劉崇義， 靳旭妹， 王瑩瑩， 李騰飛， 陳新義， 曹馨悅， 龍明秀， 何樹斌

(西北農(nóng)林科技大學(xué)草業(yè)與草原學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

我國的獼猴桃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展速度和規(guī)模令人矚目，種植面積接近世界總面積的72%，產(chǎn)量占全球總產(chǎn)量的55%[1]。但由于生產(chǎn)中大量施用化肥、農(nóng)藥問題還很普遍，嚴(yán)重影響果品質(zhì)量安全，制約了產(chǎn)品的國際市場占有率，不利于可持續(xù)發(fā)展。隨著人們生活質(zhì)量和對食品安全意識的提高，有機(jī)獼猴桃生產(chǎn)則成為解決上述問題的必然選擇。但目前我國有機(jī)果園普遍存在土壤有機(jī)質(zhì)含量較低、有機(jī)肥運(yùn)輸成本高等問題。果園生草技術(shù)能改善果園土壤物理性狀，調(diào)節(jié)果園小氣候，提高土壤有機(jī)質(zhì)含量、土壤養(yǎng)分和酶活性，還可以提高果品質(zhì)量，對土壤肥力和果樹生長發(fā)育都有重要影響[2-4]，是有機(jī)果園安全生產(chǎn)的重要技術(shù)之一。

細(xì)菌在土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化和循環(huán)等生物化學(xué)過程中發(fā)揮著重要作用[5]。土壤細(xì)菌在許多土壤化學(xué)過程中起著重要作用，參與有機(jī)質(zhì)分解、碳氮循環(huán)、土壤團(tuán)聚體和腐殖質(zhì)的形成[6]。土壤細(xì)菌種群和群落組成受當(dāng)?shù)貧夂?、土壤類型、植物種類和土壤管理方式等一系列土壤因素的影響[7]。土壤細(xì)菌對外界干擾較為敏感，其群落組成、相對豐度等指標(biāo)在一定程度上反映了作物對養(yǎng)分的吸收利用及其生長發(fā)育狀況[8]。生草覆蓋主要通過植物根系分泌物、生草凋落物降解以及土壤含水量改變來影響果園土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)[9]。根系分泌物中含有大量有機(jī)質(zhì)，包括氨基酸、糖類、有機(jī)酸、酚類、次生代謝物和蛋白質(zhì)等，這些物質(zhì)主要由植物根毛和根尖細(xì)胞分泌[10]。李磊等[11]研究表明，獼猴桃園套種蕺菜(Houttuyniacordata)可提高根際土壤細(xì)菌數(shù)量，有利于改善獼猴桃根際土壤環(huán)境。Nakamoto等[12]研究表明，種植白三葉草(Trifoliumrepens)顯著改善了土壤中細(xì)菌底物誘導(dǎo)的呼吸。因此，探討果園不同生草處理對果園土壤的影響具有重要意義[13]。

前人對于生草處理下有機(jī)獼猴桃園土壤細(xì)菌群落、土壤化學(xué)性質(zhì)的研究尚少[8-9,14]。秣食豆可固氮，且地上生物量高、綠期長；草木樨根系較淺且固氮效果顯著；黑麥草能快速覆蓋地面，抑制雜草，總體生長表現(xiàn)和肥田效果均較好[14-15]。本研究通過對三種不同生草處理的有機(jī)獼猴桃園土壤養(yǎng)分及土壤細(xì)菌群落變化特征進(jìn)行研究，以期為有機(jī)獼猴桃園的土壤管理提供科學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計與研究區(qū)概況

試驗地位于楊凌示范區(qū)五泉鎮(zhèn)上灣村陜西百恒有機(jī)果園有限公司(34° 30′ N，107°59′ E)，海拔418.0～540.1 m，年降水量635.1～663.9 mm，年均氣溫12.9℃。9齡徐香獼猴桃果園(株行距6 m×3.8 m)。試驗采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計，于2019年3月分別設(shè)置秣食豆(GM)、草木樨(MO)、一年生黑麥草(LP)、清耕(CK)4種處理，均采用條播，行距15 cm，播種量22.5 kg·hm-2；每個處理重復(fù)3次，共12個處理，小區(qū)面積為12 m×3.8 m=45.6 m2。2020年10月用土鉆采集0～20 cm土層土樣，按S形取樣法分別采集5鉆土壤，充分混合作為1個土樣，每個土樣分為2份：一份去除雜質(zhì)后自然風(fēng)干、研磨過篩，用于測定土壤化學(xué)性質(zhì)和酶活性；另一份保存于-20℃冰箱及時送樣測序。

1.2 土壤化學(xué)性質(zhì)測定

土壤樣品化學(xué)性質(zhì)的測定方法參照《土壤微生物研究原理與方法》[16]。采用干燥恒重法(105℃)測定土壤水分含量；按1∶2.5的水土比混合后直接用pH計測定pH值；采用水合熱重鉻酸鉀氧化比色法測定土壤有機(jī)質(zhì)(Soil organic carbon,SOM)；采用高效液相色譜法測定全氮(Total nitrogen,TN)凱氏蒸餾法；干燥恒重法(105℃)測定土壤水分；堿擴(kuò)散法測定速效氮(Available nitrogen,AN)；氫氧化鈉熔融鉬銻反比色法測定總磷(Total phosphorus,TP)；堿熔土樣后，用Olsen法測定速效磷(Available phosphorus,AP)；用原子吸收分光光度法測定全鉀(Total potassium,TK)；用四苯硼酸鈉比濁法測定速效鉀(Available potassium,AK)。

1.3 土壤酶活性測定

本研究集中測定過氧化氫酶(Catalase,CAT)、β-葡萄糖苷酶(β-xylosidase,βG)、脲酶(Urease,URE)、堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)和蔗糖酶(Sucrase,SUC)5種酶活性，其中，土壤過氧化氫酶活性與土壤微生物活動相關(guān)，土壤蔗糖酶常用來表征土壤熟化程度和肥力水平，脲酶活性常被用來表征土壤氮素狀況[16]，β-葡萄糖苷酶主要參與土壤纖維素的降解，堿性磷酸酶能水解土壤磷循環(huán)中的重要底物磷酸多糖和磷酸酯[17]，土壤酶活性分析采用微孔板熒光法，具體測定步驟和酶活計算公式參照Marx[18]的研究內(nèi)容。

1.4 土壤細(xì)菌相對豐度和多樣性測定

用E.Z.N.A.?Soil DNA Kit試劑盒提取細(xì)菌總DNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量，紫外分光光度計對DNA進(jìn)行定量。使用341F (5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′)和805R (5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′)引物來PCR擴(kuò)增16S rDNA(V3+V4)可變區(qū)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，并對目標(biāo)片段進(jìn)行回收，回收采用AxyPrep PCR Cleanup Kit回收試劑盒。使用AMPure XT beads (Beckman Coulter Genomics,USA)將PCR產(chǎn)物純化，Qubit (Invitrogen,USA)定量。分別使用Agilent 2100生物分析儀(Agilent,USA)和Illumina (Kapa Biosciences,USA)的文庫定量試劑盒評估擴(kuò)增子文庫的大小和數(shù)量，在NovaSeq PE250平臺上對庫進(jìn)行排序，使用QIIME2[19]的feature-classifier插件進(jìn)行序列比對及物種注釋，比對數(shù)據(jù)庫為SILVA (https://www.arb-silva.de/)和NT-16S (ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/db/nt.gz)數(shù)據(jù)庫。數(shù)據(jù)已上傳NCBI數(shù)據(jù)庫(Bioproject:PRJNA734445)。測序工作由杭州聯(lián)川生物技術(shù)股份有限公司完成。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2016對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，采用IBM SPSS statistics 26軟件進(jìn)行單因素方差分析和顯著性檢驗。使用QIIME2計算細(xì)菌β多樣性、使用PCoA分析不同生草處理土壤微生物群落結(jié)構(gòu)差異。通過線性判別(LDA)效應(yīng)法(LEfSe)分析不同生草處理之間具有顯著差異的物種。利用Canoco5.0軟件對土壤細(xì)菌群落和環(huán)境因子進(jìn)行了RDA冗余分析。利用Graphpad prism 8和R(v3.6.1)ipraph軟件包繪制相關(guān)網(wǎng)絡(luò)圖和熱圖。使用R(v3.6.1)random forest包進(jìn)行隨機(jī)森林分析。利用PICRUSt2軟件對不同牧草處理下土壤細(xì)菌的功能特性進(jìn)行了預(yù)測，新推出的PICRUSt2預(yù)測軟件獲得的結(jié)果可以很好地匹配土壤細(xì)菌功能[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同生草處理對果園土壤養(yǎng)分及酶活性的影響

由表1可知，和CK相比，GM,MO,LP處理后土壤pH值顯著降低(P<0.05)，而SOM含量顯著升高(P<0.05)，其中三種生草處理SOM含量分別提高7.6%,11.4%,10.9%。GM與MO處理的TK含量顯著高于CK處理(P<0.05)，而AK含量顯著低于CK與LP處理(P<0.05)。GM處理的AP含量顯著高于其他3種處理(P<0.05)。不同處理的AN，TP，TN含量差異不顯著。獼猴桃果園生草處理的土壤βG，CAT，URE含量均有提升，其中GM和MO處理的CAT和URE含量相對CK處理顯著升高(P<0.05)，MO和LP處理的βG含量顯著升高。不同處理的ALP含量差異不顯著。

表1 不同生草處理樣地的土壤養(yǎng)分與酶活性

2.2 不同生草處理對果園土壤細(xì)菌群落組成結(jié)構(gòu)影響分析

擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA基因的V3-V4區(qū)后，通過高通量測序分析了群落的結(jié)構(gòu)和組成。對于整個采樣集(12個土壤重復(fù)樣)，使用Illumina HiSeq分析鑒定出總共999 126個序列(原始標(biāo)簽)，平均長度41.63 M。對原始下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行雙端拼接、質(zhì)量控制、嵌合體過濾后，獲得了949 508個高質(zhì)量序列(純凈標(biāo)簽)。最終，在所有樣品中共發(fā)現(xiàn)763 248個已處理序列(有效標(biāo)簽)，占總定量序列的76.4%，測序量符合分析要求。如圖1所示，在所有樣本中主要的門是變形菌門(Proteobacteria)，平均占總序列的38.8%，其次分別為酸桿菌門(Acidobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)和芽單胞菌門 (Gemmatimonadetes)，分別占總序列的23.1%，9.6%和7.7%。

圖1 門水平物種組成柱狀堆疊圖

2.3 不同生草處理對果園土壤細(xì)菌多樣性分析

采用方差分析Anosim(Analysis of similarities)非參數(shù)檢驗比較各組細(xì)菌β多樣性的差異。不同分組因素對樣本差異的解釋度R值為0.299，分組顯著性P值為0.015，達(dá)到顯著水平，說明組間差異顯著大于組內(nèi)差異，試驗設(shè)計分組合理可靠。通過比較不同生草處理間的距離發(fā)現(xiàn)(圖2b)，GM，MO和LP處理的β多樣性區(qū)別于CK處理。主坐標(biāo)分析(Principal coordinate analysis,PCoA)(圖2a)可以很好地區(qū)分生草處理與清耕處理，不同處理之間的距離差異可以用PCoA兩軸解釋，PCoA1軸解釋度為32.7%，PCoA2軸解釋度為15.3%，說明生草處理改變了果園土壤細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)。

圖2 不同處理細(xì)菌β多樣性分析

2.4 利用隨機(jī)森林算法對不同果園生草細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)重要菌屬分析

采用隨機(jī)森林算法(Random Forest)分析了不同生草處理下影響土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的重要細(xì)菌屬。該算法通過基尼(Gini)指數(shù)計算各變量對分類樹各節(jié)點(diǎn)觀測值異質(zhì)性的影響，從而比較各變量的重要性。值越大，變量的重要性就越大。對GM,MO,LP,CK四種處理細(xì)菌組成通過隨機(jī)森林分析，找出區(qū)分不同處理間差異的關(guān)鍵成分得出了不同生草處理對土壤細(xì)菌群落多樣性的影響。不同生草處理間的差異代表種存在著明顯的差別，在門水平上(圖3a)，主要為厚壁菌門(Firmicutes)、匿桿菌門(Latescibacteria)和浮霉菌門(Planctomycetes)；在屬水平上，可鑒定的菌屬則以Stenotrophobacter屬、Bauldia屬、Kofleria屬為主。

圖3 門與屬水平土壤細(xì)菌群落隨機(jī)森林算法分析

2.5 對不同果園生草細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的LEfSe差異分析

采用線性判別分析效應(yīng)大小方法(LEfSe)對不同類群中的主要細(xì)菌進(jìn)行了定量分析，進(jìn)一步闡明了土壤樣品中鑒定出的細(xì)菌分支之間可能存在的相互作用。結(jié)果表明，不同土壤類群細(xì)菌豐度差異顯著(LDA>3.6，P<0.05)。在所有土壤樣品中共鑒定出65種特異菌群。在GM-CK的所有分類水平中，GM處理中篩選出11個特異菌群，CK處理中篩選出10個特異菌群(圖4)。GM組中，芽孢桿菌門的豐度較高(LDA=4.32，P=0.04)，主要為芽單胞菌科。浮霉菌門(LDA=4.14，P=0.04)和變形菌門(LDA=4.09，P=0.04)是MO-CK數(shù)據(jù)集中發(fā)現(xiàn)的特異菌群。LP-CK中的芽單胞菌門和變形菌門是主要差異菌群，LDA值分別為4.38和4.07。

圖4 各處理間土壤細(xì)菌群落組成的LEfSe分析(線性判別分析得分值大于3.6)

2.6 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與土壤養(yǎng)分的關(guān)聯(lián)性分析

在門水平上對土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子進(jìn)行關(guān)聯(lián)性冗余分析(Redundancy analysis,RDA)，結(jié)果顯示第一主坐標(biāo)軸解釋了58.2%的變異，第二主坐標(biāo)軸解釋了17.1%的變異，前兩軸總共解釋了75.3%的變異(圖5a)，表明前兩軸能夠反映細(xì)菌門水平與土壤環(huán)境因子關(guān)系的絕大部分信息。將所測得的環(huán)境因子對土壤細(xì)菌物種多樣性的解釋度從大到小排列為:SUC>pH>CAT>AK>βG>TK>AP>SOM>URE。通過斯皮爾曼(Spearman)關(guān)聯(lián)系數(shù)計算表明(圖5b)，相比于其他土壤性質(zhì)，河床菌門(Zixibacteria)豐度與土壤有機(jī)質(zhì)、過氧化氫酶、脲酶、β-葡萄糖苷酶極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)；藍(lán)藻細(xì)菌門(Cyanobacteria)豐度與有機(jī)質(zhì)呈極顯著正相關(guān)，與速效鉀呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)；芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)豐度與pH值呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)；匿桿菌門(Latescibacteria)豐度與有機(jī)質(zhì)、β-葡萄糖苷酶呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)；厚壁菌門(Firmicutes)豐度與β-葡萄糖苷酶呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)。

圖5 土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子的關(guān)聯(lián)性分析

2.7 PICRUSt2細(xì)菌群落功能預(yù)測分析

利用PICRUSt2軟件預(yù)測不同生草處理土壤細(xì)菌功能特征，將高通量測序結(jié)果得到的OTU豐度特征與京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)注釋基因數(shù)據(jù)庫比對，得到所有樣本在二級代謝通路共有39個(圖6)。注釋到膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能(Membrane transport)、能量代謝(Energy metabolism)和碳水化合物代謝(Carbohydrate metabolism)的基因家族最多，所占百分比分別為12.2%，6.6%和6.3%。同時，研究也關(guān)注了三級代謝通路，注釋到分泌系統(tǒng)(Secretion system)、轉(zhuǎn)運(yùn)(Transporters)、和雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)(Two-component system)最多，所占百分比分別為5.8%，3.3%，3.0%，其中4組處理間泛醌和其他萜類醌的生物合成(Ubiquinone and other terpenoid-quinone biosynthesis)、β-內(nèi)酰胺抗性(Beta-Lactam resistance)、氯環(huán)己烷和氯苯降解(Chlorocyclohexane and chlorobenzene degradation)、RNA降解(RNA degradation)代謝通路存在顯著差異(P<0.05)，這些代謝特征反映了生草處理對土壤細(xì)菌群落功能的不同調(diào)控。

圖6 KEGG功能注釋及差異富集分析功能注釋及差異富集分析

3 討論

3.1 果園生草對土壤養(yǎng)分與酶活性的影響

在本研究中，相比于清耕處理，三種生草處理均顯著提高了土壤有機(jī)質(zhì)含量，這與Qian等人研究結(jié)果一致[21]，其認(rèn)為生草栽培能顯著提高果園表層土壤有機(jī)質(zhì)含量。獼猴桃樹在土壤pH值為6.5～7.0的環(huán)境中生長良好[22]，本研究中生草處理的土壤pH值也得到了改善，該結(jié)果與王依等在秦嶺北麓獼猴桃園研究結(jié)果一致[23]。土壤酶類參與土壤中各種生化反應(yīng)，主要影響有機(jī)物質(zhì)分解、營養(yǎng)物質(zhì)循環(huán)和能量轉(zhuǎn)移。本試驗中三種生草處理組土壤過氧化氫酶、脲酶含量均有提升，這與Zheng[24]、潘介春[25]、左玉環(huán)等[26]研究結(jié)果一致。而堿性磷酸酶差異并不顯著，草木樨處理的土壤蔗糖酶含量甚至低于清耕處理，說明生草處理對不同土壤酶活性的影響各不相同，需要長時間才能達(dá)到積極的效果[27]。

3.2 果園生草對土壤細(xì)菌多樣性的影響

土壤細(xì)菌是陸地生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，在土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化、循環(huán)等生化過程中發(fā)揮著重要作用。土壤細(xì)菌在許多土壤化學(xué)過程中起著重要作用，參與土壤碳氮循環(huán)、有機(jī)質(zhì)分解、土壤團(tuán)聚體和腐殖質(zhì)形成。它們還與植物有各種共生和寄生關(guān)系[6]。果園生草使土壤細(xì)菌組成發(fā)生顯著變化，本研究中的三種生草處理與清耕處理的細(xì)菌組成存在顯著差異，果園生草能提高土壤細(xì)菌物種豐富度，在生草植被凋落物降解過程中，與植物有機(jī)質(zhì)降解有關(guān)的土壤細(xì)菌數(shù)量增加，土壤細(xì)菌群落多樣性增加[28]。本研究中，土壤細(xì)菌主要為變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)和芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)，這和其他果園生草覆蓋的研究結(jié)果類似[29-31]。根據(jù)細(xì)菌的營養(yǎng)生活史來看，酸桿菌門(Acidobacteria)多屬于寡養(yǎng)菌(k-strategists)，主要分解難分解的碳。它們通常生長緩慢，主要生活在營養(yǎng)不良的環(huán)境中。而芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)是一種植物促生菌，通過與植物根系的相互作用，進(jìn)行生物固氮，誘導(dǎo)植物分泌植物激素，促進(jìn)植物生長，此菌門已從眾多植物中被分離出來[32-33]。

相較于清耕，秣食豆和黑麥草處理中纖維桿菌門豐度均有提高，在屬水平的豐度熱圖中，大部分細(xì)菌為現(xiàn)階段無法培養(yǎng)的菌屬，必須通過同源分析才可確定具體功能。β多樣性分析顯示，不同處理間組間差異顯著大于組內(nèi)差異，生草處理β多樣性顯著高于清耕處理。通過隨機(jī)森林算法分析，我們發(fā)現(xiàn)不同處理間細(xì)菌差異的關(guān)鍵成分，其中厚壁菌門、匿桿菌門和浮霉菌門是生草組間差異代表物種，可以分別作為不同生草處理下的生物標(biāo)記物，然而，其在群落中的豐富度并不是主要的，因此我們需要重新思考菌群豐度與其在環(huán)境中的重要性之間的關(guān)系[34]。厚壁菌門菌種能表達(dá)糖基水解酶，參與纖維素和半纖維素的降解[35]，因此生草覆蓋可以通過植被降解為厚壁菌門的生長提供碳源，這與前人的研究結(jié)果一致。

本研究中，細(xì)菌主要參與了膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能、能量代謝功能和碳水化合物代謝功能。相比于清耕處理，生草處理使植被多樣性升高，植被凋落物、殘體和根系分泌物發(fā)生改變[9]，從而導(dǎo)致細(xì)菌膜轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝功能出現(xiàn)差異，說明果園生草處理對土壤細(xì)菌功能基因產(chǎn)生顯著影響，對優(yōu)化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有一定的作用。

4 結(jié)論

在關(guān)中平原有機(jī)獼猴桃園的三種生草處理均提高了土壤有機(jī)質(zhì)和β-葡萄糖苷酶含量，改善了土壤pH值，草木樨與秣食豆處理提高了土壤全鉀、過氧化氫酶和脲酶含量。說明生草處理能夠提高有機(jī)獼猴桃園土壤養(yǎng)分，改良土質(zhì)。生草處理同時改變了獼猴桃園土壤細(xì)菌群落之間的物種群落結(jié)構(gòu)。同時，對細(xì)菌代謝通路的分析反映出土壤細(xì)菌對不同生草處理的響應(yīng)與反饋機(jī)制存在差異。綜上，關(guān)中平原有機(jī)獼猴桃園種植草木樨、秣食豆和黑麥草可顯著提高土壤有機(jī)質(zhì)和養(yǎng)分含量，改善土壤微生態(tài)環(huán)境，其中草木樨和秣食豆改良效果尤佳。