王帆帆，唐 濤，郭 杰，段媛媛，郭曉亮，游景茂

（湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院中藥材研究所，湖北 恩施 445000）

半夏（Pinellia ternata）為天南星科多年生草本植物，以水玉、地文之名始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，是中國(guó)著名的中藥材，具有鎮(zhèn)咳化痰、消腫排膿、燥濕降逆等多種功效，被廣泛應(yīng)用于定咳喘膠囊、通絡(luò)軟堅(jiān)青和復(fù)方半夏片各類藥劑產(chǎn)品中［1，2］。目前半夏主產(chǎn)于湖北、重慶、甘肅、安徽、四川等地，湖北優(yōu)質(zhì)半夏種植面積約2 000 hm2，每667 m2收入超過(guò)2 萬(wàn)元，已成為湖北省江漢平原重點(diǎn)脫貧項(xiàng)目和鄉(xiāng)村建設(shè)主打產(chǎn)業(yè)，其荊半夏因粉性足、顆粒均勻等優(yōu)勢(shì)，近年來(lái)已逐漸成為半夏種源核心產(chǎn)區(qū)，可占國(guó)內(nèi)種子來(lái)源的26%以上。2019 年7 月，潛半夏入圍湖北省“一縣一品”優(yōu)勢(shì)品種，成為省地標(biāo)產(chǎn)品。但人工種植的半夏病蟲害突發(fā)率較高，部分系統(tǒng)性病害由于缺乏研究，呈加重態(tài)勢(shì)，且人工種植半夏品種活性成分不足，因此需要采取科學(xué)途徑提高其產(chǎn)量和質(zhì)量，以維持半夏產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展［3］。

研究表明，植物內(nèi)生細(xì)菌廣泛存在于植物中且種類繁多，在與寄主的長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中，不僅對(duì)健康植株不造成實(shí)質(zhì)性危害，同時(shí)可以促進(jìn)其生長(zhǎng)，提高植物抗逆性，防治病蟲害［4］。學(xué)者已經(jīng)從白術(shù)、中華補(bǔ)血草、椰棗樹(shù)等藥用植物中分離到Bacillus endophyticusAMR83、Staphylococcus和Streptomyces多 種有益內(nèi)生細(xì)菌［5-7］。有利于植物健康和生長(zhǎng)的內(nèi)生細(xì)菌為植物促生細(xì)菌，可通過(guò)產(chǎn)生生長(zhǎng)素、酶物質(zhì)及固氮途徑、解磷作用等途徑直接或間接促進(jìn)植物生長(zhǎng)［8］。植物促生細(xì)菌是具有改善植物品質(zhì)、提高抗逆性和防治病蟲害等優(yōu)勢(shì)的天然資源菌。關(guān)于貴州、江蘇等地半夏內(nèi)生細(xì)菌多樣性分析已有報(bào)道，但湖北半夏內(nèi)生細(xì)菌多樣性的詳細(xì)研究尚未報(bào)道。

本研究通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)，研究了湖北半夏內(nèi)生細(xì)菌的多樣性及其代謝通路，進(jìn)一步揭示了藥用植物半夏內(nèi)生細(xì)菌的分布情況。不僅為湖北半夏與其內(nèi)生細(xì)菌之間相互關(guān)系的探索奠定基礎(chǔ)，還為提高藥用植物半夏的產(chǎn)量和質(zhì)量提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

試驗(yàn)所選用的植物樣品采自湖北省天門市汪場(chǎng)鎮(zhèn)湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院中藥材研究所半夏基地，采集健康的、長(zhǎng)勢(shì)良好的半夏植株，取其塊莖，無(wú)菌水沖洗干凈后，快速風(fēng)干，無(wú)菌條件下去除塊莖表皮，置于液氮中保存待用。

1.2 DNA 提取和PCR 擴(kuò)增

對(duì)獲得的半夏塊莖樣品用Omega E.Z.N.A.?Soil DNA Kit 提取試劑盒提取其微生物組總DNA。使用上游引物為338F（ACTCCTACGGGAGGCAGCA），下游引物為806R（GGACTACHVGGGTWTCTAAT），對(duì)16S rDNA V3～V4 保守區(qū)基因片段進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化后進(jìn)行熒光定量分析。

1.3 高通量測(cè)序分析

采用Illumina公司的TruSeqNano DNA LT Library Prep Kit 制備測(cè)序文庫(kù)，MiSeq 測(cè)序儀進(jìn)行高通量測(cè)序，測(cè)序委托派森諾生物科技有限公司完成。

1.4 生物信息學(xué)分析

使用QIIME 軟件，分別獲取樣品在門、綱、目、科、屬5 個(gè)分類水平上的組成和豐度分布表。使用GraPhlAn 工具［9］對(duì)樣品總體在各分類水平的組成構(gòu)建等級(jí)樹(shù)。使用PICRUSt 工具［10］進(jìn)行菌群代謝功能預(yù)測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序結(jié)果質(zhì)量分析

湖北半夏樣品中提取的微生物組總DNA 經(jīng)PCR 擴(kuò)增后進(jìn)行產(chǎn)物回收純化，回收產(chǎn)物熒光定量后高通量測(cè)序，對(duì)原始雙端序列進(jìn)行質(zhì)量篩選，獲得樣品的有效序列共39 537 條，去除宿主序列64 條。內(nèi)生細(xì)菌序列長(zhǎng)度分布在403～466 bp，長(zhǎng)度為407 bp的序列最多，有33 868 條，其序列長(zhǎng)度分布如圖1 所示。從序列長(zhǎng)度的分布來(lái)看，與16S rDNA V3～V4 區(qū)序列長(zhǎng)度吻合。

圖1 序列長(zhǎng)度分布

2.2 細(xì)菌多樣性分析

使用R 軟件將OTU 豐度矩陣文件結(jié)果繪制成圖2。由圖2 可以直觀地看到，以97%的序列相似度作為OUT 劃分閾值，得到681 個(gè)OTUs，其中門、綱、目分類水平的OTU 數(shù)均為130，科的OTU 數(shù)為129，屬的OTU 數(shù)為121，種的OTU 數(shù)僅為41。稀疏曲線可以評(píng)判樣品的當(dāng)前測(cè)序深度是否足以反映該群落樣本所包含的微生物多樣性，如圖3 所示。圖3 樣品曲線趨于平緩，表明該測(cè)序結(jié)果已足夠反映半夏樣品所包含的絕大部分微生物，繼續(xù)增加測(cè)序深度已無(wú)法檢測(cè)到大量的尚未發(fā)現(xiàn)的新OTU。樣品的多樣性指數(shù)分析表明，chao1 指數(shù)和ACE 指數(shù)與操作分類單元數(shù)相同，均為130，說(shuō)明測(cè)序結(jié)果足夠反映湖北半夏樣品菌群豐度，香濃指數(shù)為3.02，辛普森指數(shù)僅為0.715，說(shuō)明該樣品菌群多樣性較高。

圖2 OTU 劃分和分類地位鑒定結(jié)果統(tǒng)計(jì)

圖3 OUT 數(shù)的稀疏曲線

2.3 細(xì)菌群落組成分析

使用R 軟件將所得數(shù)據(jù)繪制成柱狀圖，以直觀地看到樣品在同一水平的分類單元數(shù)，以顏色區(qū)分各分類單元，柱子越長(zhǎng)，該分類單元在樣品中的相對(duì)豐度越高，如圖4 所示。半夏內(nèi)生細(xì)菌主要包括6 門10 綱23 目29 科45 屬，26 種。半夏的內(nèi)生細(xì)菌主要?dú)w類于Proteobacteria 門，占分析總數(shù)的97.76%，其次是Actinobacteria門，僅占1.03%。從綱水平來(lái)看，該半夏植物的內(nèi)生細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌綱主要是Alphaproteobacteria 和Gammaproteobacteria，所占比例分別是51.65%和46.11%。從目水平來(lái)看，該半夏內(nèi)生細(xì)菌主要?dú)w類于Rickettsiales 和Pseudomonadales，所占比例分別為49.37%和30.70%。從科水平來(lái)看，該半夏內(nèi)生細(xì)菌主要?dú)w類于Mitochondria，所占比例為49.37%；其次Pseudomonadaceae 和Burkholderiaceae，所占比例為21.49%和14.74%。與MEGAN 相比，GraPhlAn繪制的分類等級(jí)樹(shù)提供了一種從復(fù)雜的群落數(shù)據(jù)中，快速發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢(shì)微生物類群的方法（圖5）。分類等級(jí)樹(shù)展示了樣本總體中，從門到屬（從內(nèi)圈到外圈依次排列）所有分類單元（以節(jié)點(diǎn)表示）的等級(jí)關(guān)系，節(jié)點(diǎn)大小對(duì)應(yīng)于該分類單元的平均相對(duì)豐度，相對(duì)豐度前20 位的分類單元還將在圖中以字母標(biāo)識(shí)（從門到屬按照從外層到內(nèi)層依次排列），字母上的陰影顏色同對(duì)應(yīng)節(jié)點(diǎn)顏色一致。

圖4 各水平的群落分類學(xué)組成和分布

圖5 基于GraPhlAn的樣品總體分類等級(jí)樹(shù)

2.4 菌群代謝功能預(yù)測(cè)

PICRUSt 能將16S rRNA 基因序列在3 種功能譜數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行預(yù)測(cè)，即KEGG、COG 和Rfam。其中，KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)的核心為生物代謝通路分析數(shù)據(jù)庫(kù)（KEGG PATHWAY Database，http：//www.genome.jp/kegg/pathway.html），將代謝通路歸為6 大類，包括代謝（Metabolism）、遺傳信息處理（Genetic Information Processing）、環(huán)境信息處理（Environmental Information Processing）、細(xì)胞進(jìn)程（Cellular Processes）、生物體系統(tǒng)（Organismal Systems）和人類疾?。℉uman Diseases），每一類代謝通路又被進(jìn)一步劃分為多個(gè)等級(jí)。如圖6 所示，代謝功能類群中，能量代謝功能類群在半夏樣品中的相對(duì)豐度最高，其次是碳水化合物代謝功能和氨基酸代謝功能類群；遺傳信息處理功能類群中，復(fù)制和修復(fù)功能類群的豐度最高；環(huán)境信息處理功能類群中，膜運(yùn)輸功能類群的豐度最高；細(xì)胞進(jìn)程功能類群中，細(xì)胞運(yùn)動(dòng)功能類群的豐度最高；生物系統(tǒng)功能類群中，內(nèi)分泌系統(tǒng)功能類群的豐度最高；人類疾病功能類群中，傳染性疾病功能類群的豐度最高。

圖6 PICRUSt預(yù)測(cè)的KEGG 第二等級(jí)分布

3 小結(jié)與討論

2018 年公布的《古代經(jīng)典名方目錄》中，半夏的藥方占首批經(jīng)典名方總數(shù)的17%，是重要的傳統(tǒng)大宗藥材，廣泛分布于中國(guó)長(zhǎng)江流域以及東北、華北等地區(qū)［11］。張潔等［12］通過(guò)對(duì)貴州半夏內(nèi)生細(xì)菌的研究，表明其內(nèi)生細(xì)菌主要?dú)w屬于微桿菌屬、寡養(yǎng)單胞菌屬、類芽孢桿菌屬、芽孢桿菌屬。張盼盼［13］通過(guò)對(duì)江蘇邳半夏內(nèi)生細(xì)菌的多樣性分析，表明其內(nèi)生細(xì)菌主要分布于Actinobacteria、Proteobacteria、Tenericutes、Firmicutes、Bacteroidetes、Cyanobacteria 6個(gè)門。劉建玲等［14］對(duì)陜西楊凌半夏內(nèi)生菌的分離鑒定結(jié)果表明，其優(yōu)勢(shì)種群為棒孢霉屬、青霉屬和鐮孢霉屬。本研究通過(guò)對(duì)湖北半夏內(nèi)生細(xì)菌多樣性分析表明，該半夏樣品的優(yōu)勢(shì)菌群主要?dú)w于6 門、10綱、23 目、29 科、45 屬、26 種。在門水平上豐度最高的是Proteobacteria，在科水平上豐度較高的是Mitochondria、Pseudomonadaceae、Burkholderiaceae。由此可知，不同地區(qū)的半夏內(nèi)生細(xì)菌多樣性各有差異，這可能與地方性土壤、氣候、溫度等環(huán)境條件和栽培方式有關(guān)。通過(guò)本研究可初步明確湖北半夏內(nèi)生細(xì)菌的多樣性。

目前關(guān)于藥用植物內(nèi)生細(xì)菌代謝功能與寄主健康生長(zhǎng)等相關(guān)的研究較為熱門。內(nèi)生細(xì)菌可通過(guò)產(chǎn)生植物生長(zhǎng)素、酶等功能直接促進(jìn)植物生長(zhǎng)，同時(shí)可通過(guò)產(chǎn)生細(xì)胞壁裂解酶等物質(zhì)減少病菌的侵入，間接促進(jìn)植物生長(zhǎng)。周佳宇等［15］從茅蒼術(shù)中分離到可產(chǎn)生IAA的內(nèi)生細(xì)菌，Qin 等［16］從中華補(bǔ)血草中分離到產(chǎn)ACC 脫氨酶的內(nèi)生細(xì)菌，均可促進(jìn)植物的生長(zhǎng)。本研究對(duì)湖北半夏內(nèi)生細(xì)菌的基因功能和代謝途徑進(jìn)行初步分析，結(jié)果表明代謝功能類群中的能量代謝功能類群在半夏樣品中的相對(duì)豐度最高，其次是碳水化合物代謝功能和氨基酸代謝功能類群，為今后研究半夏內(nèi)生細(xì)菌代謝產(chǎn)物多樣性和生防菌的開(kāi)發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

半夏有效成分之一是生物堿類物質(zhì)，目前已從半夏中分離出麻黃堿、葫蘆巴堿、肌苷等多種生物堿類物質(zhì)。部分內(nèi)生細(xì)菌在與寄主長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中彼此相互影響，具有相似的次生代謝產(chǎn)物，提高寄主活性成分。蘇昊［17］從半夏體內(nèi)得到多株產(chǎn)生物堿類的內(nèi)生菌。劉建玲等［18］研究表明半夏內(nèi)生細(xì)菌不僅誘導(dǎo)其生物堿的合成，同時(shí)可產(chǎn)生某些相同的生物堿。故本研究的下一步工作將對(duì)湖北半夏內(nèi)生細(xì)菌代謝產(chǎn)物多樣性及功能進(jìn)行研究，明確其作用機(jī)制，為提高半夏質(zhì)量及產(chǎn)量提供有力支持。