陳川，凱迪日耶·玉蘇普，2*

（1.喀什大學(xué)生命與地理科學(xué)學(xué)院，新疆 喀什 844006；2.新疆帕米爾高原生物資源與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 喀什 844006）

黃酮類化合物是一類廣泛存在于植物體內(nèi)的次生代謝產(chǎn)物，研究表明黃酮類化合物參與光合作用、呼吸作用、生長發(fā)育以及植物對(duì)各種脅迫的防御等多種生理生化過程[1]。此外，黃酮類化合物具有多種藥理活性，在人類健康和飲食中也發(fā)揮著重要作用[2]。查爾酮異構(gòu)酶（chalcone isomerase，CHI，EC5.5.1.6.）是類黃酮生物合成關(guān)鍵酶，催化查爾酮轉(zhuǎn)化為黃烷酮而形成不同類型的黃酮類化合物[3]。迄今為止，已經(jīng)從許多不同的植物中克隆了許多CHI基因，包括大豆、玉米、小麥、苜蓿、花生、胡蘆巴、康乃馨和銀杏等[4-11]。

石榴是石榴科（Punicaceae）石榴屬（Punica L.）植物，是一種古老的果樹，原產(chǎn)于伊朗、阿富汗及印度西北部地區(qū)[12]。研究表明，石榴具有抗氧化、抗癌、抗炎等特點(diǎn)，可以有效預(yù)防和治療癌癥及其他慢性感染性疾病[13-14]。從石榴中已分離出的黃酮類化合物有黃酮、黃酮醇、花色素、黃烷-3-醇類等[15]。目前關(guān)于石榴黃酮類化合物的研究主要集中在黃酮類化合物的分離、純化以及藥理作用等研究方面，關(guān)于黃酮類化合物合成相關(guān)基因的研究較少，石榴CHI基因生物信息學(xué)方面的分析鮮有報(bào)道，對(duì)其生物學(xué)功能未深入了解[16-17]。鑒于此，本研究以石榴CHI基因?yàn)檠芯繉?duì)象，利用生物信息學(xué)的方法，對(duì)其理化性質(zhì)、跨膜區(qū)段預(yù)測、疏水作用力、信號(hào)肽預(yù)測、翻譯后修飾、亞細(xì)胞定位、蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測等進(jìn)行分析，為進(jìn)一步研究石榴查爾酮異構(gòu)酶基因提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 石榴CHI序列

從美國國立生物技術(shù)信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）數(shù)據(jù)庫中查詢已注冊的石榴CHI（KU058887）的核苷酸序列及氨基酸序列。

1.2 方法

生物信息學(xué)分析工具如表1所示。

表1 生物信息學(xué)分析工具Table 1 Bioinformatic analysis tools

利用表1中工具分析了石榴CHI的理化性質(zhì)、親水性/疏水性、信號(hào)肽、跨膜區(qū)、亞細(xì)胞定位、保守結(jié)構(gòu)域、翻譯后修飾、二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測以及三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)石榴CHI理化性質(zhì)分析

使用Expasy提供的在線Protparam軟件對(duì)石榴CHI基因所編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)進(jìn)行分析。結(jié)果表明，該基因全長1 075 bp，完整開放閱讀框?yàn)?90 bp，可以編碼230個(gè)氨基酸。CHI原子總數(shù)為3 550，分子總質(zhì)量為25 kDa，總分子式為C1127H1789N287O340。其中占比最高殘基為Glu（10.4%），占比最低殘基為Trp（0.9%）。正電荷殘基總數(shù)為28（Arg+Lys），負(fù)電荷殘基總數(shù)為30（Asp+Glu），理論等電點(diǎn)為5.71，推斷它為酸性蛋白質(zhì)。不穩(wěn)定系數(shù)結(jié)果分析表明，石榴CHI不穩(wěn)定系數(shù)（44.60）數(shù)值較高，是一種不穩(wěn)定蛋白質(zhì)。親水性分析平均值結(jié)果分析表明，石榴CHI親水性平均值（-0.131）較低，并且脂肪系數(shù)（81.43）小于 100，推測為親水性蛋白。

2.2 石榴CHI親水性/疏水性分析

氨基酸的極性對(duì)蛋白質(zhì)折疊形成二級(jí)結(jié)構(gòu)及以上的結(jié)構(gòu)域和功能域有重要的影響。通過Protscale預(yù)測法分析對(duì)石榴CHI基因所編碼蛋白的親水性/疏水性，分析結(jié)果如圖1所示。

圖1 石榴CHI的親水性/疏水性分析（Kety and Doolittle算法）Fig.1 Hydrophlicity/hydrophobicity analysis of CHI in pomegranate（Kety and Doolittle algorithm）

從圖1得出波浪線的正值和負(fù)值來確定疏水和親水性，結(jié)果表明，CHI基因所編碼蛋白質(zhì)在第56位氨基酸峰值最大，為1.733，表明該區(qū)域?yàn)楦呤杷詤^(qū)域，而在第226位氨基酸峰值最小，為-2.133，表明該區(qū)域?yàn)楦哂H水性區(qū)域，可以推測該蛋白為親水蛋白質(zhì)，這與理化性質(zhì)分析結(jié)果一致。

2.3 石榴CHI跨膜區(qū)預(yù)測分析

使用在線軟件TMHMM預(yù)測對(duì)石榴CHI基因所編碼蛋白質(zhì)跨膜區(qū)預(yù)測分析。跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測結(jié)果如圖2所示。

圖2 石榴CHI跨膜區(qū)預(yù)測（隱馬爾可夫模型）Fig.2 Transmembrane structure prediction of CHI in pomegranate（Hidden Markov models）

圖2中3種不同的顏色線分別代表不同的位置，結(jié)果顯示，該蛋白沒有跨膜區(qū)，即推測石榴CHI蛋白不屬于跨膜蛋白，代表著該蛋白在合成類黃酮化合物時(shí)以游離形式參與，為游離蛋白，這與親水性/疏水性分析結(jié)果一致。

2.4 石榴CHI信號(hào)肽預(yù)測分析

信號(hào)肽指導(dǎo)蛋白質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)移以保障產(chǎn)生的蛋白質(zhì)準(zhǔn)確定向運(yùn)輸。使用SignalP4.0在線分析工具基于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法對(duì)石榴CHI基因所編碼蛋白質(zhì)進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測分析，預(yù)測結(jié)果如圖3所示。

圖3 石榴CHI信號(hào)肽預(yù)測Fig.3 Signal peptide prediction of CHI in pomegranate

圖3中C值代表剪切位點(diǎn)的可能性，用桃紅色線表示可能性的大小。若該點(diǎn)屬于剪切位點(diǎn)，那么該處的C值明顯增高，紅色線較長。S值代表序列中氨基酸殘基是信號(hào)肽的概率，用綠色的先表示概率的大小，若綠色線越高，說明該部分的氨基酸殘基很可能就是信號(hào)肽。S值高說明此處是信號(hào)肽的一部分；S值低說明此處是成熟蛋白質(zhì)的一部分。Y值是C值和S值結(jié)合派生出的值，用藍(lán)色線表示。剪切位點(diǎn)出現(xiàn)在S值最陡的坡和C值明顯增大的地方。結(jié)果顯示，石榴CHI蛋白沒有信號(hào)肽，這與跨膜區(qū)預(yù)測的結(jié)果一致。

2.5 石榴CHI亞細(xì)胞定位分析

亞細(xì)胞定位是蛋白質(zhì)功能研究的重要內(nèi)容，細(xì)胞中mRNA通過轉(zhuǎn)錄翻譯后形成蛋白質(zhì)，然后被運(yùn)送到特定的細(xì)胞器發(fā)揮作用，只有到達(dá)正確的部位才能參與細(xì)胞的各種生命活動(dòng)，如果運(yùn)輸錯(cuò)誤很可能影響到細(xì)胞活動(dòng)甚至可能殺傷細(xì)胞。PSORT和Cell-PLoc2.0共同對(duì)石榴CHI基因所編碼蛋白質(zhì)進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測得出結(jié)果表明，在PSORT中石榴CHI蛋白存在于線粒體的概率為69.6%，存在于細(xì)胞核中概率為13%，存在于細(xì)胞質(zhì)中可能性為8.7%，概率最低存在于液泡和過氧化物酶中，同為4.3%。而在Cell-PLoc2.0中真核生物蛋白質(zhì)可能同時(shí)存在，或兩個(gè)以上的亞細(xì)胞位置之間移動(dòng)。綜合兩種預(yù)測結(jié)果可以推測該蛋白質(zhì)存在于線粒體中，在核糖體合成后進(jìn)入線粒體，在線粒體中以游離態(tài)發(fā)揮作用。

2.6 石榴CHI保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測分析

利用CDD在線工具分析石榴CHI氨基酸序列的功能結(jié)構(gòu)域，分析結(jié)果如圖4所示。

圖4 石榴CHI保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測Fig.4 Conserved domain prediction of CHI in pomegranate

不同基因可能有著相同的同源序列，擁有同源序列的基因有可能存在同樣的結(jié)構(gòu)域、功能域，有可能有同樣的功能，這與基因超家族相同。保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測就是為了尋找是否存在與目的基因同源的超家族，找到即可推測其功能。結(jié)果表明，石榴CHI氨基酸序列在第10位～第229位存在Chalcone-3查爾酮超家族保守結(jié)構(gòu)域。

2.7 石榴CHI磷酸化修飾的預(yù)測與分析

利用NetPhos 3.1Sever對(duì)石榴CHI基因所編碼蛋白質(zhì)進(jìn)行磷酸化預(yù)測分析，結(jié)果如圖5所示。

圖5 石榴查爾酮異構(gòu)酶磷酸化修飾預(yù)測Fig.5 Phosphorylation prediction of CHI in pomegranate

圖5中所標(biāo)示的紅色（Threshold）代表閾值，其閾值設(shè)定為0.5，超過閾值的位點(diǎn)易被磷酸化，值越高磷酸化概率越大；結(jié)果顯示，CHI基因所編碼蛋白質(zhì)共有27個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中絲氨酸位點(diǎn)有15個(gè)（6、32、85、115、128、156、163、165、167、173、192、198、206、218、225）、蘇氨酸位點(diǎn) 11 個(gè)（56、72、78、83、94、110、131、133、161、169、215）和酪氨酸 1 個(gè)（132）。

2.8 石榴CHI糖基化修飾的預(yù)測與分析

利用NetGlycate 1.0 Sever對(duì)石榴CHI基因所編碼蛋白質(zhì)進(jìn)行糖基化預(yù)測，結(jié)果如圖6所示。

圖6 石榴查爾酮異構(gòu)酶糖基化修飾預(yù)測Fig.6 Glycosylation prediction of CHI in pomegranate

在圖6中，紅色橫線表示閾值，閾值設(shè)置為0.5，超過閾值的部分在此位置有被糖基化的可能。根據(jù)石榴CHI氨基酸序列糖基化的預(yù)測結(jié)果顯示，石榴CHI蛋白序列沒有被糖基化的位點(diǎn)。糖基化在調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)、細(xì)胞質(zhì)內(nèi)和核內(nèi)定位、基質(zhì)內(nèi)和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、在機(jī)制和質(zhì)膜溶解性等都有非常重要意義。蛋白穩(wěn)定性分析結(jié)果顯示該蛋白屬不穩(wěn)定蛋白，而糖基化有增加蛋白穩(wěn)定性的作用，石榴CHI蛋白沒有糖基化位點(diǎn)也從另一方面佐證了CHI蛋白不穩(wěn)定這一結(jié)果。

2.9 石榴CHI的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測

蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)指的是這個(gè)蛋白多肽鏈主鏈原子借助于氫鍵沿一維方向排列成具有周期性結(jié)構(gòu)的構(gòu)象。二級(jí)結(jié)構(gòu)形成的構(gòu)件主要有α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)卷曲、延伸鏈等。利用目前常用的Jpred 4和Sopma對(duì)石榴CHI基因所編碼蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測分析。石榴CHI的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測如圖7所示。

圖7 石榴CHI的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.7 Secondary structure prediction of CHI in pomegranate

由圖7可知，CHI蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中，α-螺旋占41.3%，β-折疊占10%，無規(guī)則卷曲占26.96%，延伸鏈占21.74%。Jpred 4和Sopma的預(yù)測結(jié)果對(duì)比表明，兩種預(yù)測工具的預(yù)測結(jié)果基本一致。

2.10 石榴CHI的結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.10.1 石榴CHI的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測

蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)是多肽鏈在二級(jí)結(jié)構(gòu)或者超二級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步盤曲折疊形成的特定空間結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)決定其功能，空間結(jié)構(gòu)預(yù)測對(duì)蛋白質(zhì)功能研究有重大意義。利用SWISS-MODEL同源建模法預(yù)測石榴CHI的三級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖8所示。

圖8 石榴CHI三級(jí)結(jié)構(gòu)（SWISS-MODEL）Fig.8 Tertiairy structure of CHI in pomegranate（SWISSMODEL）

三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測得到以PDB 4 doi.1.a為模板的預(yù)測模型，相似度為65.3%。全局模型質(zhì)量評(píng)估得分為0.87，明顯高于其他預(yù)測模型。QMEAN得分為0.19，比其他模型更接近于0，明顯高于其他模型。

通過進(jìn)一步預(yù)測模型的當(dāng)?shù)刭|(zhì)量估計(jì)（local quality estimate），得分基本在0.6以上，說明符合模型的基本要求，結(jié)果如圖9所示。相似性散點(diǎn)分布圖分析結(jié)果如圖10所示。

圖9 石榴CHI當(dāng)?shù)刭|(zhì)量估計(jì)Fig.9 Local quality estimate of CHI in pomegranate

圖10 石榴CHI相似性散點(diǎn)分布圖Fig.10 Similarity scattergram of the predicted model and the homologous protein

該模型以紅色五角星的值為判定標(biāo)準(zhǔn)，紅五角星的值小于1，表示該模型的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，是可靠的三級(jí)結(jié)構(gòu)。據(jù)此可以推斷PDB 4 doi.1.a最可能為石榴CHI蛋白的最佳三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測模型。而三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測模型主要由α-螺旋、β-折疊、無規(guī)卷曲和延伸鏈組成，其中α-螺旋占比較多。三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果相符合。

2.10.2 模型質(zhì)量評(píng)估

為了進(jìn)一步驗(yàn)證預(yù)測模型的準(zhǔn)確性，進(jìn)行模型質(zhì)量評(píng)估。在Procheck評(píng)估中，結(jié)果如圖11所示。

圖11 預(yù)測模型拉曼圖Fig.11 Ramachandran plot of the predicted model

落在額外允許區(qū)域（圖中黃色區(qū)域）和最佳允許區(qū)域（紅色區(qū)域）的氨基酸殘基占整個(gè)蛋白質(zhì)的比例高于90%，可以認(rèn)為該模型的構(gòu)象符合立體化學(xué)的規(guī)則。顏色越深的區(qū)域表明構(gòu)象越合理。拉曼圖分析結(jié)果表明，石榴CHI蛋白的預(yù)測模型中有94.7%的氨基酸殘基（177個(gè)）位于紅色最佳區(qū)域，有4.8%的氨基酸殘基（9個(gè)）位于黃色額外允許區(qū)域內(nèi)，這表明基本上大部分的氨基酸殘基都位于允許區(qū)域內(nèi)，所以該模型的構(gòu)象符合立體化學(xué)的規(guī)則。

在Verify 3D工具中，平均3 d～1 d分?jǐn)?shù)≥0.2中有93.55%的氨基酸殘留，并且低質(zhì)量部分不明顯，基本上都在標(biāo)準(zhǔn)線以上，這表明模型質(zhì)量合格，結(jié)果如圖12所示。所以，結(jié)合以上觀點(diǎn)推斷石榴CHI的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型預(yù)測結(jié)果穩(wěn)定可靠。

圖12 預(yù)測模型3D-1D得分散點(diǎn)圖Fig.12 3D-1D Score scattergram of the model

3 結(jié)論與討論

黃酮類化合物的生物合成首先通過苯丙烷途徑，苯丙氨酸轉(zhuǎn)化為香豆酰輔酶A、香豆酰輔酶A和丙二酰輔酶A在查爾酮合成酶的作用下合成查爾酮，查爾酮經(jīng)過查爾酮異構(gòu)酶（CHI）生成二氫黃酮類，二氫黃酮類是其他黃酮類化合物的前體物質(zhì)，可通過不同反應(yīng)途徑，生成其他的黃酮類化合物[18-20]。作為抗氧化化合物，黃酮類化合物在植物的生命活動(dòng)中起著至關(guān)重要的作用，例如防紫外、抗病原體、植物著色、生長素轉(zhuǎn)運(yùn)和花粉育性等[21-22]。黃酮類化合物對(duì)人類健康有益，包括預(yù)防心血管疾病，肥胖癥和糖尿病[23-24]。因此，植物類黃酮合成相關(guān)基因的研究引起廣泛關(guān)注。自1986年從豌豆中分離出第一個(gè)CHI基因以來，GenBank已登記了3 000多個(gè)CHI核苷酸序列[25]。石榴黃酮類化合物的生理活性，是近年來的研究熱點(diǎn)，黃酮類化合物的抗自由基、抗氧化作用越來越受到人們的重視，從石榴中已分離出的黃酮類化合物有黃酮、黃酮醇、花色素、黃烷-3-醇類等[26-27]。研究發(fā)現(xiàn)，石榴的果汁、果皮葉、樹皮都有發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物[28]。

本研究以石榴CHI作為研究對(duì)象，對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果表明：CHI基因全長1 075 bp，完整開放閱讀框?yàn)?90 bp，可以編碼230個(gè)氨基酸，石榴CHI屬于親水不穩(wěn)定蛋白，呈酸性，不具有信號(hào)肽，CHI不存在跨膜區(qū)域，亞細(xì)胞定位預(yù)測分析表明其最大可能定位在線粒體；有27個(gè)可能的磷酸化位點(diǎn)，無糖基化位點(diǎn)；二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果表明，以α-螺旋和任意卷曲為主要結(jié)構(gòu)，CHI氨基酸序列具有Chalcone 3查爾酮超家族保守結(jié)構(gòu)域；同源建模法構(gòu)建其三級(jí)結(jié)構(gòu)模型，結(jié)果表明該模型與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果相符合，模型質(zhì)量評(píng)估結(jié)果較好。本研究闡明了石榴CHI重要的分子特征，豐富了該蛋白的相關(guān)研究，為進(jìn)一步研究其生物學(xué)功能提供了一定的理論基礎(chǔ)。