葛俊康,柏曉麗,郭昕鷺,祁爍霖,牛 娜,陳立鋼
(東北林業(yè)大學(xué) 化學(xué)化工與資源利用學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150040)
硝磺草酮(Mesotrione)是一種可以抑制對(duì)羥苯基丙酮酸雙氧化酶活性的選擇性除草劑[1-2],過量施加會(huì)給農(nóng)作物安全帶來潛在危害,并通過食物鏈傳遞對(duì)人體健康產(chǎn)生影響[3],因此檢測(cè)食品中殘留硝磺草酮的含量尤為重要。硝磺草酮在高溫條件下不穩(wěn)定,常用液相色譜法進(jìn)行檢測(cè),氣相色譜法進(jìn)行分析時(shí)須采用間接法[4],且在色譜分析前,必須經(jīng)過操作復(fù)雜、過程繁瑣的樣品前處理過程,如固相萃取等[5]。
采用基質(zhì)固相分散(MSPD)技術(shù)萃取分析玉米中的硝磺草酮,其提取、凈化和過濾可一步完成,減少了溶劑消耗量,簡化了分析步驟[6-7]。傳統(tǒng)的MSPD 分散劑在分散復(fù)雜樣品時(shí),存在富集效果差、特異性低等問題[8]。分子印跡聚合物(Molecularly imprinted polymer,MIP)是一種對(duì)目標(biāo)分子具有選擇性結(jié)合能力的材料,采用MIP 作為MSPD 的分散劑,可以提高對(duì)化合物的親和性,降低干擾物產(chǎn)生的影響[9]。
傳統(tǒng)制備MIP 的方法主要為本體聚合,此方法操作過程繁瑣,制備的MIP 形貌不規(guī)則[10]。與傳統(tǒng)制備方法相比,Pickering 雙乳液法制備的MIP 具有形貌規(guī)則,模板分子易洗脫等優(yōu)點(diǎn)[11-12]。在材料制備中,可引入價(jià)廉易得[13]的木質(zhì)素作為穩(wěn)定粒子。木質(zhì)素經(jīng)過油酸改性處理后,可得到穩(wěn)定的W/O Pickering 乳液粒子,親水性木質(zhì)素與疏水性木質(zhì)素可以在界面形成無表面活性劑的穩(wěn)定的W1/O/W2Pickering雙乳液[14]。
本研究以硝磺草酮為模板分子,甲基丙烯酸甲酯為功能單體,木質(zhì)素為穩(wěn)定粒子,采用Pickering雙乳液技術(shù)制備了硝磺草酮MIP,并通過動(dòng)態(tài)吸附、靜態(tài)吸附及選擇性吸附,研究了其吸附行為。將MIP用作MSPD的分散劑對(duì)樣品進(jìn)行處理,并通過高效液相色譜測(cè)定了玉米樣品中硝磺草酮的含量。本文的前處理方法快速,具有較高的選擇性。
LC-15C 高效液相色譜儀、XRD-600 X 射線衍射儀(日本島津公司);Nicolet360 傅立葉變換紅外光譜儀(美國尼高力儀器公司);JEM-6700 F 掃描電鏡(捷歐路科貿(mào)有限公司);OCA 20 接觸角測(cè)量儀(北京奧德利諾有限公司);KQ5200E 超聲波清洗器(昆山舒美超聲儀器有限公司);HSY-B 恒溫振蕩搖床(常州金壇精達(dá)儀器制造有限公司)。
木質(zhì)素(98%,山東龍力生物科技股份有限公司);莠去津(98%,上海阿拉丁生化科技股份有限公司);硝磺草酮(97%)、磺草酮(98%)(上海源葉生物科技有限公司);色譜純乙腈(成都思為科學(xué)儀器有限公司);甲基丙烯酸甲酯、偶氮二異丁酸二甲酯、二乙烯基苯、苯乙烯、油酸、冰醋酸、乙醇(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司),以上試劑均為分析純;實(shí)驗(yàn)用水為去離子水;玉米樣品購于哈爾濱當(dāng)?shù)爻小?/p>
1.2.1 分子印跡聚合物的制備準(zhǔn)確稱取3.0 g木質(zhì)素,加入30 mL去離子水中以形成木質(zhì)素分散體,以濃氨水調(diào)至pH 11.0,待木質(zhì)素完全溶解后,用1 mol/L 鹽酸調(diào)至pH 3.0,過濾并干燥,得親水性木質(zhì)素。精密量取49 mL 苯乙烯溶液,加入2.0 g 親水性木質(zhì)素,超聲處理3 min 后,再加入1 mL 油酸,并于50 ℃恒溫下磁力攪拌12 h,獲得疏水性木質(zhì)素。取0.5 mL 甲基丙烯酸甲酯、1.5 mL 二乙烯基苯、40 mg 偶氮二異丁酸二甲酯和0.4 g 硝磺草酮溶于2.0 mL 疏水性木質(zhì)素中,添加1 mL 0.1 mol/L NaCl 溶液和4.0 mL親水性木質(zhì)素分散液(稱取1.0 g親水性木質(zhì)素,分散在100 mL去離子水中,形成親水性木質(zhì)素分散液),得W1/O/W2雙乳液,于65 ℃下反應(yīng)12 h,用乙醇和水洗滌未反應(yīng)產(chǎn)物并干燥,再經(jīng)乙酸-甲醇溶液(體積比15∶85)索氏提取除去產(chǎn)物中的模板分子,干燥得MIP,制備過程如圖1所示。
圖1 MIP的制備過程示意圖Fig.1 Schematic illustration of the preparation process of MIP
非分子印跡聚合物(NIP)的制備不添加模板分子,其余步驟與上述相同。
1.2.2 吸附實(shí)驗(yàn)靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn):將20 mg MIP(或NIP)加入8 mL 不同質(zhì)量濃度(5、10、20、50、80、100、120、150、200μg/mL)硝磺草酮標(biāo)準(zhǔn)溶液中并設(shè)置空白組,于25 ℃恒溫水浴中振蕩24 h;動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn):將20 mg MIP(或NIP)加入9 組8 mL 200μg/mL 的硝磺草酮標(biāo)準(zhǔn)溶液中并設(shè)置空白組,于25 ℃恒溫水浴中振蕩不同時(shí)間(1、2、5、10、20、30、45、60、90 min);選擇性吸附實(shí)驗(yàn):精確稱取3份20 mg MIP(或NIP),分別加入8 mL 200μg/mL硝磺草酮標(biāo)準(zhǔn)溶液、莠去津標(biāo)準(zhǔn)溶液、煙嘧磺隆標(biāo)準(zhǔn)溶液中,于25 ℃恒溫水浴中振蕩24 h。吸附后溶液以7 000 r/min 離心5 min,取上清液過濾,進(jìn)行HPLC檢測(cè)。
1.2.3 玉米中硝磺草酮的基質(zhì)固相分散萃取精確稱取0.2 g玉米樣品和0.3 g MIP加入瑪瑙研缽中研磨10 min,再取已裝有玻璃棉墊底的萃取柱(5 mL),將研磨好的樣品放入萃取柱,樣品上方放置適量玻璃棉并壓實(shí)。以2 mL 20%甲醇水溶液淋洗,并用5 mL 5%乙酸乙腈溶液洗脫目標(biāo)物,流速為1 mL/min,洗脫液用氮?dú)獯蹈珊笥?.5 mL色譜流動(dòng)相中溶解,待測(cè)。
1.2.4 色譜條件Hypersil ODS2色譜柱(4.6 mm×150 mm,5μm);流動(dòng)相:乙腈-水(體積比85∶15);流速1.0 mL/min;進(jìn)樣體積20μL;檢測(cè)波長233 nm。
MIP 的傅里葉紅外光譜及掃描電鏡圖見圖2。798 cm-1和882 cm-1處的吸收峰為C—H 苯環(huán)的彎曲振動(dòng);1 608 cm-1處的吸收峰由C—C 苯環(huán)的振動(dòng)所產(chǎn)生,說明二乙烯基苯成功參與了印跡聚合反應(yīng)。1 745 cm-1處的吸收峰代表C====O 拉伸振動(dòng),說明甲基丙烯酸甲酯成功參與反應(yīng)。在波長3 137 cm-1和3 622 cm-1位置的強(qiáng)振動(dòng)表明木質(zhì)素含有苯酚和脂肪族羥基(圖2A)。而MIP和NIP具有類似的紅外光譜圖,表明模板分子已成功洗脫。由掃描電鏡圖可以看出MIP 形貌規(guī)則,且顆粒尺寸較大(圖2B),有助于基質(zhì)固相分散過程,避免柱壓過高。
對(duì)制備的親水性木質(zhì)素、疏水性木質(zhì)素及MIP 的接觸角進(jìn)行測(cè)量(圖2C),結(jié)果發(fā)現(xiàn)三者的接觸角大小分別為71.5°、99.9°、149.3°,這是因?yàn)槲锤男缘哪举|(zhì)素親水,有助于形成水包油乳液;而油酸吸附到木質(zhì)素表面后,使得木質(zhì)素具有疏水性;在聚合反應(yīng)后,由于二乙烯基苯和甲基丙烯酸甲酯的加入,致使MIP的接觸角最大,其疏水性表面有利于吸附低水溶性且疏水的硝磺草酮[15]。
Pickering雙乳液法制備的MIP的XRD光譜圖在2θ=20°處出現(xiàn)一個(gè)光滑的衍射峰,表明該MIP是無定形物質(zhì)(圖2D)。
圖2 MIP的紅外光譜圖(A)和掃描電鏡圖(B),親水性、疏水性木質(zhì)素以及MIP的接觸角(C)與MIP的X射線衍射譜圖(D)Fig.2 Infrared spectrum(A)and scanning electron microscope(B)of MIP,contact angle of hydrophilic,modified hydrophobic lignin and MIP(C),and X-ray diffraction pattern of MIP(D)
由圖3A 可見,無論是MIP 還是NIP,對(duì)硝磺草酮的吸附量均隨其濃度遞增,但在相同濃度下,MIP的吸附效果遠(yuǎn)高于NIP,表明MIP上所形成的分子印跡空穴使其特定識(shí)別和吸附模板分子的能力增強(qiáng)。采用Scatchard分析聚合物的吸附情況[16],公式如下:
圖3 MIP和NIP的吸附等溫線(A),MIP(B)和NIP(C)的Scatchard分析曲線Fig.3 Adsorption isotherms of MIP and NIP(A),Scatchard analysis curves of MIP(B)and NIP(C)
式中,Q為聚合物吸附硝磺草酮的容量大?。╩g/g);C為平衡時(shí)硝磺草酮的質(zhì)量濃度(μg/L);Qmax為聚合物吸附硝磺草酮的最大容量(mg/g);Kd為結(jié)合位點(diǎn)的解離常數(shù)(mg/L)。
以Q/C對(duì)Q作圖得Scatchard 分析曲線,如圖3B 所示,MIP 的Scatchard 分析曲線具有兩種不同的斜率,表明MIP對(duì)硝磺草酮的吸附具有兩種不同的結(jié)合位點(diǎn),由兩條擬合直線可求得截距和斜率分別為:Qmax1= 32.31 mg/g,Kd1= 116.28 mg/L;Qmax2= 89.99 mg/g,Kd2= 413.22 mg/L;則本實(shí)驗(yàn)制備的MIP 對(duì)硝磺草酮的吸附容量(Qmax1+Qmax2)為122.30 mg/g。此外,NIP 的Scatchard 分析曲線(圖3C)具有良好的線性關(guān)系,表明NIP 對(duì)于硝磺草酮的吸附是均勻的,僅存在一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。由擬合直線的截距和斜率求得:Qmax=31.62 mg/g,Kd=270.27 mg/L。比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,MIP的最大表觀結(jié)合量遠(yuǎn)高于NIP。
從圖4A 可知,MIP 和NIP 對(duì)硝磺草酮的吸附能力隨時(shí)間延長而增強(qiáng),而MIP 的硝磺草酮吸附量始終大于NIP。由于分子印跡孔穴較多,最初的40 min 內(nèi)MIP 的吸附率很高,而60 min 后,大多數(shù)印跡孔穴已被填充,因此MIP 的吸附速率達(dá)到平衡和穩(wěn)定。40~60 min 的快速平衡表明MIP 結(jié)合位點(diǎn)對(duì)硝磺草酮具有良好的親和力。
圖4 MIP和NIP的動(dòng)力學(xué)吸附(A)、準(zhǔn)一級(jí)動(dòng)力學(xué)(B)和準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)(C)Fig.4 Kinetic adsorption(A),quasi first order kinetics(B)and quasi second order kinetics(C)of MIP and NIP
分別采用準(zhǔn)一級(jí)、準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)反應(yīng)對(duì)MIP和NIP進(jìn)行擬合計(jì)算[17-18],擬合方程如下:
式中,Qt為不同時(shí)間的吸附量(mg/g);Qe為平衡時(shí)的吸附量(mg/g);k1、k2分別是準(zhǔn)一級(jí)、準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)的速率常數(shù)(min-1)。
通過ln(Qe-Qt)對(duì)t擬合計(jì)算,獲得準(zhǔn)一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程,如圖4B所示,MIP和NIP的線性方程分別為y=-0.008 7x+3.435,r2=0.879 1;y=-0.014 9x+2.577 2,r2=0.781 3;以t/Qt對(duì)t擬合可獲得如圖4C所示的MIP、NIP 的準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)方程:y=0.041 8x+0.912 7,r2=0.999 1;y=0.075 8x+2.158 9,r2=0.999 9。由準(zhǔn)一級(jí)和準(zhǔn)二級(jí)擬合曲線的r2分析比較可得,MIP和NIP吸附硝磺草酮的過程較切合準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型。
本實(shí)驗(yàn)采用磺草酮為類似物,莠去津?yàn)閰⒄瘴铮骄縈IP的選擇性吸附性能,其分子結(jié)構(gòu)如圖5A所示。結(jié)合圖5B 及表1數(shù)據(jù)可見,在吸附硝磺草酮的過程中,MIP 對(duì)硝磺草酮的吸附能力遠(yuǎn)大于NIP,表明制備的MIP對(duì)硝磺草酮具有更好的選擇吸附性;MIP對(duì)磺草酮的吸附能力也明顯高于NIP,這歸因于磺草酮和硝磺草酮的結(jié)構(gòu)相似。為了深入研究MIP的選擇能力,通過公式(4)、(5)、(6)計(jì)算選擇性參數(shù);得其分配系數(shù)(δ)、選擇因子(α)和相對(duì)選擇因子(β)關(guān)系如下:
圖5 莠去津、硝磺草酮、磺草酮的結(jié)構(gòu)式(A)與MIP和NIP的選擇性吸附結(jié)果(B)Fig.5 Structural formula of atrazine,mesotrione and sulcotrione(A)and their selective adsorption results by MIP and NIP(B)
式中,Q和C分別代表聚合物的吸附量以及溶液原濃度,δ1和δ2分別代表硝磺草酮和莠去津的靜態(tài)分布系數(shù),α1和α2為聚合物的選擇性系數(shù)。
如表1 所示,MIP 的相對(duì)選擇因子β為2.510,表明成功制備了選擇性較高的聚合物。這是由于MIP 中的互補(bǔ)孔穴可以特異性識(shí)別模板分子。但莠去津與孔穴不能形成互補(bǔ),所以其吸附量在MIP 和NIP上無明顯區(qū)別。
表1 MIP和NIP選擇性系數(shù)比較Table 1 Comparison of MIP and NIP selectivity coefficients
2.5.1 樣品比例的選擇實(shí)驗(yàn)研究了分散劑與樣品的質(zhì)量比(1∶2、2∶3、1∶1、3∶2、2∶1)對(duì)結(jié)果的影響。結(jié)果顯示:分散劑與玉米樣品質(zhì)量比選擇3∶2 和2∶1 時(shí),硝磺草酮的回收率均較大(分別為95.8%、96.2%)。為節(jié)約分散劑用量,最終選擇分散劑與樣品的質(zhì)量比為3∶2。
2.5.2 研磨時(shí)間的確定研磨可使分散劑與待提取樣品充分接觸,實(shí)驗(yàn)考察了不同研磨時(shí)間(2、5、10、15 min)時(shí)硝磺草酮的回收率。發(fā)現(xiàn)研磨10 min 時(shí)回收率最大(96.8%),繼續(xù)延長研磨時(shí)間回收率無明顯提高,因此實(shí)驗(yàn)選擇研磨10 min。
2.5.3 淋洗劑、洗脫劑及其最佳體積的確定實(shí)驗(yàn)考察了5 種(水、20%乙腈水溶液、20%甲醇水溶液、50%乙腈水溶液、50%甲醇水溶液)淋洗劑對(duì)MIP 吸附選擇性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),純水和20%甲醇水溶液得到的硝磺草酮回收率最大(分別為97.6%、97.3%),但純水作為淋洗劑時(shí),很難洗去雜質(zhì),故最佳淋洗劑選用20%甲醇水溶液。實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步考察了20%甲醇水溶液用量(1~7 mL)對(duì)結(jié)果的影響,發(fā)現(xiàn)2 mL用量時(shí)硝磺草酮的回收率最大。
實(shí)驗(yàn)考察了甲醇、乙酸、乙腈、1%乙酸乙腈、2%乙酸乙腈、5%乙酸乙腈為洗脫劑時(shí)對(duì)檢測(cè)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn):5%乙酸乙腈溶液的洗脫效果最佳(96.3%),且其用量為1~5 mL時(shí),回收率升高較快,用量為5~7 mL時(shí),回收率保持較高值且趨于穩(wěn)定。為節(jié)約試劑,最佳洗脫劑體積選擇5 mL。
在最佳檢測(cè)條件下,得到硝磺草酮的回歸方程為:A=111 872c-1 110.7(A為峰面積;c為硝磺草酮的含量,μg/g),r2=0.999 8,線性范圍為0.05~10μg/g,檢出限(S/N=3)為0.018μg/g。根據(jù)食品安全國家標(biāo)準(zhǔn),玉米中硝磺草酮的最大殘留值為0.5 mg/kg[19],所以本方法符合檢測(cè)要求。為進(jìn)一步評(píng)估方法準(zhǔn)確度和精密度,使用本方法對(duì)加標(biāo)玉米樣品進(jìn)行檢測(cè),得到回收率為97.0%~98.4%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.70%~5.6%。其加標(biāo)樣品的色譜圖如圖6所示。
采用本方法測(cè)定哈爾濱當(dāng)?shù)爻惺惺? 種玉米中的硝磺草酮含量。結(jié)果顯示,3 種樣品中均未檢出硝磺草酮,隨后對(duì)玉米樣品在3 個(gè)水平下(0.05、0.30、5.00 μg/g)進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn),得其回收率為97.5%~98.6%,RSD 為2.5%~4.8%。因此本實(shí)驗(yàn)所采用的檢測(cè)方法在分離分析硝磺草酮方面具有一定的應(yīng)用價(jià)值。
本文以硝磺草酮為模板分子,木質(zhì)素為穩(wěn)定粒子,采用Pickering 雙乳液法制備了MIP,對(duì)其進(jìn)行靜態(tài)吸附、動(dòng)態(tài)吸附、選擇性吸附性能研究,并將其作為MSPD 的分散劑,萃取玉米中的硝磺草酮。結(jié)果顯示:MIP 對(duì)硝磺草酮具有良好吸附作用,且動(dòng)態(tài)吸附過程符合準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)反應(yīng)模型。本實(shí)驗(yàn)通過使用分子印跡聚合及基質(zhì)固相分散技術(shù),提高了分析檢測(cè)效率,使木質(zhì)素得到有效利用,有很好的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。