，無(wú)論宿主菌藥物敏感性如何，噬菌體均可感染并殺死宿主菌，是治療細(xì)菌感染的新選擇。自20世紀(jì)80年代學(xué)者證實(shí)了噬菌體的體外殺菌作用后，噬菌體陸續(xù)在黃條鰤格乳球菌病、香魚冷水病、大西洋鮭殺鮭氣單胞菌病、斑節(jié)對(duì)蝦發(fā)光病、刺參弧菌病等細(xì)菌感染中嘗試應(yīng)用[95]。Kwon等[96]對(duì)一株副乳房鏈球菌噬菌體進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)該噬菌體對(duì)副乳房鏈球菌專一性較高，在55株測(cè)試菌株中，63.6%對(duì)該噬菌體敏感，無(wú)論采樣分離季節(jié)和菌株耐藥性如何，均能有效降低副乳房鏈球菌感染發(fā)病率，并在一定程度上提高水產(chǎn)動(dòng)物生長(zhǎng)性能，是一種環(huán)境友好型抗生素替代品。

7 存在問題及展望

副乳房鏈球菌是一種分布廣、致病力強(qiáng)、危害嚴(yán)重的細(xì)菌性病原。盡管中國(guó)魚源副乳房鏈球菌病并未大面積暴發(fā)流行，但該病曾給日韓等亞洲國(guó)家魚類養(yǎng)殖造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失，對(duì)其開展深入研究對(duì)中國(guó)該病的防控具有重要意義。近年來(lái)，雖然國(guó)外眾多學(xué)者對(duì)其開展過深入研究，但其流行病學(xué)、傳播途徑、致病機(jī)制、分子分型等內(nèi)容尚不明確、行之有效的防控措施亦未完全建立。未來(lái)可在以下幾方面重點(diǎn)開展深入研究。

1)加強(qiáng)流行病學(xué)研究。要從源頭解決副乳房鏈球菌對(duì)魚類的影響，必須加強(qiáng)對(duì)其流行病學(xué)的研究。該菌既能感染牛引發(fā)乳房炎，又能感染魚類引發(fā)鏈球菌病，盡管牛源與魚源分離株分子差異已有報(bào)道，但不同來(lái)源菌株間的遺傳進(jìn)化關(guān)系、流行傳播規(guī)律尚待進(jìn)一步研究，魚類菌株是否來(lái)源于牛源，菌株是否存在跨種傳播亦需明確。鏈球菌病屬中國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖三類疫病，探明其流行、發(fā)生規(guī)律，對(duì)由該菌引起的鏈球菌病防治將起到有效預(yù)警。

2)重點(diǎn)開展致病機(jī)制研究。目前，副乳房鏈球菌的毒力基因相關(guān)研究鮮有報(bào)道，致病機(jī)制尚待進(jìn)一步明確，開展此方面的研究對(duì)鏈球菌病防控具有重要意義。與鏈球菌屬其他致病菌相似，副乳房鏈球菌感染可能是由細(xì)菌突破血腦屏障或單核、巨噬細(xì)胞攜帶入血或進(jìn)入神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)而誘發(fā)，但其感染模式與致病機(jī)制尚未明確；基于莢膜多糖結(jié)構(gòu)差異可將副乳房鏈球菌分為不同血清型，除物種來(lái)源外，魚源亦可細(xì)分，莢膜多糖已被證實(shí)是其重要的毒力因子，目前亟需確認(rèn)其他毒力因子，為深入研究其致病機(jī)制、探求基于分子生物學(xué)的有效防控策略奠定基礎(chǔ)。

3)科學(xué)篩選防治藥物。目前，藥物仍然是副乳房鏈球菌病防控的主要手段，但抗生素類藥物的大量使用不僅對(duì)環(huán)境造成不利影響，還會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌耐藥甚至產(chǎn)生多重耐藥。不同國(guó)家的副乳房鏈球菌分離株已出現(xiàn)了一定程度的耐藥，如何科學(xué)篩選敏感藥物、避免多重耐藥，尋求抗生素替代物尚需試驗(yàn)研究。在山東省大菱鲆養(yǎng)殖中，已有企業(yè)嘗試無(wú)抗化養(yǎng)殖模式，該模式通過提高水質(zhì)、控制密度、加強(qiáng)管理、特殊時(shí)期密切防控等手段控制零抗生素添加，從源頭解決了抗生素使用的問題，在一定范圍內(nèi)可復(fù)制推廣。

4)加大疫苗研發(fā)力度。鏈球菌疫苗研發(fā)具有一定基礎(chǔ)，但臨床效果有待進(jìn)一步驗(yàn)證，當(dāng)前階段，研發(fā)安全高效的副乳房鏈球菌疫苗，是防控該病的重要手段。目前，疫苗在日本牙鲆源副乳房鏈球菌病的防控中取得了一定的效果，但疫苗的免疫保護(hù)率不能覆蓋整個(gè)魚類養(yǎng)殖周期，且常規(guī)腹腔注射勞動(dòng)量大、易造成損傷或應(yīng)激，因此，亟需加強(qiáng)口服或浸泡疫苗的研制。DNA疫苗是未來(lái)疫苗研制的方向，但在環(huán)境選擇壓力下，人工干預(yù)株是否存在傳播或突變可能仍需進(jìn)一步研究。