葛俊康，柏曉麗，郭昕鷺，祁爍霖，牛 娜，陳立鋼

（東北林業(yè)大學(xué) 化學(xué)化工與資源利用學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040）

硝磺草酮（Mesotrione）是一種可以抑制對(duì)羥苯基丙酮酸雙氧化酶活性的選擇性除草劑［1－2］，過量施加會(huì)給農(nóng)作物安全帶來潛在危害，并通過食物鏈傳遞對(duì)人體健康產(chǎn)生影響［3］，因此檢測(cè)食品中殘留硝磺草酮的含量尤為重要。硝磺草酮在高溫條件下不穩(wěn)定，常用液相色譜法進(jìn)行檢測(cè)，氣相色譜法進(jìn)行分析時(shí)須采用間接法［4］，且在色譜分析前，必須經(jīng)過操作復(fù)雜、過程繁瑣的樣品前處理過程，如固相萃取等［5］。

采用基質(zhì)固相分散（MSPD）技術(shù)萃取分析玉米中的硝磺草酮，其提取、凈化和過濾可一步完成，減少了溶劑消耗量，簡化了分析步驟［6－7］。傳統(tǒng)的MSPD 分散劑在分散復(fù)雜樣品時(shí)，存在富集效果差、特異性低等問題［8］。分子印跡聚合物（Molecularly imprinted polymer，MIP）是一種對(duì)目標(biāo)分子具有選擇性結(jié)合能力的材料，采用MIP 作為MSPD 的分散劑，可以提高對(duì)化合物的親和性，降低干擾物產(chǎn)生的影響［9］。

傳統(tǒng)制備MIP 的方法主要為本體聚合，此方法操作過程繁瑣，制備的MIP 形貌不規(guī)則［10］。與傳統(tǒng)制備方法相比，Pickering 雙乳液法制備的MIP 具有形貌規(guī)則，模板分子易洗脫等優(yōu)點(diǎn)［11－12］。在材料制備中，可引入價(jià)廉易得［13］的木質(zhì)素作為穩(wěn)定粒子。木質(zhì)素經(jīng)過油酸改性處理后，可得到穩(wěn)定的W/O Pickering 乳液粒子，親水性木質(zhì)素與疏水性木質(zhì)素可以在界面形成無表面活性劑的穩(wěn)定的W1/O/W2Pickering雙乳液［14］。

本研究以硝磺草酮為模板分子，甲基丙烯酸甲酯為功能單體，木質(zhì)素為穩(wěn)定粒子，采用Pickering雙乳液技術(shù)制備了硝磺草酮MIP，并通過動(dòng)態(tài)吸附、靜態(tài)吸附及選擇性吸附，研究了其吸附行為。將MIP用作MSPD的分散劑對(duì)樣品進(jìn)行處理，并通過高效液相色譜測(cè)定了玉米樣品中硝磺草酮的含量。本文的前處理方法快速，具有較高的選擇性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

LC－15C 高效液相色譜儀、XRD－600 X 射線衍射儀（日本島津公司）；Nicolet360 傅立葉變換紅外光譜儀（美國尼高力儀器公司）；JEM－6700 F 掃描電鏡（捷歐路科貿(mào)有限公司）；OCA 20 接觸角測(cè)量儀（北京奧德利諾有限公司）；KQ5200E 超聲波清洗器（昆山舒美超聲儀器有限公司）；HSY－B 恒溫振蕩搖床（常州金壇精達(dá)儀器制造有限公司）。

木質(zhì)素（98%，山東龍力生物科技股份有限公司）；莠去津（98%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；硝磺草酮（97%）、磺草酮（98%）（上海源葉生物科技有限公司）；色譜純乙腈（成都思為科學(xué)儀器有限公司）；甲基丙烯酸甲酯、偶氮二異丁酸二甲酯、二乙烯基苯、苯乙烯、油酸、冰醋酸、乙醇（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司），以上試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為去離子水；玉米樣品購于哈爾濱當(dāng)?shù)爻小?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分子印跡聚合物的制備準(zhǔn)確稱取3.0 g木質(zhì)素，加入30 mL去離子水中以形成木質(zhì)素分散體，以濃氨水調(diào)至pH 11.0，待木質(zhì)素完全溶解后，用1 mol/L 鹽酸調(diào)至pH 3.0，過濾并干燥，得親水性木質(zhì)素。精密量取49 mL 苯乙烯溶液，加入2.0 g 親水性木質(zhì)素，超聲處理3 min 后，再加入1 mL 油酸，并于50 ℃恒溫下磁力攪拌12 h，獲得疏水性木質(zhì)素。取0.5 mL 甲基丙烯酸甲酯、1.5 mL 二乙烯基苯、40 mg 偶氮二異丁酸二甲酯和0.4 g 硝磺草酮溶于2.0 mL 疏水性木質(zhì)素中，添加1 mL 0.1 mol/L NaCl 溶液和4.0 mL親水性木質(zhì)素分散液（稱取1.0 g親水性木質(zhì)素，分散在100 mL去離子水中，形成親水性木質(zhì)素分散液），得W1/O/W2雙乳液，于65 ℃下反應(yīng)12 h，用乙醇和水洗滌未反應(yīng)產(chǎn)物并干燥，再經(jīng)乙酸－甲醇溶液（體積比15∶85）索氏提取除去產(chǎn)物中的模板分子，干燥得MIP，制備過程如圖1所示。

圖1 MIP的制備過程示意圖Fig.1 Schematic illustration of the preparation process of MIP

非分子印跡聚合物（NIP）的制備不添加模板分子，其余步驟與上述相同。

1.2.2 吸附實(shí)驗(yàn)靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)：將20 mg MIP（或NIP）加入8 mL 不同質(zhì)量濃度（5、10、20、50、80、100、120、150、200μg/mL）硝磺草酮標(biāo)準(zhǔn)溶液中并設(shè)置空白組，于25 ℃恒溫水浴中振蕩24 h；動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)：將20 mg MIP（或NIP）加入9 組8 mL 200μg/mL 的硝磺草酮標(biāo)準(zhǔn)溶液中并設(shè)置空白組，于25 ℃恒溫水浴中振蕩不同時(shí)間（1、2、5、10、20、30、45、60、90 min）；選擇性吸附實(shí)驗(yàn)：精確稱取3份20 mg MIP（或NIP），分別加入8 mL 200μg/mL硝磺草酮標(biāo)準(zhǔn)溶液、莠去津標(biāo)準(zhǔn)溶液、煙嘧磺隆標(biāo)準(zhǔn)溶液中，于25 ℃恒溫水浴中振蕩24 h。吸附后溶液以7 000 r/min 離心5 min，取上清液過濾，進(jìn)行HPLC檢測(cè)。

1.2.3 玉米中硝磺草酮的基質(zhì)固相分散萃取精確稱取0.2 g玉米樣品和0.3 g MIP加入瑪瑙研缽中研磨10 min，再取已裝有玻璃棉墊底的萃取柱（5 mL），將研磨好的樣品放入萃取柱，樣品上方放置適量玻璃棉并壓實(shí)。以2 mL 20%甲醇水溶液淋洗，并用5 mL 5%乙酸乙腈溶液洗脫目標(biāo)物，流速為1 mL/min，洗脫液用氮?dú)獯蹈珊笥?.5 mL色譜流動(dòng)相中溶解，待測(cè)。

1.2.4 色譜條件Hypersil ODS2色譜柱（4.6 mm×150 mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈－水（體積比85∶15）；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣體積20μL；檢測(cè)波長233 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 分子印跡聚合物的表征

MIP 的傅里葉紅外光譜及掃描電鏡圖見圖2。798 cm－1和882 cm－1處的吸收峰為C—H 苯環(huán)的彎曲振動(dòng)；1 608 cm－1處的吸收峰由C—C 苯環(huán)的振動(dòng)所產(chǎn)生，說明二乙烯基苯成功參與了印跡聚合反應(yīng)。1 745 cm－1處的吸收峰代表C====O 拉伸振動(dòng)，說明甲基丙烯酸甲酯成功參與反應(yīng)。在波長3 137 cm－1和3 622 cm－1位置的強(qiáng)振動(dòng)表明木質(zhì)素含有苯酚和脂肪族羥基（圖2A）。而MIP和NIP具有類似的紅外光譜圖，表明模板分子已成功洗脫。由掃描電鏡圖可以看出MIP 形貌規(guī)則，且顆粒尺寸較大（圖2B），有助于基質(zhì)固相分散過程，避免柱壓過高。

對(duì)制備的親水性木質(zhì)素、疏水性木質(zhì)素及MIP 的接觸角進(jìn)行測(cè)量（圖2C），結(jié)果發(fā)現(xiàn)三者的接觸角大小分別為71.5°、99.9°、149.3°，這是因?yàn)槲锤男缘哪举|(zhì)素親水，有助于形成水包油乳液；而油酸吸附到木質(zhì)素表面后，使得木質(zhì)素具有疏水性；在聚合反應(yīng)后，由于二乙烯基苯和甲基丙烯酸甲酯的加入，致使MIP的接觸角最大，其疏水性表面有利于吸附低水溶性且疏水的硝磺草酮［15］。

Pickering雙乳液法制備的MIP的XRD光譜圖在2θ=20°處出現(xiàn)一個(gè)光滑的衍射峰，表明該MIP是無定形物質(zhì)（圖2D）。

圖2 MIP的紅外光譜圖（A）和掃描電鏡圖（B），親水性、疏水性木質(zhì)素以及MIP的接觸角（C）與MIP的X射線衍射譜圖（D）Fig.2 Infrared spectrum（A）and scanning electron microscope（B）of MIP，contact angle of hydrophilic，modified hydrophobic lignin and MIP（C），and X-ray diffraction pattern of MIP（D）

2.2 吸附等溫線的測(cè)定與Scatchard分析

由圖3A 可見，無論是MIP 還是NIP，對(duì)硝磺草酮的吸附量均隨其濃度遞增，但在相同濃度下，MIP的吸附效果遠(yuǎn)高于NIP，表明MIP上所形成的分子印跡空穴使其特定識(shí)別和吸附模板分子的能力增強(qiáng)。采用Scatchard分析聚合物的吸附情況［16］，公式如下：

圖3 MIP和NIP的吸附等溫線（A），MIP（B）和NIP（C）的Scatchard分析曲線Fig.3 Adsorption isotherms of MIP and NIP（A），Scatchard analysis curves of MIP（B）and NIP（C）

式中，Q為聚合物吸附硝磺草酮的容量大?。╩g/g）；C為平衡時(shí)硝磺草酮的質(zhì)量濃度（μg/L）；Qmax為聚合物吸附硝磺草酮的最大容量（mg/g）；Kd為結(jié)合位點(diǎn)的解離常數(shù)（mg/L）。

以Q/C對(duì)Q作圖得Scatchard 分析曲線，如圖3B 所示，MIP 的Scatchard 分析曲線具有兩種不同的斜率，表明MIP對(duì)硝磺草酮的吸附具有兩種不同的結(jié)合位點(diǎn)，由兩條擬合直線可求得截距和斜率分別為：Qmax1= 32.31 mg/g，Kd1= 116.28 mg/L；Qmax2= 89.99 mg/g，Kd2= 413.22 mg/L；則本實(shí)驗(yàn)制備的MIP 對(duì)硝磺草酮的吸附容量（Qmax1+Qmax2）為122.30 mg/g。此外，NIP 的Scatchard 分析曲線（圖3C）具有良好的線性關(guān)系，表明NIP 對(duì)于硝磺草酮的吸附是均勻的，僅存在一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。由擬合直線的截距和斜率求得：Qmax=31.62 mg/g，Kd=270.27 mg/L。比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，MIP的最大表觀結(jié)合量遠(yuǎn)高于NIP。

2.3 吸附動(dòng)力學(xué)曲線的測(cè)定

從圖4A 可知，MIP 和NIP 對(duì)硝磺草酮的吸附能力隨時(shí)間延長而增強(qiáng)，而MIP 的硝磺草酮吸附量始終大于NIP。由于分子印跡孔穴較多，最初的40 min 內(nèi)MIP 的吸附率很高，而60 min 后，大多數(shù)印跡孔穴已被填充，因此MIP 的吸附速率達(dá)到平衡和穩(wěn)定。40～60 min 的快速平衡表明MIP 結(jié)合位點(diǎn)對(duì)硝磺草酮具有良好的親和力。

圖4 MIP和NIP的動(dòng)力學(xué)吸附（A）、準(zhǔn)一級(jí)動(dòng)力學(xué)（B）和準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)（C）Fig.4 Kinetic adsorption（A），quasi first order kinetics（B）and quasi second order kinetics（C）of MIP and NIP

分別采用準(zhǔn)一級(jí)、準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)反應(yīng)對(duì)MIP和NIP進(jìn)行擬合計(jì)算［17－18］，擬合方程如下：

式中，Qt為不同時(shí)間的吸附量（mg/g）；Qe為平衡時(shí)的吸附量（mg/g）；k1、k2分別是準(zhǔn)一級(jí)、準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)的速率常數(shù)（min－1）。

通過ln（Qe－Qt）對(duì)t擬合計(jì)算，獲得準(zhǔn)一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程，如圖4B所示，MIP和NIP的線性方程分別為y=－0.008 7x+3.435，r2=0.879 1；y=－0.014 9x+2.577 2，r2=0.781 3；以t/Qt對(duì)t擬合可獲得如圖4C所示的MIP、NIP 的準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)方程：y=0.041 8x+0.912 7，r2=0.999 1；y=0.075 8x+2.158 9，r2=0.999 9。由準(zhǔn)一級(jí)和準(zhǔn)二級(jí)擬合曲線的r2分析比較可得，MIP和NIP吸附硝磺草酮的過程較切合準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型。

2.4 吸附選擇性的研究

本實(shí)驗(yàn)采用磺草酮為類似物，莠去津?yàn)閰⒄瘴铮骄縈IP的選擇性吸附性能，其分子結(jié)構(gòu)如圖5A所示。結(jié)合圖5B 及表1數(shù)據(jù)可見，在吸附硝磺草酮的過程中，MIP 對(duì)硝磺草酮的吸附能力遠(yuǎn)大于NIP，表明制備的MIP對(duì)硝磺草酮具有更好的選擇吸附性；MIP對(duì)磺草酮的吸附能力也明顯高于NIP，這歸因于磺草酮和硝磺草酮的結(jié)構(gòu)相似。為了深入研究MIP的選擇能力，通過公式（4）、（5）、（6）計(jì)算選擇性參數(shù)；得其分配系數(shù)（δ）、選擇因子（α）和相對(duì)選擇因子（β）關(guān)系如下：

圖5 莠去津、硝磺草酮、磺草酮的結(jié)構(gòu)式（A）與MIP和NIP的選擇性吸附結(jié)果（B）Fig.5 Structural formula of atrazine，mesotrione and sulcotrione（A）and their selective adsorption results by MIP and NIP（B）

式中，Q和C分別代表聚合物的吸附量以及溶液原濃度，δ1和δ2分別代表硝磺草酮和莠去津的靜態(tài)分布系數(shù)，α1和α2為聚合物的選擇性系數(shù)。

如表1 所示，MIP 的相對(duì)選擇因子β為2.510，表明成功制備了選擇性較高的聚合物。這是由于MIP 中的互補(bǔ)孔穴可以特異性識(shí)別模板分子。但莠去津與孔穴不能形成互補(bǔ)，所以其吸附量在MIP 和NIP上無明顯區(qū)別。

表1 MIP和NIP選擇性系數(shù)比較Table 1 Comparison of MIP and NIP selectivity coefficients

2.5 基質(zhì)固相分散條件的選擇

2.5.1 樣品比例的選擇實(shí)驗(yàn)研究了分散劑與樣品的質(zhì)量比（1∶2、2∶3、1∶1、3∶2、2∶1）對(duì)結(jié)果的影響。結(jié)果顯示：分散劑與玉米樣品質(zhì)量比選擇3∶2 和2∶1 時(shí)，硝磺草酮的回收率均較大（分別為95.8%、96.2%）。為節(jié)約分散劑用量，最終選擇分散劑與樣品的質(zhì)量比為3∶2。

2.5.2 研磨時(shí)間的確定研磨可使分散劑與待提取樣品充分接觸，實(shí)驗(yàn)考察了不同研磨時(shí)間（2、5、10、15 min）時(shí)硝磺草酮的回收率。發(fā)現(xiàn)研磨10 min 時(shí)回收率最大（96.8%），繼續(xù)延長研磨時(shí)間回收率無明顯提高，因此實(shí)驗(yàn)選擇研磨10 min。

2.5.3 淋洗劑、洗脫劑及其最佳體積的確定實(shí)驗(yàn)考察了5 種（水、20%乙腈水溶液、20%甲醇水溶液、50%乙腈水溶液、50%甲醇水溶液）淋洗劑對(duì)MIP 吸附選擇性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，純水和20%甲醇水溶液得到的硝磺草酮回收率最大（分別為97.6%、97.3%），但純水作為淋洗劑時(shí)，很難洗去雜質(zhì)，故最佳淋洗劑選用20%甲醇水溶液。實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步考察了20%甲醇水溶液用量（1～7 mL）對(duì)結(jié)果的影響，發(fā)現(xiàn)2 mL用量時(shí)硝磺草酮的回收率最大。

實(shí)驗(yàn)考察了甲醇、乙酸、乙腈、1%乙酸乙腈、2%乙酸乙腈、5%乙酸乙腈為洗脫劑時(shí)對(duì)檢測(cè)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：5%乙酸乙腈溶液的洗脫效果最佳（96.3%），且其用量為1～5 mL時(shí)，回收率升高較快，用量為5～7 mL時(shí)，回收率保持較高值且趨于穩(wěn)定。為節(jié)約試劑，最佳洗脫劑體積選擇5 mL。

2.6 分析方法的評(píng)價(jià)與應(yīng)用

在最佳檢測(cè)條件下，得到硝磺草酮的回歸方程為：A=111 872c－1 110.7（A為峰面積；c為硝磺草酮的含量，μg/g），r2=0.999 8，線性范圍為0.05～10μg/g，檢出限（S/N=3）為0.018μg/g。根據(jù)食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)，玉米中硝磺草酮的最大殘留值為0.5 mg/kg［19］，所以本方法符合檢測(cè)要求。為進(jìn)一步評(píng)估方法準(zhǔn)確度和精密度，使用本方法對(duì)加標(biāo)玉米樣品進(jìn)行檢測(cè)，得到回收率為97.0%～98.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.70%～5.6%。其加標(biāo)樣品的色譜圖如圖6所示。

采用本方法測(cè)定哈爾濱當(dāng)?shù)爻惺惺? 種玉米中的硝磺草酮含量。結(jié)果顯示，3 種樣品中均未檢出硝磺草酮，隨后對(duì)玉米樣品在3 個(gè)水平下（0.05、0.30、5.00 μg/g）進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，得其回收率為97.5%～98.6%，RSD 為2.5%～4.8%。因此本實(shí)驗(yàn)所采用的檢測(cè)方法在分離分析硝磺草酮方面具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

3 結(jié) 論

本文以硝磺草酮為模板分子，木質(zhì)素為穩(wěn)定粒子，采用Pickering 雙乳液法制備了MIP，對(duì)其進(jìn)行靜態(tài)吸附、動(dòng)態(tài)吸附、選擇性吸附性能研究，并將其作為MSPD 的分散劑，萃取玉米中的硝磺草酮。結(jié)果顯示：MIP 對(duì)硝磺草酮具有良好吸附作用，且動(dòng)態(tài)吸附過程符合準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)反應(yīng)模型。本實(shí)驗(yàn)通過使用分子印跡聚合及基質(zhì)固相分散技術(shù)，提高了分析檢測(cè)效率，使木質(zhì)素得到有效利用，有很好的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。