劉 芳，龔 芳，清 江，楊楚悅，孟桃于，丁 利

（1.長沙理工大學 化學與食品工程學院，湖南 長沙 410000；2.長沙和合醫(yī)學檢驗實驗室有限公司，湖南長沙 410000；3.上海海關(guān) 工業(yè)品與原材料檢測技術(shù)中心，上海 200135）

湖南是以柑橘種植為主的水果生產(chǎn)大省，柑橘種植面積高達全省水果種植總面積的75%。據(jù)統(tǒng)計，2018 年湖南省柑橘種植面積為576.1 萬畝，產(chǎn)量為528.6 萬噸，居全國第二。隨著科技進步和生活水平的提高，人們對食品質(zhì)量安全越來越重視，由于農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)鏈條長、環(huán)節(jié)多、生產(chǎn)主體分散，同時農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境的惡化和禁用物質(zhì)的非法添加，給農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全帶來重大隱患［1］。環(huán)境激素是一類影響人體和動物體內(nèi)正常激素水平的外源性化學物質(zhì)［2］。目前已發(fā)現(xiàn)的環(huán)境激素多達70 種，包括類固醇類激素及一些類雌激素作用的化合物等［3］。其中，酚類環(huán)境激素是一種重要的化工原料，被廣泛用于食品接觸涂層、塑料玩具、眼鏡片、藥物等各類工業(yè)生產(chǎn)中［4－5］。研究表明，酚類環(huán)境激素具有與雌激素類似的作用，可影響生物體的生殖和發(fā)育系統(tǒng)［6］、神經(jīng)系統(tǒng)［7］、免疫系統(tǒng)［8］等。由于生產(chǎn)生活中的廣泛使用，雙酚類環(huán)境激素在水體［9］、土壤［10］等環(huán)境中廣泛存在，可能通過根部吸收在柑橘中進行富集，再通過食物鏈［11－12］進入生物體內(nèi)，最終對人體健康產(chǎn)生危害［13－14］。因此，檢測柑橘中的酚類環(huán)境激素對于保障人體健康具有重要意義。

目前酚類環(huán)境激素的測定對象主要為食品接觸材料、水產(chǎn)品、尿液和奶粉等，常用的檢測方法包括氣相色譜－質(zhì)譜法（GC－MS）［15］、液相色譜法（HPLC）［16］和液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法（LC－MS/MS）［17］等。但GC－MS 法耗時長、前處理操作繁瑣，HPLC 法分析速度慢、靈敏度和特異性低。LC－MS/MS 法分析速度快、選擇性強、準確度高，被廣泛應(yīng)用于酚類環(huán)境激素的定量及定性分析。酚類環(huán)境激素常用的前處理方法包括酶解［18］、固相萃?。?9－21］、液－液萃?。?2］等。QuEChERS 具有回收率高、操作簡便、分析速度快、適用范圍廣等優(yōu)點。目前關(guān)于柑橘中環(huán)境激素的研究報道較少，僅屈芳等［23］采用固相萃取/高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法測定蘋果、香蕉、橘子、梨等水果中8 種環(huán)境雌激素，但該方法耗時長、前處理操作繁瑣。因此，建立簡單、快速的柑橘中酚類環(huán)境激素的檢測方法具有重要意義。

本研究以湖南主要特色農(nóng)產(chǎn)品柑橘為研究對象，以乙腈（含0.1%甲酸）為提取溶劑，建立了柑橘中雙酚A 等7 種酚類環(huán)境激素的分散固相萃取/高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜測定方法。該方法操作簡單、快速靈敏、定量準確、精密度高，適用于柑橘中酚類環(huán)境激素的測定。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜儀（AB4500，美國AB SCIEX 公司）；電子分析天平（MS106DU，瑞士Mettler Toledo 公司）；高速冷凍離心機（TGL－16M，湖南邁克爾儀器有限公司）；超聲波振蕩器（KQ2200DE，昆山超聲儀器有限公司）；氮吹儀（MD－200－2，杭州奧盛儀器有限公司）；多管渦旋混合儀（LPD2500，北京萊普特科學儀器有限公司）；移液器（德國Eppendorf 公司）；PSA PAEs dSPE 專用填料（40～63 μm，60?）、HC－C18QuEChERS 專用填料（100 g，40～63 μm）、有機系微孔濾膜（0.22μm），均購于上海安譜實驗科技股份有限公司。

雙酚A（BPA）、雙酚B（BPB）、雙酚F（BPF）、雙酚S（BPS）、壬基酚（NP）、4-n-壬基酚（4-n-NP）、4-n-辛基酚（4-n-OP）標準品均購于德國Dr. Ehrenstorfer 公司；色譜純甲醇、乙腈均購于德國Merck 公司；甲酸（FA，純度≥96%）、乙酸銨（純度≥99%）購于德國Sigma公司；超純水購于中國屈臣氏集團有限公司。柑橘均購于當?shù)厥袌觯ㄒ苏禄实鄹?、南豐沙糖桔2、石門蜜橘3、永興冰糖橙4、慈利紐荷爾橙5、郴州粑粑柑6、湘西椪柑7、常德蜜柚8）。

1.2 標準溶液的配制

標準儲備液：分別準確稱取10 mg 7種酚類環(huán)境激素標準品置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，配制成1 g/L的標準儲備液，于4 ℃保存。

中間標準溶液：用甲醇將上述標準儲備液稀釋成質(zhì)量濃度均為10 mg/L 的中間標準溶液，于4 ℃保存。

混合標準工作液：用空白基質(zhì)提取液將上述中間標準溶液稀釋成系列質(zhì)量濃度的混合基質(zhì)匹配標準工作溶液。其中，4-n-NP、4-n-OP、BPB、BPS 的系列質(zhì)量濃度為0.2、1、5、10、20、50、100μg/L，BPA、NP、BPF的系列質(zhì)量濃度為0.5、2、5、10、20、50、100μg/L。

空白基質(zhì)：處理方法同“1.3”。

1.3 樣品前處理

稱取5.0 g 均質(zhì)后的柑橘樣品于50 mL 離心管中，加入10 mL 乙腈（含0.1%FA）后高速勻漿3 min，加入1.5 g無水硫酸鎂和1.0 g氯化鈉，渦旋混勻3 min后，超聲提取10 min，于10 000 r/min離心5 min，收集上清液?；|(zhì)中加入10 mL乙腈（含0.1%FA）再提取1次，收集上清液。

合并2 次上清液，定容至25 mL。取10 mL 溶液置于裝有50 mg N-丙基乙二胺（PSA）、50 mg C18粉末、1.0 g 無水硫酸鎂的離心管中，渦旋混勻3 min，于10 000 r/min 離心5 min，取5 mL 上清液氮吹，然后用1 mL 乙腈（含0.1%FA）復(fù)溶，渦旋混勻1 min，于10 000 r/min 離心3 min，取上清液經(jīng)0.22μm有機濾膜過濾后待測定。外標法定量。

1.4 色譜條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱（50 mm × 2.1 mm，1.7 μm）；柱溫：40 ℃；流速：0.2 mL/min；流動相：A 為水（含0.5 mmol/L 乙酸銨），B 為甲醇。梯度洗脫程序：0～0.5 min，10%B；0.5～1.0 min，10%～60% B；1.0～5.0 min，60%～100% B；5.0～6.5 min，100% B；6.5～6.6 min，100%～10%B；6.6～8.5 min，10%B；進樣量：5μL。

1.5 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧電離（ESI）源；掃描方式：負離子掃描；離子源溫度（TEM）：500 ℃；霧化氣（Gas1）壓力：0.34 MPa；輔助氣（Gas2）壓力：0.38 MPa；離子噴霧電壓（IS）：－4 500 V；氣簾氣（CUR）壓力：0.24 MPa；碰撞氣（CAD）壓力：0.06 MPa；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式。7 種酚類環(huán)境激素的質(zhì)譜分析參數(shù)見表1。

表1 7種酚類環(huán)境激素的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS parameters of the seven phenolic environmental hormones

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采用蠕動泵直接進樣的方式，將500μg/L 的單一標準溶液以7μL/min 流速注入ESI源中，在Q1 母離子掃描模式下比較正離子模式和負離子模式的響應(yīng)。結(jié)果表明，各目標物均在負離子模式下具有更強的響應(yīng)。因此，實驗選擇在負離子模式下獲得目標化合物的準分子離子峰。在子離子模式下，通過調(diào)節(jié)碰撞能，選取豐度最高的2 個碎片離子作為定量離子和定性離子，并對各離子的去簇電壓、碰撞能進行優(yōu)化，確定各目標物的質(zhì)譜參數(shù)如表1所示。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

首先比較了甲醇－水、甲醇－水（含0.5 mmol/L 甲酸銨）、甲醇－水（含0.5 mmol/L 乙酸銨）、甲醇－水（含0.1%氨水）4 種流動相體系的分離效果，發(fā)現(xiàn)以甲醇－水（含0.5 mmol/L 乙酸銨）、甲醇－水（含0.1%氨水）為流動相時，7 種化合物的響應(yīng)值較高、峰形好、拖尾現(xiàn)象減少；但以甲醇－水（含0.1%氨水）為流動相時，BPS的出峰時間大幅度提前。考慮到流動相中添加一定濃度的乙酸銨可增加負離子模式下化合物的電離效果，實驗進一步對比了甲醇－水（含0.5 mmol/L 乙酸銨）、甲醇－水（含1.0 mmol/L 乙酸銨）、甲醇－水（含1.5 mmol/L 乙酸銨）、甲醇－水（含2.0 mmol/L 乙酸銨）4 種流動相體系，結(jié)果表明，7 種化合物的響應(yīng)值未隨著乙酸銨濃度的增加而升高，因此選擇甲醇和水（含0.5 mmol/L 乙酸銨）為流動相。在MRM 模式下，7 種化合物混合標準溶液（50μg/L）的總離子流色譜圖如圖1所示。

圖1 7種酚類環(huán)境激素（50μg/L）混合標準溶液的色譜圖Fig.1 Chromatogram of seven phenolic environmental hormones（50μg/L）in mixed standard solution

2.3 前處理條件的優(yōu)化

2.3.1 提取溶劑種類的選擇考察了甲醇、甲醇（含0.1% FA）、乙腈、乙腈（含0.1% FA）4 種提取溶劑的提取效果（圖2）。結(jié)果表明，當提取溶劑為甲醇和甲醇（含0.1%FA）時，7 種目標物的回收率較低，由于甲醇可溶解鹽類，不利于液液分層，且基質(zhì)中強極性的醇或有機酸等易在甲醇中溶出，不利于后續(xù)樣品凈化；當提取溶劑為乙腈和乙腈（含0.1% FA）時，BPA、BPB、BPS、BPF、NP 的提取率均可達到90%以上，且4-n-NP、4-n-OP 的提取率達到70%以上，而乙腈（含0.1%FA）的提取率優(yōu)于乙腈，因此選擇乙腈（含0.1%FA）作為提取溶劑。此外，柑橘中含有較多的水分，加入1.5 g 無水硫酸鎂和1.0 g 氯化鈉以促進水相和有機相分層并防止水分進入有機相。

圖2 提取溶劑對柑橘中7種酚類環(huán)境激素提取率的影響Fig.2 Effect of extraction solvent on the extraction rate of seven phenolic environmental hormones in citrus

2.3.2 提取溶劑體積的選擇以乙腈（含0.1%FA）為提取溶劑，考察了提取溶劑體積（5.0、7.5、10、12.5、15 mL）對提取率的影響。結(jié)果顯示，提取溶劑體積為10 mL 時，7 種目標物均有較高的提取率。提取溶劑體積太小時，樣品分散性較差，目標物提取率低；而提取溶劑體積太大時，有機溶劑消耗較多，易產(chǎn)生污染。因此，實驗選擇提取溶劑體積為10 mL。

2.3.3 提取時間的選擇考察了不同提取時間（5、10、15、20、25 min）對柑橘中7 種目標物提取率的影響（圖3）。由圖可知，提取時間為5 min時，4-n-NP、4-n-OP的提取率較低；隨著提取時間的增加，提取率明顯提高；提取時間大于10 min后，提取率變化較小，因此選擇最佳提取時間為10 min。

圖3 提取時間對柑橘中7種酚類環(huán)境激素提取率的影響Fig.3 Effect of extraction time on the extraction rate of seven phenolic environmental hormones in citrus

2.3.4 吸附劑的優(yōu)化QuEChERS 方法中最常用的吸附劑有石墨化炭黑（GCB）、PSA 和C18粉末。由于GCB 對目標物有吸附，回收率較低，因此實驗考察了吸附劑的種類（PSA 粉末、C18粉末、PSA + C18粉末）和不同用量（0、25、50、75、100 mg）對7 種目標物回收率的影響。圖4結(jié)果表明，7 種目標物經(jīng)PSA + C18粉末凈化提取后的回收率最高，原因是PSA 可通過氫鍵等分子間作用力有效地去除基質(zhì)中的有機酸、糖類等極性分子，而C18粉末易吸附色素、維生素、脂肪等非極性或極性小的分子。通過對吸附劑用量優(yōu)化發(fā)現(xiàn)，采用50 mg PSA+50 mg C18粉末凈化的回收率最好，原因是吸附劑用量過多會吸附目標化合物，導致回收率降低；吸附劑用量過少則雜質(zhì)吸附不完全。因此，最終采用50 mg PSA+50 mg C18粉末作為吸附劑。

圖4 吸附劑種類對柑橘中7種酚類環(huán)境激素提取率的影響Fig.4 Effect of adsorbent types on the extraction rate of seven phenolic environmental hormones in citrus

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)普遍存在于質(zhì)譜分析中，主要是由于共提取物與目標分析物在電噴霧離子源上存在競爭效應(yīng)，影響目標分析物電離，表現(xiàn)為離子增強或抑制作用［23］。分別配制系列基質(zhì)匹配標準溶液和空白溶劑標準溶液，采用本方法進行測定，以基質(zhì)匹配標準曲線斜率（A）與空白溶劑標準曲線斜率（B）的比值評價基質(zhì)效應(yīng)（ME），即ME=|A/B－1|×100%。當ME ≤20%時，基質(zhì)效應(yīng)較弱；當ME 為20%～50%時，基質(zhì)效應(yīng)為中等程度；當ME ≥50%時，基質(zhì)效應(yīng)較強。結(jié)果顯示，BPA、BPB 的ME 分別為2.8%、9.6%，為弱基質(zhì)效應(yīng)；BPF、NP、4-n-NP、4-n-OP 的ME 分別為41.7%、35.6%、44.0%、33.0%，為中等程度基質(zhì)效應(yīng)；BPS的ME為76.7%，為強基質(zhì)效應(yīng)。因此，本方法選用基質(zhì)匹配標準曲線進行定量。

2.5 線性關(guān)系、檢出限與定量下限

按“1.2”方法配制7 種目標化合物的系列基質(zhì)匹配標準溶液，采用本方法進行測定，以目標物的峰面積（y）對其質(zhì)量濃度（x，μg/L）進行線性回歸。結(jié)果表明，7 種目標化合物在各自的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（r2）均不小于0.994 1。分別以3 倍信噪比和10 倍信噪比確定方法的檢出限（LOD）和定量下限（LOQ），7 種目標化合物的LOD 和LOQ 分別為0.2～0.5μg/L 和0.5～1.5μg/L（見表2）。

表2 7種酚類環(huán)境激素的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量下限Table 2 Linear equations，linear ranges，correlation coefficients（r2），LODs and LOQs of seven phenolic environmental hormones

2.6 回收率與相對標準偏差

為驗證方法的準確性和重復(fù)性，分別在空白柑橘樣品中添加3個不同濃度水平（10、250、500μg/kg）的標準溶液，按照“1.3”方法進行預(yù)處理，每個加標水平測定9 次，計算回收率和相對標準偏差（RSD）。由表3 可知，在3 個加標水平下，7 種化合物的回收率為88.5%～109%，RSD 為1.2%～9.0%，表明該方法的準確性和重復(fù)性符合方法學要求。

表3 7種酚類環(huán)境激素的加標回收率及相對標準偏差（n=9）Table 3 Spiked recoveries and relative standard deviations（RSDs）of seven phenolic environmental hormones（n=9）

2.7 實際樣品的測定

采用本方法對湖南省8 個不同品種的柑橘樣品（宜章皇帝柑1、南豐沙糖桔2、石門蜜橘3、永興冰糖橙4、慈利紐荷爾橙5、郴州粑粑柑6、湘西椪柑7、常德蜜柚8）進行檢測。結(jié)果表明， BPF 和BPS 在所有柑橘中均未檢出。BPA 在7 種柑橘中檢出，檢出量為0.51～1.78 μg/kg；4-n-OP 在5 種柑橘中檢出，檢出量為0.37～1.21 μg/kg；4-n-NP 在3 種柑橘中檢出，檢出量為0.26～0.59 μg/kg；NP在3 種柑橘中檢出，檢出量為0.66～1.77 μg/kg；BPB 在1 種柑橘中檢出，檢出量為0.37 μg/kg（見表4）。

表4 不同品種柑橘中7種酚類環(huán)境激素的檢測結(jié)果（μg/kg）Table 4 Detection results of 7 phenolic environmental hormones in different varieties of citrus（μg/kg）

3 結(jié) 論

本研究建立了QuEChERS/高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜同時測定柑橘中7 種酚類環(huán)境激素的方法。該方法具有前處理操作簡單、方便快速、靈敏度高、檢出限低、精密度好的優(yōu)點，適用于柑橘中7 種酚類環(huán)境激素的定量分析，為水果中酚類環(huán)境激素的快速檢測提供了技術(shù)支持。