李 碩，張桂華，王郁敏，俞 英，林碧霞，張 立，曹玉娟，郭慢麗

（華南師范大學 化學學院 廣州市生物醫(yī)藥分析化學重點實驗室，廣東 廣州 510006）

自石墨烯在2004 年被發(fā)現(xiàn)以來，超薄二維（2D）納米材料引起了越來越多的研究興趣［1－2］。2D 石墨烯及其衍生物具有獨特的物理化學特性，如電導率和熒光猝滅效率高、電子流動性強等，這些特性使其在諸多領域有著廣泛的應用前景［3－4］。具有優(yōu)異性能的2D 納米材料，如二硫化鉬（MoS2）納米片［5］、黑磷納米片［6］、碳化鈦（Ti3C2）納米片［7］和氮化碳（gC3N4）納米片［8］，也已被報道并成功應用于生物傳感和生物分析。但大多數(shù)2D納米材料的合成步驟復雜，且有些在制備過程中依賴有機試劑，可能會限制其在生物醫(yī)學和生物分析中的實際應用［9－10］。另外，部分2D 納米材料水溶性差，在后續(xù)的應用過程中需改善其親水性［11－12］。同時大部分2D納米材料很難被生物降解，生物毒性較大［13－14］，這導致其在生物系統(tǒng)中的應用受到限制。

近年來，一種新興的二維過渡金屬納米材料—CoOOH 納米片引起了眾多研究領域科學家的興趣［15］。CoOOH納米片的優(yōu)點之一是可以簡單便捷地在短時間內(nèi)進行大規(guī)模制備。此外，CoOOH納米片的生物相容性好，表面具有豐富的羥基，具有良好的水分散性，這些特性使之在生物傳感和生物成像領域的應用更具優(yōu)勢［16－17］。類似于石墨烯納米片，CoOOH 納米片不具有熒光，將其應用于開發(fā)新型熒光生物傳感方法時，需要引入熒光報告分子。迄今為止，已經(jīng)報道了各種基于CoOOH 納米片與熒光無機納米材料制備的熒光納米探針［18－20］。然而，這些納米探針中的熒光無機納米材料的合成過程通常耗時且復雜，且大多數(shù)探針局限應用于抗壞血酸（AA）的檢測。因此，進一步發(fā)展基于CoOOH 納米片的熒光納米探針并擴展其生物學應用具有重要的意義。目前，研究者發(fā)現(xiàn)單鏈DNA 可通過靜電作用吸附到CoOOH 納米片表面，并報道了DNA 與CoOOH 納米片之間的相互作用［21－22］，同時基于CoOOH 納米片對有機熒光團標記的DNA的高效猝滅效率，實現(xiàn)了對多核苷酸激酶和DNA的檢測。但以上所構建的熒光生物傳感新方法仍無法克服需要用有機熒光團標記、合成成本高、標記過程復雜等固有缺點。因此基于CoOOH納米片構建新型熒光納米探針具有十分重要的意義。

蛋白質(zhì)是生命系統(tǒng)中最豐富、最重要的生物大分子，具有許多不同的功能基團、特定的氨基酸序列和二級結構［23］。此外，蛋白質(zhì)可以作為模板原位合成熒光金屬納米簇（如金、銀和銅納米簇）［24］。生物硫醇主要包括半胱氨酸（Cys）、高半胱氨酸（Hcy）和谷胱甘肽（GSH）。研究表明，人體內(nèi)生物硫醇的含量異常與多種疾病密切相關。本文研究了CoOOH 納米片與蛋白質(zhì)之間的相互作用，同時，基于CoOOH 納米片和蛋白質(zhì)模板金納米簇開發(fā)了一種新型、激活式的熒光納米探針用于生物硫醇檢測，并將其用于實際血清樣品中生物硫醇的測定，結果滿意。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

氫氧化鈉（NaOH）、氯金酸（HAuCl4）、氯化鈷、次氯酸鈉（阿拉?。ㄉ虾＃┯邢薰荆?；牛血清白蛋白（BSA）、L半胱氨酸鹽酸鹽（Cys）、L高半胱氨酸（Hcy）（美國Sigma 公司）；谷胱甘肽（GSH）（麥克林（上海）有限公司）；實驗所用試劑均為分析純；實驗用水均為超純水。

FL－4600熒光分光光度計、能量色散光譜儀（EDS）（日本日立公司）；UV－2700型紫外－可見分光光度計（日本島津公司）；場發(fā)射2100F TEM 透射電子顯微鏡（日本JEOL 公司）；Zetasizer Nano ZS90 電勢分析儀（英國Malvern公司）；Metrohm Autolab PGSTAT302 N電化學工作站（荷蘭Eco Chemie公司）。

1.2 BSA模板金納米簇（BSA@AuNCs）的合成

將5.0 mL 氯金酸（10 mmol/L）水溶液逐滴添加到5.0 mL BSA（50 mg/mL）水溶液中，并將混合物在37 ℃下劇烈攪拌。反應2 min后，逐滴加入0.5 mL氫氧化鈉溶液（1 mol/L），保持劇烈攪拌，在37 ℃下進行原位還原反應11 h。透析除去過量的氫氧化鈉和氯金酸得到純化的BSA@AuNCs。

1.3 CoOOH納米片的制備

將250μL氫氧化鈉溶液（1 mol/L）快速與1.0 mL氯化鈷溶液（10 mmol/L）混合，并將混合物在室溫下超聲處理2 min。然后，將50μL的次氯酸鈉溶液（0.9 mol/L）添加到混合物中，在室溫下超聲處理15 min后，離心棄去上清液，再用超純水洗滌，制備得到CoOOH納米片，置于4 ℃保存。

1.4 BSA@AuNCs-CoOOH 納米探針的制備

將50 μL CoOOH 納米片（0.2 mg/mL）和25 μL BSA@AuNCs 溶液（0.5 μmol/L）加入到25 μL NaAc－HAc緩沖液（80 mmol/L，pH 5.0）中，加超純水至總體積為200μL，然后將混合物在避光條件下劇烈攪拌40 min。離心去除上清液中過量的BSA@AuNCs，將制備好的BSA@AuNCs－CoOOH 納米探針重新分散在水溶液中。

1.5 定量檢測生物硫醇

在一系列離心管中依次加入75μL BSA@AuNCs－CoOOH 納米探針和25μL NaAc－HAc（10 mmol/L，pH 5.0）緩沖液，然后分別加入200μL 不同濃度（0、0.05、0.5、5、50、100、150、200、300、400、500μmol/L）的生物硫醇溶液，加超純水至總體積為500μL，混合均勻后置于37 ℃水浴鍋中反應15 min。每組平行3次，利用熒光光譜儀記錄熒光光譜。

1.6 血清樣品中生物硫醇的檢測

將1.0 mL血液樣品與1.5 mL乙腈溶液混合后于室溫下振蕩30 min，離心10 min后取上清液，使用0.22μm濾膜過濾后以超純水稀釋100倍。取50μL上述血清樣品，向其中加入150μL超純水或不同濃度的生物硫醇溶液后充分振蕩混勻后，按“1.5”實驗方法測定樣品中生物硫醇的含量。

2 結果與討論

2.1 實驗原理

基于BSA@AuNCs 和CoOOH 納米片的激活型熒光納米探針的制備及其用于生物硫醇檢測的示意圖見圖1。首先，蛋白內(nèi)部特定的氨基酸捕獲金離子形成BSA－Au 復合物，堿性條件下，酪氨酸殘基將原位螯合的金離子還原成紅色熒光的BSA@AuNCs（圖1A）；其次，帶負電的BSA@AuNCs 通過靜電作用組裝到帶正電的CoOOH 納米片表面形成BSA@AuNCs－CoOOH 納米探針，此時，由于內(nèi)濾效應（IFE），BSA@AuNCs 的熒光被CoOOH 納米片猝滅。當加入生物硫醇后，BSA@AuNCs－CoOOH 納米探針中的CoOOH 納米片與生物硫醇發(fā)生氧化還原反應，CoOOH納米片被溶解并生成Co2+，同時釋放出BSA@AuNCs，BSA@AuNCs 被猝滅的熒光信號得以恢復。因此可以通過BSA@AuNCs 熒光信號的變化來測定生物硫醇的含量。

圖1 BSA@AuNCs的合成過程（A）及BSA@AuNCs－CoOOH 納米探針的制備及用于生物硫醇檢測的原理圖（B）Fig.1 Schematic illustration of the synthetic process of BSA@AuNCs（A），and the preparation of BSA@AuNCs－CoOOH nanoprobe and its application for the detection of biothiols（B）

2.2 CoOOH 納米片與BSA@AuNCs 的相互作用及熒光猝滅機理研究

由圖2A 可見，隨著CoOOH 納米片質(zhì)量濃度的增加，BSA@AuNCs 的熒光逐漸被猝滅。據(jù)文獻報道，BSA 的等電點為4.8，理論上BSA 在pH 5.0 條件下帶負電荷［25］。如圖2B 所示，BSA 和BSA@AuNCs 均在pH 5.0 條件下帶負電，而CoOOH 納米片在相同的實驗條件下帶正電，BSA@AuNCs 與CoOOH 納米片作用后形成的BSA@AuNCs－CoOOH 納米探針則帶負電。該結果表明BSA@AuNCs 與CoOOH 納米片之間的相互作用源于靜電吸附。如圖2C 所示，CoOOH 納米片吸收光譜（黑線）與BSA@AuNCs 的熒光激發(fā)和發(fā)射光譜（藍線和紅線）存在重疊，表明熒光猝滅可能由內(nèi)濾效應（IFE）引起［19］。

圖2 加入不同質(zhì)量濃度CoOOH 后BSA@AuNCs 的熒光光譜（A），BSA、BSA@AuNCs、CoOOH 和BSA@AuNCs－CoOOH的Zeta電位（B），CoOOH的紫外可見吸收光譜（黑線）、BSA@AuNCs的熒光激發(fā)（藍線）和發(fā)射光譜（紅線）（C）；BSA@AuNCs－CoOOH的TEM圖像（D）和EDS（E）以及玻碳電極不同修飾狀態(tài)下的循環(huán)伏安曲線（F）Fig.2 Fluorescence spectra of BSA@AuNCs with addition of different amounts of CoOOH（A）；Zeta potential of BSA，BSA@AuNCs，CoOOH and BSA@AuNCs－CoOOH（B）；spectral overlap showing the UV－Vis absorption spectrum of CoOOH（black line），fluorescence excitation（blue line）and emission spectrum（red line）of the BSA@AuNCs（C）；TEM image（D）and EDS（E）of BSA@AuNCs－CoOOH nanoprobe；cyclic voltammograms（F）of bare GCE（a），CoOOH/GCE（b），BSA@AuNCs/GCE（c）and BSA@AuNCs－CoOOH/GCE（d）

圖2D 顯示，BSA@AuNCs 很好地分散在六邊形CoOOH 納米片的表面上。BSA@AuNCs－CoOOH 納米探針的能量色散光譜上出現(xiàn)Co、O、S和Au元素的特征峰（圖2E）。如圖2F所示，與玻碳電極（GCE）相比，當CoOOH 組裝在GCE 表面時，氧化還原電流峰值增大；而當BSA@AuNCs 吸附在電極表面后，氧化還原電流峰值急劇下降；當BSA@AuNCs－CoOOH 滴涂在電極表面時，氧化還原電流峰值有所減小。以上數(shù)據(jù)證實了AuNCs 和CoOOH 納米片之間的強相互作用以及BSA@AuNCs－CoOOH 納米探針的成功制備。

2.3 BSA@AuNCs-CoOOH 納米探針用于生物硫醇測定的可行性驗證

如圖3A 所示，在360 nm 光激發(fā)下，BSA@AuNCs 在650 nm 處的發(fā)射峰發(fā)出很強的熒光信號（曲線a），其水溶液在紫外光下呈亮紅色（圖3B 插圖）。相反，BSA@AuNCs－CoOOH 納米探針的熒光信號大大降低（圖3A 曲線b 和3B），對應的溶液呈無色（圖3B 插圖b）。當加入生物硫醇Cys 時，CoOOH 在400 nm 處的特征吸收峰值下降（圖3A 插圖曲線b），表明BSA@AuNCs－CoOOH 納米探針中的CoOOH 通過氧化還原反應被溶解，同時釋放出BSA@AuNCs，此時，BSA@AuNCs 在650 nm 處的強熒光信號得以恢復（圖3A 曲線c）。另外，反應混合物的顏色變?yōu)樽畛醯牧良t色（圖3B 插圖c、d、e）。

圖3 BSA@AuNCs（a）、BSA@AuNCs－CoOOH（b）和BSA@AuNCs－CoOOH+Cys（c）的熒光光譜（激發(fā)波長360 nm）（A），以及BSA@AuNCs（a）、BSA@AuNCs－CoOOH（b）、BSA@AuNCs－CoOOH+Cys（c）、BSA@AuNCs－CoOOH+GSH（d）和BSA@AuNCs－CoOOH+Hcy（e）在650 nm處的熒光峰值（B）Fig.3 Fluorescence emission spectra of BSA@AuNCs（a），BSA@AuNCs－CoOOH（b）and BSA@AuNCs－CoOOH+Cys（c）with excitation wavelength at 360 nm（A）；fluorescence peak at 650 nm（B）of BSA@AuNCs（a），BSA@AuNCs－CoOOH（b），BSA@AuNCs－CoOOH+Cys（c），BSA@AuNCs－CoOOH+GSH（d）and BSA@AuNCs－CoOOH+Hcy（e）inset A：UV－Vis absorption spectra of BSA@AuNCs－CoOOH（a）and BSA@AuNCs－CoOOH+Cys（b）；inset B：photographs of corresponding reaction mixtures under UV irradiation

利用BSA@AuNCs－CoOOH 納米探針對Cys、GSH 和Hcy 進行定量分析。如圖4 所示，隨著生物硫醇濃度從0.05μmol/L 增加至500μmol/L，BSA@AuNCs 的熒光信號逐漸恢復，且熒光峰（650 nm）強度比值（IF/IF0）與生物硫醇濃度（0.05～150 μmol/L）的對數(shù)值（lgc）呈良好的線性關系，擬合得到Cys、GSH 和Hcy 的線性方程分別為IF/IF0= 2.88 + 0.808 lgcCys（r2= 0.990）、IF/IF0= 2.80 + 1.05 lgcGSH（r2=0.998）和IF/IF0= 2.99 + 0.973 lgcHcy（r2= 0.992）。根據(jù)空白溶液3 倍標準偏差計算得到Cys、GSH和Hcy 的檢出限（LOD）為30 nmol/L。相比于其他生物硫醇的光學檢測方法，本方法具有相當或更低的檢出限［26－28］。

圖4 BSA@AuNCs－CoOOH納米探針與生物硫醇Cys（A）、GSH（B）和Hcy（C）反應的熒光響應及擬合曲線Fig.4 Fluorescence response and fitted curves of BSA@AuNCs－CoOOH nanoprobe in the presence of different concentrations of biothiols：Cys（A），GSH（B）and Hcy（C）left：fluorescence emission spectra；middle：plot of fluorescence peak intensities at 650 nm versus biothiols concentrations；right：linear plot of relative fluorescence intensity（IF/IF0）against logarithmic concentrations of added biothiols

2.4 BSA@AuNCs-CoOOH 納米探針的傳感性能

為了進一步評估本納米探針對生物硫醇檢測的特異性，選取氨基酸、金屬離子和糖類化合物作為干擾物。如圖5 所示，僅在加入生物硫醇時，探針的熒光信號得以恢復。結果表明，BSA@AuNCs－CoOOH納米探針可用于選擇性檢測生物硫醇。

圖5 BSA@AuNCs－CoOOH納米探針對生物硫醇的選擇性Fig.5 Selectivity of BSA@AuNCs－CoOOH nanoprobe toward biothiols

2.5 人血清樣品中生物硫醇的測定

為了考察該方法的實際應用能力，對人血清樣品中的生物硫醇含量進行檢測。由于Cys 是人血清中大量存在的生物硫醇，因此選擇Cys 作為分析對象［29］。檢測結果如表1 所示，其回收率為96.0%～104%，相對偏差（RSD）為1.6%～3.7%。與經(jīng)典的Ellman 方法所得結果一致，表明本方法可用于實際樣品中生物硫醇的測定。

表1 BSA@AuNCs-CoOOH 納米探針用于人血清樣品中生物硫醇的檢測Table 1 Detection of biothiols in human serum samples using BSA@AuNCs-CoOOH nanoprobe

3 結 論

本研究基于CoOOH 納米片和BSA@AuNCs 構建了一種激活型熒光納米探針，帶負電的BSA@AuNCs 可通過靜電作用組裝到帶正電荷的CoOOH 納米片的表面形成納米探針，BSA@AuNCs 的熒光信號由于IFE 被CoOOH 納米片有效猝滅。基于納米探針與生物硫醇之間的氧化還原反應，建立了一種簡單、成本低、免標記、靈敏、選擇性的熒光傳感新方法用于生物硫醇檢測，檢出限約30 nmol/L。方法可用于人血清中生物硫醇的測定，有望為相關疾病的早期診斷和生物樣品分析提供新的手段。