胡玲紅，王映，王化敏，陳良標,3*

(1.海洋生物科學國際聯(lián)合研究中心，上海 201306；2.水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點實驗室，上海 201306；3.上海海洋大學 水產(chǎn)科學國家級實驗教學示范中心，上海 201306)

魚類是一種水生變溫脊椎動物，水溫變化與魚類的生存息息相關(guān)，魚類生存的環(huán)境溫度是影響魚類代謝、發(fā)育、生長等生理活動最重要的非生物因素[1]。魚類有其適宜的生存溫度范圍，過高或過低都會破壞魚類機體的穩(wěn)態(tài)，并使魚類產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)以重新建立穩(wěn)態(tài)，但持續(xù)的應(yīng)激狀態(tài)會使機體的防御系統(tǒng)遭到破壞，最終導致魚類死亡[2-3]。

鰓是魚類的主要呼吸器官，具有氣體交換、離子平衡、調(diào)節(jié)滲透壓等功能。有研究表明，魚鰓在魚類響應(yīng)環(huán)境的變化時具有重要意義[4]。Sollid等[4]研究發(fā)現(xiàn)，歐洲鯽Carassiusauratus在冷應(yīng)激和缺氧條件下鰓的形態(tài)會發(fā)生變化，認為主要是由細胞增殖減少和細胞凋亡誘導造成的[5]。Hu等[6]對斑馬魚Daniorerio和尼羅羅非魚Oreochromisniloticus在8 ℃下低溫脅迫12 h的鰓組織凋亡情況研究發(fā)現(xiàn),在所檢測的8個器官中鰓的凋亡最為明顯，這提示鰓是魚類感知外界變化最敏感的器官。

細胞凋亡是由基因控制的細胞自我消亡過程，對于機體維持穩(wěn)態(tài)和正常生理功能具有重要意義[7]。研究表明，熱應(yīng)激會導致細胞線粒體中過氧化物含量升高，使細胞內(nèi)活性氧(ROS)含量升高，導致細胞產(chǎn)生氧化損傷[8]。斑馬魚卵巢在熱應(yīng)激下能誘導卵母細胞凋亡[9]。銀漢魚Odontesthesbonariensis雄性生殖細胞在熱應(yīng)激下凋亡細胞增加，半光氨酸蛋白酶(caspase)活性達到峰值，最終導致不育[10]。低溫脅迫可能導致ROS增加，當ROS含量超出生物體應(yīng)對這些物質(zhì)的能力時，機體會發(fā)生氧化應(yīng)激[11]。低溫脅迫下,尼羅羅非魚和斑馬魚鰓組織發(fā)生凋亡[12]，斜帶石斑魚Epinepheluscoioides和暗紋東方鲀Takifuguobscurus肝臟凋亡途徑被激活并誘導caspase家族、B淋巴細胞瘤2基因(bcl2)、bax等凋亡基因表達發(fā)生變化[13-14]。

青鳉Oryziaslatipes是一種常見的模式生物魚類[15]，具有體型較小、性別差異明顯、時代周期短、胚胎時期對環(huán)境比較敏感等特性。目前，對于青鳉的研究主要集中在環(huán)境毒理、發(fā)育生長，以及溫度對其攝食和生理變化等方面[16-20]。趙艷民等[17]研究發(fā)現(xiàn)，水中銅含量過高對日本青鳉肝臟組織造成了明顯損傷。林晶等[20]研究發(fā)現(xiàn)，河流汞污染會嚴重影響青鳉的早期生長發(fā)育。王潤萍等[19]研究發(fā)現(xiàn)，高于31 ℃或低于15 ℃的溫度脅迫對青鳉攝食行為和生理變化會產(chǎn)生極大影響。而青鳉在溫度脅迫響應(yīng)方面的研究尚未見報道。本研究團隊Hu等[6]曾發(fā)現(xiàn)，斑馬魚在極限溫度8 ℃脅迫12 h時鰓發(fā)生了明顯的凋亡，但是青鳉在極限溫度脅迫時鰓是否發(fā)生凋亡還未知。本研究中，為探究溫度對鰓凋亡的影響，首先對青鳉的溫度耐受性進行了測定，在低溫和高溫分別選擇兩個溫度點進行脅迫，并通過TUNEL(原位末端標記法)染色法觀察不同溫度脅迫時青鳉鰓組織凋亡情況，再通過流式細胞術(shù)測定不同溫度脅迫下鰓細胞的ROS含量和凋亡率，同時檢測了青鳉鰓的凋亡相關(guān)基因(caspase家族基因、p53、bcl2)在不同溫度脅迫下的表達變化，以期為魚類響應(yīng)溫度脅迫研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗采用日本青鳉HdrR品系，為4月齡性成熟個體，飼養(yǎng)在26 ℃循環(huán)水箱系統(tǒng)中，光暗循環(huán)時間為14 h∶10 h。試驗中涉及的所有動物試驗都遵照上海海洋大學動物實驗委員會的規(guī)定嚴格執(zhí)行。

1.2 方法

1.2.1 青鳉的溫度耐受性試驗 試驗設(shè)3組，1個低溫組(4 ℃)、1個高溫組(40 ℃)和1個常溫(26 ℃)對照組，低溫或高溫組從常溫組26 ℃開始，以1 ℃/h的速度進行梯度降溫或升溫[6]，每組設(shè)置3個平行，每個平行放20尾魚，并置于恒溫培養(yǎng)箱中，每2 h觀察記錄一次魚的死亡情況并計算死亡率，試驗共進行29 h，以試驗魚死亡率達到50%的水溫作為臨界溫度。

1.2.2 鰓組織凋亡及基因表達試驗設(shè)計 試驗設(shè)5組，2個高溫組(35、40 ℃)、2個低溫組(10、4 ℃)和1個常溫(26 ℃)對照組，高溫組或低溫組從26 ℃開始，以1 ℃/h的速度進行梯度升溫或降溫[6]，每組設(shè)置3個平行，每個平行放3尾魚，并置于恒溫培養(yǎng)箱中，脅迫12 h后采樣。

1.2.3 組織切片和TUNEL染色樣本的采集 從脅迫12 h的每一個溫度組各選取同時期性成熟青鳉3尾，用MS-222溶液(Thermo Fisher)麻醉后，立即解剖取其鰓組織并放入體積分數(shù)為4%的多聚甲醛溶液(生工生物工程(上海)股份有限公司)中固定過夜，梯度乙醇脫水后用二甲苯透明1 min，浸蠟3 h后包埋，利用Leica切片機以5 μm厚度對鰓組織進行切片，切片在37 ℃烘片機上過夜。隨后取切片進行TUNEL染色，具體操作參考TUNEL FITC Apoptosis Detection Kit(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)的步驟，將處理好的切片使用 Leica 激光共聚焦顯微鏡進行拍照。

1.2.4 鰓細胞的獲取 從脅迫12 h的每一個溫度組各取3尾青鳉鰓組織，用PBS沖洗，將組織加至含有500 μL膠原酶(1 mg/mL)的1.5 mL離心管中，置入37 ℃培養(yǎng)箱中消化組織30 min。然后用移液槍輕輕吹打分散細胞，用40 μm孔徑的細胞濾網(wǎng)過濾懸濁液。以400g離心10 min并棄上清，加10%的胎牛血清(Gibco)培養(yǎng)基重懸細胞，獲得鰓組織單細胞懸液。

1.2.5 流式細胞術(shù)檢測鰓細胞凋亡 將獲得的鰓組織單細胞懸液用1 mL PBS洗滌，以800 r/min離心5 min，重復洗一次。加入100 μL 1×Binding buffer(上海索萊寶生物科技有限公司)重懸細胞，試驗組均加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI(均為上海索萊寶生物科技有限公司產(chǎn)品)，對照組分別單染、雙染和空白，輕輕混勻。過程中避光，室溫放置10 min，加入500 μL 1×Binding buffer，輕輕混勻，用BD Accuri C6流式細胞儀(美國Becton Dickinson公司)檢測分析。

1.2.6 流式細胞術(shù)檢測鰓細胞ROS 將獲得的鰓組織單細胞懸液置于1.5 mL離心管中，用1 mL PBS洗滌，以800 r/min離心5 min，重復洗一次。用1 mL PBS重懸，之后加入1 μL DCFH-DA (碧云天生物科技有限公司)配成工作液，避光，室溫下放置30 min (隔5 min輕輕混勻一次)，以800 r/min離心5 min去除DCFH-DA 工作液，再用PBS洗滌細胞3次，最后用500 μL PBS重懸細胞，使用BD Accuri C6流式細胞儀進行檢測。

1.2.7 RNA提取和定量PCR試驗 從脅迫12 h的每個溫度組各取3尾魚，立即解剖取其鰓組織，放入裝有Trizol reagent(Thermo Fisher)的2 mL管中，用組織振碎儀(美國MP Biomedicals)打碎組織，嚴格按照Trizol reagent的操作說明提取鰓的總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)將各個樣品的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載差異基因的序列，使用Primer 3.0軟件設(shè)計特異性引物(表1)，用于熒光定量分析(RT-PCR)。以cDNA為模板，EF-1α為試驗內(nèi)參，并使用Vazyme ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)，采用CFX96 Real-Time PCR Detection System(Bio-Rad)儀器進行實時熒光定量檢測。反應(yīng)體系(共20 μL)：SYBR qPCR Master Mix 10 μL，上、下游引物各0.4 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 7.2 μL。反應(yīng)程序：95 ℃下預(yù)變性30 s；95 ℃下變性10 s，60 ℃下退火30 s，共進行40個循環(huán)；最后在72 ℃下延伸5 min。融解反應(yīng)：95 ℃下 15 s，60 ℃下 60 s(數(shù)據(jù)采集)，95 ℃下 15 s。每個樣品設(shè)3個平行試驗以減小誤差，采用2-△△ct法計算目的基因的相對表達量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)用 Graph Pad Prism 8.0軟件進行分析，采用單因素方差分析法進行差異顯著性檢驗，顯著性水平設(shè)為0.05，極顯著性水平設(shè)為0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 青鳉的溫度耐受性生存曲線

通過逐步降溫和升溫試驗觀察青鳉狀態(tài)和存活情況。在降溫試驗中，當溫度從最適溫度26 ℃降到10 ℃時，魚停留在底部，游動緩慢，攝食減少；當溫度逐步降到4 ℃時，魚開始停止攝食，并聚集在一起，開始出現(xiàn)死亡。在升溫試驗中，當溫度從最適溫度26 ℃升至35 ℃時，魚頻繁游動，攝食也明顯減少；當溫度繼續(xù)升至40 ℃時，魚反應(yīng)激烈，間歇性上下躥動，鰓部明顯發(fā)紅，身體漸漸失去平衡，開始出現(xiàn)死亡。以26 ℃為對照，在低溫4 ℃和高溫40 ℃脅迫下，每2 h記錄青鳉死亡數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在4 ℃和40 ℃脅迫12 h時，死亡率均接近50%(圖1)，以試驗魚達到半致死率的水溫作為臨界水溫，青鳉的耐受溫度范圍為4～40 ℃。

*表示與對照組(26 ℃)有顯著性差異(P<0.05)；**表示與對照組有極顯著性差異(P<0.01)，下同。* means significant difference compared with the control (26 ℃)(P<0.05); ** means very significant difference compared with the control (P<0.01)，et sequentia.圖1 青鳉的溫度耐受性生存曲線Fig.1 Survival curve of medaka tolerance to temperature

2.2 不同溫度脅迫下青鳉鰓組織凋亡情況

通過TUNEL染色法檢測鰓組織的凋亡情況。從圖2可見:以最適溫度26 ℃的青鳉鰓組織作為對照，高溫脅迫12 h時，35 ℃組鰓組織切片上出現(xiàn)零星的綠色熒光，表現(xiàn)出少量的凋亡，40 ℃組鰓組織切片上出現(xiàn)較多綠色熒光，表現(xiàn)出大量凋亡；低溫脅迫12 h時，10 ℃組鰓組織幾乎無凋亡，4 ℃組鰓組織凋亡最為明顯。由此可知，高溫和低溫脅迫時均會使青鳉鰓組織產(chǎn)生凋亡，并分別在極限溫度40 ℃和4 ℃脅迫12 h時凋亡極其顯著。

圖2 不同溫度脅迫下青鳉鰓組織凋亡情況(TUNEL染色)Fig.2 Apoptosis of the gill of medaka exposed to different temperature stresses(TUNEL stain)

2.3 不同溫度脅迫下青鳉鰓細胞凋亡情況

通過流式細胞術(shù)檢測不同溫度脅迫下青鳉鰓細胞的凋亡情況，結(jié)果如圖3(a)～(e)所示。從圖3(f)可見：以最適溫度26 ℃組青鳉鰓細胞作為對照，高溫脅迫12 h時，35 ℃和40 ℃組鰓細胞凋亡均表現(xiàn)出極顯著性升高(P<0.01)，凋亡率分別為15.7%和21.78%；低溫脅迫12 h時，10 ℃組鰓細胞凋亡顯著升高(P<0.05)，凋亡率為7.06%，而4 ℃組鰓細胞凋亡極顯著升高(P<0.01)，凋亡率為24.79%。這與青鳉鰓組織TUNEL染色凋亡的檢測結(jié)果一致。

2.4 不同溫度脅迫下青鳉鰓細胞ROS含量

通過流式細胞術(shù)檢測不同溫度脅迫下青鳉鰓細胞的ROS含量。從圖4可見：以26 ℃組為對照，在高溫脅迫12 h時，35 ℃組青鳉鰓細胞ROS的平均熒光強度(MFI)顯著升高(P<0.05)，40 ℃組鰓細胞ROS的MFI極顯著升高(P<0.01)；在低溫脅迫12 h時，10 ℃組青鳉鰓細胞ROS的MFI顯著升高(P<0.05)，4 ℃組青鳉鰓細胞ROS的MFI極顯著升高(P<0.01)。這表明，高溫和低溫脅迫均會引起青鳉鰓細胞ROS含量的積累。

圖4 不同溫度脅迫下青鳉鰓細胞的ROS含量Fig.4 ROS content in medaka gill cells at different temperature stresses

2.5 不同溫度脅迫對青鳉鰓組織凋亡相關(guān)基因表達的影響

2.5.1 高溫脅迫下青鳉鰓組織凋亡相關(guān)基因表達情況 從圖5可見：高溫脅迫12 h時，35、40 ℃組青鳉鰓組織的p53基因表達量均顯著高于26 ℃組(P<0.05)，caspase3和caspase9基因表達量極顯著高于26 ℃組(P<0.01)；35、40 ℃組青鳉鰓組織的caspase1基因表達量均顯著低于26 ℃組(P<0.05)，40 ℃組青鳉鰓組織的bcl2基因表達量顯著低于26 ℃組，而35 ℃組青鳉鰓組織的bcl2基因表達量較26 ℃組有下降趨勢但無顯著性差異(P>0.05)。這表明，高溫脅迫12 h時，青鳉鰓組織的促凋亡基因(caspase3、caspase9、p53)表達均顯著上升，而抑凋亡基因(caspase1和bcl2)表達有下降趨勢。

圖5 高溫脅迫12 h時青鳉鰓凋亡相關(guān)基因的表達量Fig.5 Expression levels of apoptosis-related genes in gills under heat stress for 12 hours

2.5.2 低溫脅迫下青鳉鰓組織凋亡相關(guān)基因表達情況 從圖6可見：低溫脅迫12 h時，4 ℃組青鳉鰓組織的caspase3、caspase9和p53基因表達量均極顯著高于26 ℃組(P<0.01)，而10 ℃組青鳉鰓組織的caspase3、caspase9和p53基因表達量較26 ℃組有上升趨勢，但無顯著性差異(P>0.05)；4 ℃組青鳉鰓組織的caspase1和bcl2基因表達量均極顯著高于26 ℃組(P<0.01)，而10 ℃組青鳉鰓組織bcl2基因表達量顯著低于26 ℃組，10 ℃組青鳉鰓組織的caspase1基因表達量較26 ℃組有下降趨勢，但無顯著性差異(P>0.05)。這表明，低溫脅迫12 h時，10 ℃組青鳉鰓組織對凋亡基因的表達影響不大，4 ℃組青鳉鰓組織的凋亡相關(guān)基因均表現(xiàn)為極顯著上升。

圖6 低溫脅迫12 h時青鳉鰓凋亡相關(guān)基因的表達量Fig.6 Expression levels of apoptosis-related genes in gills under cold stress for 12 hours

3 討論

水溫對魚類的生長、攝食、生理代謝有重要影響，也是影響魚類生存的重要環(huán)境因子。鰓是魚類最重要的功能器官，主要參與機體的呼吸、滲透和氮氣排泄過程，有利于維持體內(nèi)的穩(wěn)態(tài)平衡[21]。本研究團隊前期對低溫應(yīng)激下斑馬魚和羅非魚鰓差異凋亡進行了研究，表明鰓組織在冷耐受極限時起到重要作用[6]。前期研究表明，斑馬魚耐溫性為7～40 ℃，是探究基礎(chǔ)高溫響應(yīng)分子機制較好的試驗對象[22]。本研究中，首先對青鳉耐受溫度進行了測定，耐受溫度為4～40 ℃；之后對高溫和低溫脅迫下青鳉鰓的凋亡情況進行了研究，發(fā)現(xiàn)在低溫和高溫脅迫下均引起了青鳉鰓發(fā)生凋亡和ROS水平的升高，同時凋亡相關(guān)基因也發(fā)生一定的變化。

3.1 溫度脅迫誘導細胞ROS的產(chǎn)生及細胞凋亡

高溫、寒冷、低氧等多種外界刺激因子均會誘導ROS的上調(diào)進而導致細胞凋亡[23]。研究表明，寒冷誘導大鼠肝細胞凋亡的主要機制是鐵離子和ROS的生成[24]。低溫刺激使斑馬魚ZF4細胞體內(nèi)積累大量ROS，導致細胞受到氧化損傷[25]。熱應(yīng)激下ROS產(chǎn)生過多會破壞線粒體膜，最終導致細胞凋亡[26]。本研究中使用流式細胞術(shù)對各溫度組鰓細胞進行ROS檢測，發(fā)現(xiàn)無論高溫還是低溫均發(fā)生了ROS的積累，且在極限溫度4 ℃和40 ℃脅迫12 h時檢測到大量的ROS，這表明,高溫和低溫脅迫均會促使細胞ROS含量的上升。通過TUNEL染色和流式細胞術(shù)對青鳉鰓凋亡檢測也發(fā)現(xiàn)，高溫和低溫脅迫會導致青鳉鰓發(fā)生凋亡，且在4 ℃和40 ℃脅迫12 h時凋亡極其顯著，凋亡率分別為24.79%和21.78%。本研究中發(fā)現(xiàn)，在溫度脅迫下青鳉鰓細胞ROS的上升趨勢與鰓細胞的凋亡程度是相對應(yīng)的關(guān)系，可以推測ROS在溫度脅迫誘導凋亡中發(fā)揮著重要作用，可能是溫度脅迫誘導青鳉鰓細胞產(chǎn)生大量的ROS，從而介導魚鰓發(fā)生細胞凋亡，最終導致魚體不耐受極限溫度而死亡。

3.2 溫度脅迫對凋亡相關(guān)基因表達的影響

caspase家族基因在細胞凋亡過程中占據(jù)著重要地位，直接參與早期凋亡、信號傳遞和晚期凋亡效應(yīng)[27]。bcl2是一種原癌基因，具有抑制細胞凋亡的作用[28]。p53是一種抑癌基因，其能激活很多p53靶基因，間接參與DNA損傷的修復，以及細胞衰老、分化和細胞凋亡的調(diào)控[29]。凋亡的兩種途徑——外部死亡受體途徑和內(nèi)在的線粒體途徑被廣泛認可。其中，內(nèi)在的線粒體途徑是由線粒體中細胞色素c的釋放引發(fā)的,細胞色素c可以通過含有細胞色素c/Apaf-1/caspas9的凋亡小體來激活下游效應(yīng)子caspase9和caspase3。caspase3的激活導致一系列蛋白質(zhì)的裂解，如核小體質(zhì)之間的蛋白、鐵蛋白，并導致細胞凋亡[30]。研究表明，冷應(yīng)激通過caspase依賴性途徑誘導細胞凋亡[31]。高溫脅迫阻礙Hela細胞周期，促使p53表達上調(diào)，誘導bax基因表達，抑制bcl2基因表達，從而導致細胞凋亡[32]。本研究中，高溫脅迫下，青鳉鰓的caspase3、caspase9和p53基因表達隨溫度的升高顯著升高，而caspase1和bcl2基因表達則隨溫度的升高而顯著降低。這表明,高溫脅迫導致青鳉鰓細胞發(fā)生凋亡，也產(chǎn)生大量的ROS，其凋亡途徑可能通過內(nèi)在的線粒體途徑。低溫脅迫下，青鳉鰓的caspase1、caspase3、caspase9和p53的表達在4 ℃脅迫12 h時均顯著升高，在10 ℃脅迫12 h時未明顯升高，bcl2基因的表達在低溫脅迫下呈先降低后升高的趨勢。這表明，低溫10 ℃脅迫12 h時，雖出現(xiàn)少量凋亡但凋亡相關(guān)基因表達變化不大，而在臨界溫度4 ℃脅迫12 h時出現(xiàn)顯著性凋亡，且其促凋亡基因和抑凋亡基因均顯著升高，這與高溫脅迫下凋亡基因表達有所差異，可能是青鳉響應(yīng)低溫與高溫的凋亡機制有所不同，這還需進一步探究。

4 結(jié)論

1)青鳉對溫度的耐受范圍較廣，其極限耐受溫度范圍為4～40 ℃。

2)在高溫35、40 ℃與低溫10、4 ℃脅迫12 h時，青鳉鰓細胞ROS含量與正常溫度(26 ℃)相比均出現(xiàn)顯著升高。這表明，高溫或低溫脅迫均會使青鳉鰓發(fā)生不同程度的氧化應(yīng)激。

3)溫度脅迫顯著影響凋亡相關(guān)基因的表達，最終導致青鳉鰓細胞發(fā)生明顯的凋亡，且在極限溫度40、4 ℃脅迫12 h時凋亡極其顯著。這表明，在極限溫度脅迫下鰓的凋亡程度影響魚的存活時長，本研究結(jié)果可為今后探索魚類在極限溫度下的致死機制研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。