張金勇，高養(yǎng)春,Amir Shah Ruddin Md Sah, Aileen TAN Shau-Hwai, Norlaila Binti Mohd Zanuri，李宏俊*

(1.國家海洋環(huán)境監(jiān)測中心 海洋生態(tài)室，遼寧 大連 116023； 2.School of Biological Sciences，Universiti Sains Malaysia，Penang 11800，Malaysia; 3. Centre For Marine & Coastal Studies，Universiti Sains Malaysia，Penang 11800，Malaysia)

浮游動物自主活動能力較弱，生命周期短，種類組成繁雜，數(shù)量大且分布廣[1]。海洋浮游動物作為生態(tài)系統(tǒng)中重要的次級生產(chǎn)者，其群落結(jié)構(gòu)的動態(tài)變化可以通過上行效應(yīng)影響魚、蝦和貝類等海洋漁業(yè)資源的結(jié)構(gòu)和總量，也可通過下行效應(yīng)制約著浮游植物的初級生產(chǎn)力變化[2-3]。因此，浮游動物是海洋生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)循環(huán)、能量流動的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，承擔(dān)著樞紐的作用，對整個(gè)海洋生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生重要的調(diào)控作用[4]。

浮游動物種類的準(zhǔn)確鑒定是研究浮游生態(tài)學(xué)的基礎(chǔ)，而浮游動物種類多而復(fù)雜，傳統(tǒng)依托形態(tài)特征的鑒定方法對鑒定人員的專業(yè)技能要求較高，并且不同鑒定結(jié)果可比性不佳；此外，采樣方式、物種自身形態(tài)特征(遺傳變異性、不同生活史階段、性別限制和隱存種等)及樣品保存都會給物種形態(tài)學(xué)鑒定工作帶來巨大挑戰(zhàn)[5]。因此，為滿足日益增多的監(jiān)測和評估需求，亟待建立一種速度快、精確度高、可自動化及標(biāo)準(zhǔn)化的物種鑒定檢測方法。近年來，高通量測序DNA宏條形碼技術(shù)的出現(xiàn)使得評估環(huán)境樣品的生物多樣性及復(fù)雜的群落結(jié)構(gòu)成為可能[6]。在浮游動物DNA條形碼研究中應(yīng)用較多的分子標(biāo)志基因包括核糖體28S rDNA、18S rDNA、內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)和線粒體細(xì)胞色素氧化酶亞基Ⅰ(COⅠ)等[7]。選擇分子標(biāo)志基因時(shí)應(yīng)區(qū)分其適用范圍，統(tǒng)籌考慮研究目的和待測生物類群。18S rDNA存在可變區(qū)和保守區(qū)且序列進(jìn)化速率較慢，通用引物易于覆蓋較廣物種類別的問題，適用于利用宏條形碼研究海洋浮游生物的多樣性[8-11]。

馬塘紅樹林保護(hù)區(qū)(Matang Mangrove Reserve)位于馬來西亞半島西海岸的霹靂州(Negeri Perak)，面積超過40 466 hm2[12]。馬來西亞政府早在1902年就對這片紅樹林進(jìn)行了有效保護(hù)，距今已有超過百年的管理歷史經(jīng)驗(yàn)。紅樹林保護(hù)區(qū)作為陸地和海洋之間重要的過渡地帶，為多種生物提供了覓食、繁殖與棲息的場所，是近海生物多樣性的搖籃，是一個(gè)獨(dú)特而復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)[13]。浮游動物是紅樹林生態(tài)系統(tǒng)食物鏈和生產(chǎn)力的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，在紅樹林生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)、功能和生物資源等要素循環(huán)中起著重要作用。浮游動物群落結(jié)構(gòu)特征能及時(shí)和準(zhǔn)確地反映紅樹林生態(tài)系統(tǒng)的健康狀況及水域生態(tài)環(huán)境的優(yōu)劣[14]。本研究中,在馬塘紅樹林保護(hù)區(qū)采集了10個(gè)站位的浮游動物樣品，分別采取DNA宏條形碼方法和傳統(tǒng)上基于形態(tài)特征鑒定方法分析保護(hù)區(qū)內(nèi)浮游動物群落結(jié)構(gòu)特征，并將兩種方法進(jìn)行對比，以期為評價(jià)基于高通量測序的DNA宏條形碼鑒定方法在海洋生物多樣性業(yè)務(wù)化監(jiān)測中的推廣與應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 調(diào)查站位的設(shè)置

2018年8月在馬來西亞馬塘紅樹林保護(hù)區(qū)布設(shè)10個(gè)采樣站位(SO1～SO10)(圖1)，各采樣站位的具體經(jīng)緯度及采樣水深如表1所示。

圖1 馬來西亞馬塘紅樹林保護(hù)區(qū)采樣站位Fig.1 Location of sampling stations in Matang Mangrove Reserve, Malaysia

表1 采樣站位經(jīng)緯度及水深Tab.1 Latitude, longitude and water depth at sampling stations

1.2 方法

1.2.1 樣品采集 使用淺水Ⅱ型浮游生物網(wǎng)(網(wǎng)目孔徑0.160 mm，網(wǎng)口內(nèi)徑31.6 cm，網(wǎng)長140 cm)，參照《海洋監(jiān)測規(guī)范》(GB 17378.7—2007)采集浮游動物樣品。將每個(gè)站位采集的樣品進(jìn)行充分混勻后均分成兩份，分別進(jìn)行傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定和分子技術(shù)鑒定。形態(tài)學(xué)樣品用體積分?jǐn)?shù)5%的福爾馬林溶液固定保存；分子技術(shù)鑒定樣品利用同孔徑篩絹過濾掉海水后，將截留浮游動物的篩絹放入新的采樣瓶，加入體積分?jǐn)?shù)100%乙醇固定樣品，用于DNA提取[15]。

1.2.2 樣品種類鑒定 形態(tài)學(xué)鑒定在體視顯微鏡下對濃縮后的浮游動物樣品進(jìn)行分類鑒定和計(jì)數(shù)。分子技術(shù)鑒定分3次從用乙醇保存的每個(gè)站位的樣品(總體積100 mL)中吸取浮游動物樣品，每次吸取10 mL，將3次吸取的樣品均勻混合后用網(wǎng)目20 μm的篩絹過濾，去除樣本中的殘留浮游藻類及乙醇等[15]。

1.2.3 基因組DNA的提取 使用DNeasy Blood and Tissue Kit (Qiagen, Hilden, 德國)提取樣品中的總DNA，DNA提取完成后用NanoDrop 2000(Thermo Fisher Scientific, USA)檢測其濃度，用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性，檢測合格的DNA置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 PCR擴(kuò)增和Illumina測序 以稀釋后的基因組DNA為模板，使用浮游動物通用引物Uni18SF(5′AGGGCAAKYCTGGTGCCAGC 3′)和Uni18SR(5′GRCGGTATCTRATCGYCTT 3′)對18S rDNA 基因的V4 區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增[6]。將引物添加8堿基的Barcode 標(biāo)簽用以區(qū)分不同樣品，在上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行合成[16]。PCR反應(yīng)體系(共20 μL)：5×FastPfu Buffer 4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，上、下游引物(5 μmol/L)各0.8 μL，F(xiàn)astPfu Polymerase 0.4 μL，DNA模板10 ng，用ddH2O補(bǔ)足至20 μL。使用ABI GeneAmp?9700型PCR系統(tǒng)進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)程序：95 ℃下預(yù)變性3 min；95 ℃下變性30 s，55 ℃下退火45 s，72 ℃下延伸30 s，共進(jìn)行32個(gè)PCR循環(huán)；最后在72 ℃下再延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化、濃度檢測合格后，使用NEB Next UltraTM DNA Library Prep Kit for Illumina(New England Biolabs)進(jìn)行文庫構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit 定量和文庫檢測，使用MiSeq PE300 測序儀(Illumina Inc., San Diego, CA, USA)進(jìn)行測序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

測序得到的原始數(shù)據(jù)使用Flash 1.2.11進(jìn)行數(shù)據(jù)拼接，參照Qiime(Quantitative insights into microbial ecology 1.9.1)[17]質(zhì)量控制流程將拼接后的序列去重過濾、序列分類注釋、Beta多樣性距離計(jì)算。采用Uparse 7.0[18]對有效數(shù)據(jù)進(jìn)行OTUs聚類(閾值設(shè)定相似度97%以上)，利用Usearch 8.1進(jìn)行OTUs統(tǒng)計(jì)處理，將期望誤差閾值(EER)設(shè)為1.0。使用RDP Classifier 2.11方法與NCBI Nr數(shù)據(jù)庫對OTUs代表序列進(jìn)行序列分類注釋，在此基礎(chǔ)上再對OTUs進(jìn)行豐富度、α多樣性計(jì)算等，同時(shí)對物種注釋在各分類水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的組成分析。浮游動物的形態(tài)學(xué)鑒定需要依據(jù)門、目和屬進(jìn)行專業(yè)技術(shù)人員鑒定。應(yīng)用Mothur 1.30.2構(gòu)建樣品稀釋性曲線，使用R語言Vegan包完成熱點(diǎn)圖(Heatmap圖)分析，熱點(diǎn)圖是以顏色梯度來表征二維矩陣或表格中的數(shù)據(jù)大小，并呈現(xiàn)群落物種組成及物種的豐富度信息。將OTU相對豐富度數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理后，基于Bray-Curtis距離矩陣，進(jìn)行CLUSTER聚類分析。

采用Coverage指數(shù)(C)估算樣本文庫的覆蓋率，采用Shannon指數(shù)(H)估算樣本中物種多樣性水平，采用豐富度指數(shù)(SChao1)評價(jià)群落中物種的豐富程度，采用Pielou均勻度指數(shù)(E)度量群落中相對物種豐富度，采用Ace指數(shù)(SAce)估計(jì)群落中OTU數(shù)目的指數(shù)，該指數(shù)在生態(tài)學(xué)中同樣作為度量物種豐富度的指標(biāo)，計(jì)算公式[19-22]為

C=1-n1/N，

(1)

(2)

(3)

E=H/Hmax,

(4)

(5)

式中，

其中：n1為只含有一條序列的OTU數(shù)目；N為抽樣中出現(xiàn)的總序列數(shù)；Sobs為實(shí)際觀測到的OTU數(shù)目；ni為第i個(gè)OTU所含的序列數(shù)；SChao1為估計(jì)的OTU數(shù)；n2為只含有兩條序列的OTU數(shù)目；H為Shannon指數(shù)；Hmax為在物種豐富度相同的情況下，能夠達(dá)到的最大Shannon指數(shù)(即當(dāng)群落中所有物種豐度完全一致時(shí))；Srare為含有“abund”條序列或者少于“abund”的OTU數(shù)目；Sabund為多于“abund”條序列的OTU數(shù)目。

2 結(jié)果與分析

2.1 高通量測序浮游動物稀釋性曲線

18S V4區(qū)引物測序結(jié)果顯示，對樣本的原始測序數(shù)據(jù)經(jīng)過拼接和質(zhì)量過濾后，總共獲得571 865條序列，每個(gè)站點(diǎn)樣品的有效序列片段數(shù)量范圍為46 335～71 624條，平均為57 186.5條序列。經(jīng)去除重復(fù)序列、OTU聚類(97%的閾值)等步驟，所有站位樣品總共獲得249個(gè)OTUs。根據(jù)OTUs數(shù)目所做的樣品稀釋曲線(圖2)可以看出，所有站位樣品OTUs數(shù)目都趨于飽和，表明各樣品測序數(shù)據(jù)量足夠覆蓋大部分的種類。

圖2 各采樣站位浮游動物樣品OTUs數(shù)目稀釋性曲線Fig.2 Rarefaction curves of the number of OTUs in zooplankton samples at each sampling station

2.2 基于高通量測序的浮游動物多樣性指數(shù)

由表2可看出，各樣品文庫的覆蓋率較高，表明樣本序列檢出率高，測序結(jié)果真實(shí)可靠?；贒NA宏條形碼分子鑒定方法計(jì)算得到的各站位樣品α多樣性指數(shù)顯示，SO4、SO1、SO2的Shannon指數(shù)值處于前3位，SO3和SO5的Shannon指數(shù)值處于后2位；SO4、SO1、SO2的Ace指數(shù)值也處于前3位，SO7和SO10的Ace指數(shù)值處于后2位；SO2、SO4和SO1的Chao1指數(shù)值處于前3位，SO7和SO9的Chao1指數(shù)值處于后2位；SO9、SO4和SO10的Pielou均勻度指數(shù)值處于前3位，SO3的Pielou均勻度指數(shù)值最低(0.27)(表2)。

表2 基于宏條形碼鑒定方法的浮游動物多樣性指數(shù)統(tǒng)計(jì)Tab.2 Zooplankton diversity index statistics based metabarcoding identification methods

2.3 基于高通量測序的浮游動物組成分析

熱點(diǎn)圖可以在門、目和屬水平上呈現(xiàn)樣本之間的關(guān)系。根據(jù)門和目分類水平上熱點(diǎn)圖樣本聚類樹可以看出，10組樣本大致可劃分為3類(圖3(a), 圖4(a)),第Ⅰ類包括SO1、SO2、SO3和SO6，其樣本間豐度組成的相似性較高，第Ⅱ類是樣本間較為相似的SO4、SO7、SO8、SO9和SO10，而第Ⅲ類SO5與其他樣本差別最大，單獨(dú)為一類。在屬分類水平上，根據(jù)熱點(diǎn)圖樣本聚類樹依然可將10組樣本劃分為3類，但站位SO4從門和目分類水平的第Ⅱ類站位劃歸到第Ⅰ類站位中，即第Ⅰ類包括SO1、SO2、SO3、SO4和SO6(圖5(a))。

圖3 各站位浮游動物樣品門水平上組成分析Fig.3 Analysis of the composition of zooplankton samples at each sampling station at phylum level

圖4 各站位浮游動物樣品目水平上組成分析Fig.4 Analysis of the composition of zooplankton samples at each sampling station at order level

圖5 各站位浮游動物樣品屬水平上組成分析Fig.5 Analysis of the composition of zooplankton samples at each sampling station at genus level

群落柱形圖可以在門、目和屬水平上直觀展示各樣本的浮游動物組成。在門分類水平上(圖3(b))，第Ⅰ類站位中刺胞動物門Cnidaria、棘皮動物門Echinodermata和節(jié)肢動物門Arthropoda的平均reads數(shù)較多，處于前3位，相對豐度分別占總豐度的10.64%、7.50%和6.69%；第Ⅱ類站位(SO4、SO7、SO8、SO9和SO10)中平均reads數(shù)占比最高的是節(jié)肢動物門，達(dá)58.74%，除節(jié)肢動物門外，Ⅱ類站位reads數(shù)占比較高的門類有刺胞動物門(6.11%)和環(huán)節(jié)動物門(5.78%)；第Ⅲ類SO5中半索動物門Hemichordata、節(jié)肢動物門和刺胞動物門的平均reads數(shù)所占比例處于前3位，相對豐度分別占64.44%、27.18%和0.91%。

在目分類階元上(圖4(b))，第Ⅰ類站位中心形海膽目Spatangoida、哲水蚤目Calanoida和硬水母目Trachymedusae的平均reads數(shù)占比處于前3位，相對豐度分別占7.48%、6.20%和3.66%；第Ⅱ類所有站位中哲水蚤目平均reads數(shù)占比最高，相對豐度占比達(dá)到51.21%；第Ⅲ類SO5中哲水蚤目平均reads數(shù)占比亦是最高，相對豐度達(dá)20.33%。

在屬分類階元上(圖5(b))，3大類站位浮游動物的相對豐度也存在較大差異，第Ⅰ類站位中石筆海膽屬Archaeopneustes和球水母屬Sphaeronectes的平均reads數(shù)較高，相對豐度分別占6.35%和3.05%；第Ⅱ類站位中矮隆哲水蚤屬Bestiolina的平均reads數(shù)占比最高，相對豐度占比達(dá)到47.40%；而第Ⅲ類SO5中腺頭蟲屬Glandiceps的平均reads數(shù)占比最高，相對豐度占比達(dá)到64.44%。

2.4 基于高通量測序和形態(tài)學(xué)特征鑒定得到的浮游動物組成比較

借助光學(xué)顯微鏡，在各站位樣品中共檢測出的浮游動物包括哲水蚤目、劍水蚤目Cyclopoidea、猛水蚤目Harpacticoida、十足目Decapoda、甲殼類幼蟲Nauplii及魚卵等?；谛螒B(tài)特征鑒定的各站位浮游動物豐度平均值為129.8 ind./m3(不包括魚卵)，范圍為12～307 ind./m3，站位SO5平均豐度最高(307 ind./m3)，站位SO6平均豐度最低(12 ind./m3)(表3)。

基于形態(tài)學(xué)特征鑒定的結(jié)果顯示，SO10、SO2和SO5的Shannon指數(shù)處于前3位，SO6的Shannon指數(shù)值最低(0.28)；SO10、SO9和SO6的Pielou均勻度指數(shù)值處于前3位，SO4的值Pielou均勻度指數(shù)最低(0.60)(表4)。

表3 基于形態(tài)學(xué)特征鑒定的馬塘紅樹林保護(hù)區(qū)浮游動物豐度分布Tab.3 Distribution of abundance of zooplankton identified by morphological characteristics in Matang Mangrove Reserve

表4 基于形態(tài)學(xué)鑒定方法的浮游動物多樣性指數(shù)統(tǒng)計(jì)Tab.4 Zooplankton diversity index statistics based morphological identification methods

將采用DNA宏條形碼方法獲得的OTUs序列與NCBI Nr數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種比對，成功注釋浮游動物25門88目138屬；基于形態(tài)學(xué)鑒定，共鑒定出浮游動物2門6目13屬。本研究發(fā)現(xiàn)，利用形態(tài)學(xué)方法鑒定出來的大部分類別(門100%、目83%、屬54%)同時(shí)也能用宏條形碼方法鑒定出來；而利用宏條形碼分子方法鑒定出的大部分類別(門92%、目94%、屬95%)卻未能利用形態(tài)學(xué)方法鑒定出來。此外，宏條形碼分子方法鑒定結(jié)果顯示，矮隆哲水蚤屬的reads數(shù)在Ⅱ類站位SO7、SO8、SO9和SO10中占比都是各自采樣點(diǎn)最高的，相對豐度占比分別達(dá)到40.73%、64.95%、36.98%和46.92%；而形態(tài)學(xué)方法鑒定結(jié)果顯示，豐度最高的屬是大眼劍水蚤屬Corycaeus，達(dá)到24.07%(表3)。

對于所有采樣站位，基于宏條形碼方法鑒定的平均Pielou均勻度指數(shù)(0.45±0.13)低于基于形態(tài)學(xué)鑒定的平均Pielou均勻度指數(shù)(0.86±0.10)，但在站位SO4中發(fā)現(xiàn)基于分子技術(shù)鑒定的Pielou均勻度指數(shù)略高于基于形態(tài)學(xué)鑒定的結(jié)果；同時(shí)，基于宏條形碼鑒定方法的多樣性指數(shù)均高于形態(tài)學(xué)鑒定方法得出的多樣性指數(shù)(表2,表4)。

3 討論

3.1 DNA宏條形碼法監(jiān)測浮游動物群落的可行性

DNA宏條形碼技術(shù)是結(jié)合DNA條形碼和高通量測序的方法，這一技術(shù)的應(yīng)用對浮游生物多樣性的研究提供了強(qiáng)大的技術(shù)支撐[23]。但利用DNA宏條形碼進(jìn)行物種鑒定選擇合適的標(biāo)志基因是基本保障。由于標(biāo)志基因?qū)Σ煌锓N的通用性和分辨率存在差異，高靈敏度的通用引物仍然是DNA條形碼技術(shù)發(fā)展的限制之一。目前，大部分浮游動物研究仍基于COⅠ、18S rDNA和28S rDNA基因。為探究浮游動物DNA宏條形碼標(biāo)志基因的擴(kuò)增差異，Zhan等[24]比較研究了COⅠ、16S和18S等標(biāo)志基因后發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)COⅠ基因難以提供穩(wěn)定的PCR產(chǎn)物，建議選擇18S和16S基因進(jìn)行研究。然而，高旭等[25]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雖然18S V9對浮游動物具有更高的物種覆蓋度，16S具有更好的特異性，但COⅠ的物種覆蓋度、物種識別敏感性和物種特異性都適中，更加適合浮游動物DNA 宏條形碼監(jiān)測。

本研究中選取的Uni18S引物已廣泛應(yīng)用于海洋及淡水生物多樣性研究與評價(jià)[15]。雖然此引物并不能將所有物種鑒定到種的水平，但對大部分種類而言鑒定到科及屬水平具有較高可信度[6]。利用此引物，本研究中鑒定出的浮游動物類別在門、目及屬分類水平上(25門88目138屬)明顯優(yōu)于形態(tài)學(xué)鑒定出的類別(2門6目13屬)，且宏條形碼分子鑒定的多樣性指數(shù)(Shannon多樣性指數(shù))明顯高于基于形態(tài)學(xué)特征鑒定出的結(jié)果，平均Pielou均勻度指數(shù)(0.45±0.13)低于形態(tài)學(xué)鑒定的平均Pielou均勻度指數(shù)(0.86±0.1)。但在浮游動物多樣性研究與評價(jià)中，對于同一海域不同采樣站位應(yīng)采取相同的浮游動物鑒定方法，多樣性指數(shù)比較亦是如此。同時(shí)，根據(jù)課題組前期工作，高養(yǎng)春等[15]估算了兩種方法鑒定每份浮游動物樣本所需的時(shí)間成本和費(fèi)用成本(表5)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與形態(tài)學(xué)鑒定方法相比，宏條形碼分子鑒定具有鑒定效率高、費(fèi)用低的優(yōu)點(diǎn)。這些研究結(jié)果表明，DNA宏條形碼分子鑒定方法在浮游生物多樣性研究與評價(jià)中具有較高的應(yīng)用潛力。

表5 基于兩種方法鑒定每份浮游動物樣本所需費(fèi)用和時(shí)間成本Tab.5 Economical and time costs of analyzing one zooplankton sample based on both methods

3.2 DNA宏條形碼方法監(jiān)測浮游動物群落面臨的問題

盡管DNA宏條形碼技術(shù)的優(yōu)勢(快速、操作簡便、人為干擾小等)已經(jīng)被大家公認(rèn)[10，26]，但該技術(shù)本身也還存在一些問題需要在未來浮游動物鑒定應(yīng)用中加以解決。這些問題主要集中在3個(gè)方面，即如何選擇合適的引物與引物偏好性問題、絕對定量問題和參考數(shù)據(jù)庫不完整性問題。首先，在浮游動物研究中，有很多標(biāo)志基因可以選擇，但是沒有哪一個(gè)標(biāo)志基因能夠同時(shí)擴(kuò)增出所有物種并保證每一個(gè)物種的擴(kuò)增效率是一致的。因此，針對不同的生物組成如何選擇合適的標(biāo)志基因是DNA宏條形碼技術(shù)能否用于環(huán)境評價(jià)的限制之一[27]。其次，在PCR擴(kuò)增及高通量測序過程中均會產(chǎn)生假陽性及假陰性的錯(cuò)誤，OTUs的序列數(shù)可以近似反映生物量的多少，由于各種因素的干擾，很可能導(dǎo)致生物量和OTUs序列數(shù)之間并不是線性相關(guān)的，例如DNA的提取方法、PCR擴(kuò)增效率、DNA混合池甚至是生物信息學(xué)分析都會干擾定量計(jì)算[28]。最后，利用DNA宏條形碼技術(shù)進(jìn)行物種鑒定最終要回歸到測序序列和參考數(shù)據(jù)庫的比對上。因此，參考數(shù)據(jù)庫的完整性和質(zhì)量直接決定了DNA宏條形碼技術(shù)獲得數(shù)據(jù)的可靠性。雖然近年來參考數(shù)據(jù)庫中物種信息增長很快，GenBank、Barcode of Life (BOLD)等公共數(shù)據(jù)庫收錄了大量數(shù)據(jù)，但相對陸生生態(tài)系統(tǒng)，對水生生態(tài)系統(tǒng)收錄的類群較少。數(shù)據(jù)庫的不完善導(dǎo)致很多宏條形碼數(shù)據(jù)沒有辦法進(jìn)行有效注釋，處于未知狀態(tài)[29]。

3.3 宏條形碼方法與形態(tài)學(xué)方法監(jiān)測馬塘紅樹林保護(hù)區(qū)浮游動物群落結(jié)構(gòu)差異性

近年來，已有國內(nèi)研究人員對福建漳江口、雷州半島及海南東寨港紅樹林自然保護(hù)區(qū)大型、小型底棲動物進(jìn)行過相關(guān)研究，有關(guān)浮游動物的研究僅見黃勃課題組對東寨港紅樹林區(qū)的分析和研究[13-14]。而早在20世紀(jì)80年代初，國外就有關(guān)于紅樹林林區(qū)浮游動物的研究報(bào)道。目前，相關(guān)研究主要集中在鹽度、水溫等理化因子對浮游動物分布的影響等方面，而有關(guān)紅樹林區(qū)生態(tài)系統(tǒng)中浮游動物群落結(jié)構(gòu)的研究卻較少[30-31]。本研究中，采用宏條形碼和形態(tài)學(xué)鑒定兩種技術(shù)方法對馬塘紅樹林區(qū)10個(gè)站位浮游動物樣品進(jìn)行浮游動物群落組成和結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果表明，宏條形碼分子方法能得到更多的浮游動物種類和豐富度信息，基于形態(tài)學(xué)特征鑒定出的浮游動物在門、目和屬分類水平上明顯少于分子鑒定出的類別，且發(fā)現(xiàn)了大量基于形態(tài)學(xué)特征無法鑒定出的種類。由此結(jié)果可以推知，基于18S rDNA V4區(qū)擴(kuò)增的宏條形碼方法具有較高的物種分辨率和通用性，鑒定效率大大高于形態(tài)學(xué)鑒定方法。另外，兩種方法鑒定到的豐度最高的屬在各站位是不同的，宏條形碼方法檢測出豐度最高的屬為矮隆哲水蚤屬，且各站位矮隆哲水蚤屬所占的比例沿采樣點(diǎn)SO1至SO10有逐漸升高的趨勢?；谛螒B(tài)學(xué)特征鑒定出豐度最高的屬是大眼劍水蚤屬，且在大部分采樣點(diǎn)該屬所占的比例均較高，少部分采樣點(diǎn)(如SO2和SO8)矮隆哲水蚤屬所占的比例較高。出現(xiàn)此結(jié)果，一方面由于形態(tài)學(xué)鑒定對人員的專業(yè)技能要求較高，不同鑒定人員的結(jié)果可比性較差；另一方面限于目前宏條形碼分子方法存在的一些技術(shù)問題(引物偏好性問題、絕對定量問題和參考數(shù)據(jù)庫不完整性問題)，導(dǎo)致部分站位宏條形碼數(shù)據(jù)未能有效鑒別。黃進(jìn)等[32]采用宏條形碼分子方法結(jié)合顯微鏡計(jì)數(shù)的方法研究了鴨河口水庫微型浮游生物群落組成，比較兩種方法，宏條形碼分子方法能檢測微型后生動物Metazoa、雙鞭毛蟲Dinoflagellata、絲足蟲Cercozoa等8個(gè)門，而形態(tài)學(xué)鑒定方法在浮游動物檢測中僅觀察到輪蟲動物門Rotifera 1個(gè)門。施軍瓊等[33]對真核浮游生物18S rDNA V4區(qū)進(jìn)行高通量測序，探討了大寧河不同水華期真核浮游生物群落組成，結(jié)果表明，V4區(qū)引物在微微型、微型浮游植物群落鑒定方面更為高效，能有效彌補(bǔ)光學(xué)顯微鏡觀察中丟失的一些種類信息。宏條形碼分子方法能檢測到更豐富的浮游生物群落信息，國外的研究中也普遍發(fā)現(xiàn)類似的結(jié)果[34-35]。

通過對比高通量測序的宏條形碼方法和傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡鑒定數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，高通量測序不但具有鑒定效率高、費(fèi)用較低等優(yōu)點(diǎn)，而且能得到更多的浮游動物種類信息。隨著宏條形碼技術(shù)體系的不斷完善，數(shù)據(jù)庫不斷更新，使得DNA條形碼技術(shù)的準(zhǔn)確性更高，將為海洋浮游生物多樣性快速評估提供強(qiáng)大的技術(shù)支撐。

4 結(jié)論

1)比較宏條形碼分子方法與形態(tài)學(xué)鑒定兩種方法，宏條形碼分子方法在鑒定浮游動物群落類別和豐富度方面明顯高于形態(tài)學(xué)鑒定出的結(jié)果。

2)宏條形碼方法具有鑒定效率高、花費(fèi)較低等優(yōu)點(diǎn)，但仍面臨著如何選擇合適的標(biāo)志基因、引物偏好性問題和參考數(shù)據(jù)庫不完整等問題。

3)宏條形碼分子鑒定方法在海洋浮游動物多樣性研究與評價(jià)中具有較高的應(yīng)用前景。