王林燕，王 博，裴艷玲，盛振華，陳森淼，關(guān) 旸*

（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué) 中醫(yī)藥科學(xué)院，浙江 杭州 310053；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310053；3.河北鑫民和質(zhì)檢技術(shù)服務(wù)有限公司，河北 保定 071200）

防風(fēng)為傘形科植物防風(fēng)（Saposhnikovia divaricate（Turcz.）Schisck）未抽花莖植株的干燥根，味辛、微甘，性溫，具有解表祛風(fēng)、止痙、勝濕之功效［1］。防風(fēng)藥用歷史悠久，在《神農(nóng)本草經(jīng)》中被列為上品［2］，主治外感風(fēng)寒、周身疼痛、頭痛目眩、風(fēng)寒濕痹、骨節(jié)疼痛等證，為常用中藥材［3］。防風(fēng)化學(xué)成分復(fù)雜，主要含色原酮類、香豆素類、多糖和揮發(fā)油等［4］。其中揮發(fā)油具有抗炎鎮(zhèn)痛的作用，是防風(fēng)的主要有效成分之一［5］。

氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用（GC－MS）是分析揮發(fā)油種類和含量的主要技術(shù)手段［6－10］。GC－Q/TOF MS 相比常規(guī)的GC－MS具有更高的準(zhǔn)確度和分辨率，定性能力也有所提高［11］，但傳統(tǒng)氣質(zhì)聯(lián)用儀使用70 eV的電子電離源（EI），基本只能得到碎片離子信息，對未知物的分析也多局限于NIST 譜庫比對［12］和PCDL 庫篩查［13］，如何準(zhǔn)確鑒定NIST 譜庫未收錄的化合物是需要關(guān)注的問題。未知物結(jié)構(gòu)鑒定首先需確定化合物的相對分子質(zhì)量，因此需要“軟電離源”，獲得分子離子峰。目前常用的方法是用化學(xué)電離（CI）源代替EI 源［14］，但離子源之間的切換費(fèi)時耗力，儀器參數(shù)需進(jìn)行不斷調(diào)整。本文將采取低能量（Lower energy）電子電離源模式，在不切換離子源的情況下實(shí)現(xiàn)“軟電離”，獲得化合物的分子離子峰；同時使用MS/MS 采集方式，分析分子離子峰的二級碎片，以更好地探索未知化學(xué)樣品［15］，得到全面完整的結(jié)構(gòu)信息，彌補(bǔ)GC－MS在結(jié)構(gòu)鑒定中的局限和不足。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與樣品

Agilent 7250 GC－Q/TOF MS（安捷倫科技公司，美國），移液器、高速離心機(jī)（Eppendorf 公司，德國）。乙酸乙酯（HPLC級，Scharlau）。防風(fēng)飲片（浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片廠，批號：200901）。

1.2 防風(fēng)揮發(fā)油提取及供試品溶液制備

取防風(fēng)粉末（40 目）約300 g，置于5 L 的圓底燒瓶中，加蒸餾水2 400 mL 浸泡12 h，按照中國藥典2020 年版四部［16］通則揮發(fā)油測定法甲法蒸餾得到揮發(fā)油。以乙酸乙酯溶解，12 000 r/min 離心15 min，取上清液裝入進(jìn)樣瓶。

1.3 色譜－質(zhì)譜條件

色譜條件：DB－5MS毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25μm，美國安捷倫公司）。程序升溫過程：起始溫度為55 ℃，以6 ℃/min 升溫至250 ℃，維持5 min。載氣：氦氣，純度99.999%，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣口溫度：250 ℃，進(jìn)樣量：1μL，分流比：20∶1。

質(zhì)譜條件：Standard 模式：EI 源電壓：70 eV；離子源溫度：200 ℃；GC－MS 接口溫度：250 ℃；數(shù)據(jù)掃描方式：TOF－Scan 全掃描，一級質(zhì)譜質(zhì)量掃描范圍m/z30～500，采集速率5 spectrum/s；溶劑延遲：3.5 min。

Lower energy 模式：EI 源電壓分別為10、12、15 eV；離子源溫度：200 ℃；GC－MS 接口溫度：250 ℃；數(shù)據(jù)掃描方式：TOF－Scan全掃描，一級質(zhì)譜質(zhì)量掃描范圍m/z30～500，采集速率5 spectrum/s；溶劑延遲：3.5 min。

MS/MS模式：EI源電壓：70 eV；離子源溫度：200 ℃；GC－MS接口溫度：250 ℃；前驅(qū)離子分別為270.255 9、228.208 9、152.121 2、218.167 6、220.182 3和224.182 4，二級質(zhì)譜質(zhì)量掃描范圍m/z30～300，采集速率5 spectrum/s；碰撞能量（CE）：20 V；溶劑延遲：3.5 min。

1.4 數(shù)據(jù)分析

一級質(zhì)譜數(shù)據(jù)處理由Unknown Analysis 和MassHunter Qualitative Analysis 軟件完成；二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)通過MassHunter Qualitative Analysis 和Molecular Strcture Correlator（MSC）軟件分析。通過NIST 14 和Chemspider譜庫檢索數(shù)據(jù)，采用峰面積歸一化法計(jì)算各化合物的相對含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)電離源結(jié)合NIST 譜庫分析鑒定防風(fēng)揮發(fā)油成分

揮發(fā)油的總離子流圖見圖1。將采集的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Unknown Analysis 軟件，進(jìn)行解卷積，減少共流出的干擾。與NIST 14 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫進(jìn)行匹配，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)和人工圖譜解析，共鑒定出防風(fēng)揮發(fā)油成分82 種，其相對含量約占總揮發(fā)油含量的80%，分析結(jié)果見表1。

圖1 防風(fēng)揮發(fā)油總離子流圖Fig.1 The total ion current of the volatile oil of Saposhnikovia divaricate

表1 防風(fēng)揮發(fā)油鑒定結(jié)果Table 1 The identification of the volatile oil of Saposhnikovia divaricate

（續(xù)表1）

（續(xù)表1）

由表1 可知，防風(fēng)揮發(fā)油中相對含量較高的化合物分別是人參炔醇、異丁香烯、鐮葉芹酮、棕櫚酸和亞油酸，其相對含量占揮發(fā)油總量的60%。防風(fēng)揮發(fā)油的化合物種類主要有烴類化合物19 種，醛酮類18種，醇類17種，酸類16種，酯類8種，以及其他類化合物。

2.2 低能量電離源結(jié)合二級質(zhì)譜對NIST譜庫中鑒定的化合物進(jìn)行驗(yàn)證

2.2.1 采用低能量電離源模式驗(yàn)證化合物的分子離子峰選擇2，4-癸二烯醛（RT=12.816 1）、肉豆蔻酸（RT=22.066 8）和棕櫚酸甲酯（RT=24.916 9）3 個分離度較好、分子離子峰較顯著的化合物進(jìn)行驗(yàn)證。在15、12、10 eV 3 種不同的離子源電壓下觀察準(zhǔn)分子離子峰的變化。隨著離子源電壓的降低，2，4-癸二烯醛、肉豆蔻酸和棕櫚酸甲酯的分子離子峰m/z= 152.120 1、m/z= 228.209 6 和m/z=270.257 4的相對豐度均升高。

2.2.2 分子式及結(jié)構(gòu)式的驗(yàn)證以m/z=152.120 1、228.209 6 和270.257 4 作為母離子進(jìn)行Targeted MS/MS 分析，MS/MS 圖譜如圖2 所示。3 個化合物計(jì)算所得的分子式中分別含C10H16O（2，4-癸二烯醛）、C14H28O2（肉豆蔻酸）和C17H34O2（棕櫚酸甲酯），具體鑒定結(jié)果如表2所示。將化合物的碎片離子信息導(dǎo)入MSC 軟件，利用Chemspider 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行查找比對，鑒定結(jié)果中含2，4-癸二烯醛、肉豆蔻酸和棕櫚酸甲酯，得分分別為87.8、92.4 和93.4。采用低能量電離源結(jié)合二級質(zhì)譜對NIST 譜庫中鑒定的化合物進(jìn)行驗(yàn)證，兩種鑒定方式得到的結(jié)果一致，可相互佐證。

表2 分子式鑒定結(jié)果Table 2 The results of molecular formula identification

圖2 2，4-癸二烯醛、肉豆蔻酸和棕櫚酸甲酯的MS/MS圖Fig.2 The MS/MS data of 2，4-decadienal，tetradecanoic acid and hexadecanoic acid，methyl ester

2.3 NIST譜庫中未檢索出的化合物峰的分析鑒定

經(jīng)篩選，確定RT=19.529 0和RT=23.515 0兩個色譜峰為待測未知物并進(jìn)一步分析。

2.3.1 采用低能量電離源模式確定未知物的分子離子峰在15、12、10 eV 3 種不同的低能量電離源模式以及標(biāo)準(zhǔn)電離源（70 eV）模式下，未知物離子碎片的相對強(qiáng)度變化如圖3所示。

圖3 未知化合物在不同離子源電壓下的TOF－Scan質(zhì)譜圖Fig.3 TOF－Scan mass spectra of unknown compounds at different ion source voltages

隨著離子源電壓的降低，不同質(zhì)荷比的質(zhì)譜峰相對強(qiáng)度發(fā)生顯著變化。總體趨勢為：隨著離子源電壓降低，碎片的絕對豐度顯著下降，但高質(zhì)荷比碎片的相對豐度逐漸升高，低質(zhì)荷比碎片的相對豐度逐漸降低。RT = 19.529 0 的質(zhì)譜圖中，m/z= 218.167 5 和m/z= 220.182 0 的質(zhì)荷比相對較大，且隨著離子源電壓降低相對豐度顯著升高，因此推斷兩者為該保留時間下化合物的分子離子峰，此色譜峰可能含有兩種或兩種以上化合物，未完全分離。同理，在RT = 23.515 0 的質(zhì)譜圖中，推斷m/z=244.182 2 為該保留時間下化合物的分子離子峰。m/z=244.182 2 化合物在12 eV 和10 eV 離子源電壓作用下，分子離子峰已占絕對優(yōu)勢，只在高質(zhì)荷比位置產(chǎn)生少量碎片，表明此化合物的分子離子峰比較穩(wěn)定。

2.3.2 未知物的分子式預(yù)測綜上，選擇m/z= 218.167 5、220.182 0 和244.182 2 作為母離子進(jìn)行Targeted MS/MS 分析計(jì)算分子式，分別得到RT = 19.525 0，m/z= 218.167 6 的化合物1（Cpd1）；RT =19.529 0，m/z=220.183 3 的化合物2（Cpd2）；RT=23.515 0，m/z=244.183 2 的化合物3（Cpd3）。具體鑒定結(jié)果如表3所示，MS/MS圖譜如圖4所示。Cpd3的各項(xiàng)得分均較高，提示此化合物的分子式鑒定結(jié)果可靠。Cpd2化合物分子式鑒定中，同位素豐度得分較低，可能受Cpd1的干擾；二級碎片的得分也不高，但因二級碎片與結(jié)構(gòu)相關(guān)性較大，故二級碎片的匹配度進(jìn)一步參考MSC匹配結(jié)果。Cpd1也導(dǎo)入MSC做進(jìn)一步分析。

表3 未知物分子式鑒定結(jié)果Table 3 The molecular formula identification of unknown compounds

圖4 未知化合物MS/MS圖Fig.4 The MS/MS data of unknown compounds

2.3.3 未知物的結(jié)構(gòu)推斷將3個化合物的碎片離子信息導(dǎo)入MSC軟件，利用Chemspider數(shù)據(jù)庫進(jìn)行查找比對，Cpd1 化合物結(jié)構(gòu)式的鑒定結(jié)果得分較低（86.2），不做進(jìn)一步分析，Cpd2 和Cpd3 的鑒定結(jié)果如表4所示。

表4 化合物結(jié)構(gòu)式鑒定結(jié)果Table 4 Structural formula identification of compounds

經(jīng)查詢，Chemspider 數(shù)據(jù)庫中檢索出的Cpd2 與Cpd3 均未收錄在NIST14 庫中。Cpd2 化合物的質(zhì)譜圖中，m/z=205.158 6的相對豐度較高，為丟失支鏈CH3形成的碎片峰；m/z=149.095 8的基峰，為共軛烯烴常見的烯丙基型裂解，共軛鏈延長，穩(wěn)定性增強(qiáng)；m/z=110.072 8 為烯烴化合物發(fā)生麥?zhǔn)现嘏藕蟮乃槠?，雙鍵位置發(fā)生變化。具體裂解方式如圖5所示。

圖5 （5E，7E，11S）-5，11-二甲基-5，7-十四碳二烯-1-炔-4-醇的裂解途徑Fig.5 Fragment pathways of（5E，7E，11S）-5，11-dimethyl-5，7-tridecadien-1-yn-4-ol

Cpd3 化合物質(zhì)譜圖中的m/z=215.143 5 相對豐度較高，此質(zhì)譜峰為共軛烯炔烴的烯丙基型裂解，所得碎片形成穩(wěn)定的共軛多烯炔醇，故相對豐度高。其余碎片大多為雙鍵的α-裂解，或由羥基脫水形成更長鏈的共軛體系。結(jié)合文獻(xiàn)和碎片裂解規(guī)律，推斷Cpd3 為（6S，7E，9E）-7，9-十七碳二烯-11，13-炔-6-醇，其裂解方式如圖6所示。

圖6 （6S，7E，9E）-7，9-十七碳二烯-11，13-炔-6-醇的裂解途徑Fig.6 Fragment pathways of（6S，7E，9E）-7，9-heptadecadiene-11，13-diyn-6-ol

3 結(jié) 論

本文結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)電離源/可變能量電離源與二級質(zhì)譜聯(lián)用的GC－Q/TOF MS 技術(shù)快速鑒定了防風(fēng)揮發(fā)油成分，共鑒定出化學(xué)成分84 種。采用GC－Q/TOF MS 的標(biāo)準(zhǔn)電離源（70 eV）與NIST 譜庫相結(jié)合，可以進(jìn)行多種化合物的鑒定；對于NIST 譜庫中未收錄的化合物，可充分利用Lower energy 功能，明確化合物的分子離子峰，同時結(jié)合二級質(zhì)譜分析碎片離子，鑒定其結(jié)構(gòu)。本研究拓展了氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在未知化合物結(jié)構(gòu)鑒定中的應(yīng)用，打破了EI離子源“硬電離”的局限，無需切換其它電離源，可方便快捷地獲取化合物的分子離子信息，同時兼顧NIST譜庫檢索，實(shí)現(xiàn)了高通量、高覆蓋率的成分解析，為中藥揮發(fā)油甚至各種未知物的全面快速鑒定提供了重要思路和途徑。但可變能量電離源和二級質(zhì)譜聯(lián)合的GC－Q/TOF MS 適用于分子量較大、分子離子峰豐度相對較高的化合物，對于低能量電離源作用下也無法獲得分子離子峰的化合物，較難開展下一步研究。