劉 政，安 琳，伍 濤，秦仲麒，楊 立，程寅勝

（1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹茶葉研究所/湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心果樹茶葉研究分中心，武漢 430064；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝植物生物學(xué)教育部重點實驗室，武漢 430072）

伴隨晝夜和季節(jié)周期性交替，生物體進(jìn)化出“生物鐘”這種內(nèi)在調(diào)節(jié)機(jī)制，使之適應(yīng)可預(yù)測的日常環(huán)境變化，達(dá)到更好生長和發(fā)育的目的［1，2］。光是植物生物鐘最主要的外界環(huán)境信號，植物通過各種光受體（如光敏色素、隱花色素等）感知光強(qiáng)/光質(zhì)變化，并將信號轉(zhuǎn)遞給中央振蕩器［3，4］。中央振蕩器是植物生物鐘的核心部分，它通過一系列連鎖的轉(zhuǎn)錄-翻譯反饋路徑產(chǎn)生周期性調(diào)控信號，并將其傳遞給下游調(diào)控基因［5，6］。目前已有研究表明，植物通過生物鐘機(jī)制產(chǎn)生與環(huán)境信號相適應(yīng)的節(jié)律，最終通過輸出途徑調(diào)節(jié)光合作用，進(jìn)而促進(jìn)生物量積累。例如，生物鐘能控制赤桉、菜豆和棉花的氣孔導(dǎo)度呈現(xiàn)24 h 周期性節(jié)律變化，這種變化形式與晝夜光照強(qiáng)弱變化相適應(yīng)，進(jìn)而更有效地促進(jìn)白天碳同化過程［7，8］。糖等光合作用產(chǎn)物是植物生物鐘一種重要的代謝輸出形式，而內(nèi)源的糖信號又反過來調(diào)控生物鐘基因的表達(dá)［9］。玉米雜種中，正是由于生物鐘基因ZmCCA1瞬時結(jié)合活性發(fā)生改變，提高了光合作用碳固定過程相關(guān)基因表達(dá)水平，進(jìn)而促進(jìn)雜種表現(xiàn)出比雙親更高的產(chǎn)量［10］。

梨是中國重要的果樹物種，其冠層結(jié)構(gòu)決定了光環(huán)境，進(jìn)而對光合作用產(chǎn)生影響。為了探索梨樹不同冠層光環(huán)境對光合作用變化的影響，前期利用轉(zhuǎn)錄組和光合生理數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)分析的方法，發(fā)現(xiàn)生物鐘周期節(jié)律代謝途徑顯著富集與田間梨樹凈光合速率表型密切相關(guān)的基因模塊，并發(fā)現(xiàn)梨生物鐘基因PpPRR5是該模塊的核心基因，然而該基因影響梨樹光合作用的功能尚未闡明。在擬南芥中，PpPRR5同源基因AtPRR5被報道是植物特有的偽應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白（Pseudo-Response Regulator）家族成員之一［11，12］。AtPRR5與家族其他成員協(xié)同調(diào)控了擬南芥生物鐘節(jié)律［13］。超量表達(dá)AtPRR5表現(xiàn)出短日照提早開花和紅光下呈現(xiàn)下胚軸變短的特征［14］；而Atprr5單突變體表現(xiàn)完全相反的表型［15］，三突變體（Atprr5 Atprr7 Atprr9）不僅表現(xiàn)出更為嚴(yán)重的相應(yīng)缺失表型［16］，而且還呈現(xiàn)出抑制側(cè)根形成和更高淀粉含量（特別是在黎明時期）的特點［17］。以上研究表明，AtPRR5響應(yīng)光信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，并在控制開花時間和早期光形態(tài)建成方面具有重要的功能。

基于AtPRR5基因具有以上重要功能，研究者對其調(diào)控機(jī)理進(jìn)行了深入探索。AtPRR家族是按照AtPRR9→AtPRR7→AtPRR5→AtPRR3→AtPRR1/AtTOC1的順序從黎明到黃昏依次轉(zhuǎn)錄翻譯到最高峰，并呈現(xiàn)出晝夜周期性規(guī)律，它們又共同對AtCCA1和AtLHY的表達(dá)具有反饋調(diào)節(jié)作用［13，18，19］。參與紅光信號輸入的轉(zhuǎn)錄調(diào)控者AtLNK1/AtLNK2能與AtRVE4/AtRVE8蛋白結(jié)合形成復(fù)合體，然后作用于AtPRR5啟動子驅(qū)動 其表 達(dá)；而AtPRR5 反過 來與AtLNK1、AtLNK2、AtRVE4和AtRVE8的啟動子結(jié)合，對其表達(dá)產(chǎn)生負(fù)反饋抑制效應(yīng)［20］。AtPRR5還參與到翻譯后水平調(diào)控：AtPRR5的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平并不完全同步；在光形態(tài)建成早期階段，AtZTL 蛋白能通過結(jié)合AtPRR5的PR結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)其泛素化降解；藍(lán)光具有活化AtZTL的LOV 結(jié)構(gòu)域作用，進(jìn)而通過改變與AtPRR5的結(jié)合構(gòu)象影響其蛋白穩(wěn)定性［21］。以上研究表明，AtPRR5表達(dá)能受到晝夜光強(qiáng)變化和不同光質(zhì)調(diào)控，并與重要功能基因在多種調(diào)控水平上發(fā)生互作。

前期研究表明，梨PpPRR5基因在調(diào)控光合作用中可能發(fā)揮重要功能［22］。其同源基因研究表明PRR5基因響應(yīng)光信號的特性，但調(diào)控光合作用的機(jī)制尚未闡明。因此，進(jìn)一步明晰PpPRR5對梨樹光合作用的調(diào)控作用，對于挖掘關(guān)鍵基因加速梨樹高光效分子育種以及探索高光效栽培措施具有重要意義。本研究比較分析了不同類型梨品種（包括砂梨、白梨以及西洋梨）光合作用差異，檢測了PpPRR5基因在不同品種中的表達(dá)水平變化模式，該研究結(jié)果為進(jìn)一步解析PpPRR5在梨樹光合作用中的作用提供分子水平上的證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與光合速率測定

不同梨品種的光合作用測定試驗在湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹茶葉研究所梨遺傳育種圃進(jìn)行。供試?yán)嫫贩N為阿巴特（西洋梨）、伏茄（西洋梨）、碭山酥梨（白梨）、中梨1 號（白梨與砂梨的雜交種）、翠冠（砂梨）。各品種栽培管理一致，測定樹冠向陽面的外圍長勢中庸的新稍中部（5～6 葉位），葉齡為90 d。凈光合速率使用美國PP SYSTEMS 公司的CIRAS-3 便攜式光合作用測定系統(tǒng)在上午9：00—10：00 進(jìn)行測定。每個品種隨機(jī)選擇3 片葉作為3 次生物學(xué)重復(fù)，測定后迅速放進(jìn)液氮，并于-80 ℃長期保存。

1.2 總RNA 提取、質(zhì)量檢測與cDNA 合成

利用RNAprep Pure 多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒提取不同梨品種葉組織的總RNA。通過瓊脂糖凝膠電泳評價RNA的完整性，NanoPhotometerTM-spectrophotometer（IMPLEN，Germany）檢測其濃度。以總RNA 為模板，使用RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas，USA）進(jìn)行cDNA 第一鏈的合成。上述操作過程均按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3 qRT-PCR 分析

實時熒光定量PCR 在ABI（Applied Biosytems）7500 機(jī)器上進(jìn)行，qRT-PCR 反應(yīng)體系為10 μL，其中包括0.5 μL cDNA，0.5 μL正向、反向引物，5 μL的2×SYBR GREEN PCR Master Mix（Applied Biosystems，USA），ddH2O 補(bǔ)齊至10 μL。qRT-PCR 反應(yīng)程序為：50 ℃，5 min；40 個循環(huán)（95 ℃，10 min；95 ℃，15 s；60 ℃，1 min）。反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行熔解曲線分析，用于檢測引物擴(kuò)增的特異性。利用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計PpPRR5定量引物，正向引物為5′-ATCATC ACTCTGGCTACTG-3′，反向引物為5′-CCTTTCAC GGGAACTGG-3′。選擇在梨葉組織中穩(wěn)定表達(dá)的SKD1和YLS8基因共同作為標(biāo)準(zhǔn)化因子［23］。基因的相對表達(dá)量分析用2-ΔΔCt法，每個樣品做3 次生物學(xué)重復(fù)和4 次技術(shù)重復(fù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

運用IBM SPSS Statistics 19 軟件對試驗結(jié)果進(jìn)行差異顯著性檢驗，顯著水平P≤0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同梨品種凈光合速率差異

不同梨品種之間凈光合速率存在差異，凈光合速率由高到低依次為翠冠＞中梨1 號＞碭山酥梨＞伏茄＞阿巴特（圖1）。由圖1 可以發(fā)現(xiàn)，2 個西洋梨類（伏茄和阿巴特）品種光合能力相對較弱；砂梨類品種（翠冠）光合速率最高，且與西洋梨類和白梨類（碭山酥梨）有顯著性差異；碭山酥梨和中梨1 號（白梨與砂梨的雜交種）光合速率居中。

圖1 不同梨品種凈光合速率

2.2 PpPRR5基因在不同梨品種中的表達(dá)變化模式

利用qRT-PCR 技術(shù)檢測了PpPRR5在不同梨品種中的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)PpPRR5表達(dá)水平在不同梨品種葉組織中存在顯著性差異，其相對表達(dá)量由高到低的順序是阿巴特＞伏茄＞碭山酥梨＞中梨1 號＞翠冠（圖2）。PpPRR5在不同品種中的表達(dá)模式與凈光合速率高低的變化趨勢相反，暗示PpPRR5可能是梨光合作用的一個負(fù)調(diào)控因子。

圖2 PpPRR5 基因在不同梨品種中的表達(dá)變化模式

3 小結(jié)與討論

前期研究篩選出一個與梨樹冠層光合作用密切相關(guān)的基因PpPRR5，發(fā)現(xiàn)相對于開張的冠層區(qū)域葉片（凈光合速率值較高），PpPRR5在郁閉的冠層區(qū)域葉片（凈光合速率值較低）中表達(dá)水平更高［22］。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，PpPRR5表達(dá)水平與不同梨品種的光合作用能力呈負(fù)相關(guān)性（圖2）。PpPRR5表達(dá)分析結(jié)果表明，該基因可能是一個梨樹光合作用的負(fù)調(diào)控因子。其擬南芥同源基因AtPRR5被報道響應(yīng)紅光信號，靶基因直接參與到紅光/遠(yuǎn)紅光信號途徑［11］。光譜檢測分析發(fā)現(xiàn)，相對于高光效栽培模式，光合作用密切相關(guān)的紅光含量在傳統(tǒng)栽培模式的冠層內(nèi)膛顯著降低，這些變化的光信號可能是光合速率差異的主要環(huán)境因素［22］?；谇捌谘芯拷Y(jié)果以及前人對生物鐘的研究認(rèn)識，推測由于果園冠層環(huán)境和晝夜變化均存在不斷變化的光信號，生物鐘關(guān)鍵基因PpPRR5可能響應(yīng)外界光信號并對梨樹光合作用水平產(chǎn)生調(diào)控作用。未來可在梨中對PpPRR5進(jìn)行深入的功能解析，并從靶基因互作這個角度進(jìn)一步探索其調(diào)控光合作用的分子機(jī)制，為梨樹高光效分子育種提供基因資源。