黃 濤，潘愛鑾，申 杰，吳 艷，蒲躍進，張 昊，孫 靜，梁振華，杜金平，朱昌友，皮勁松

（1.湖北省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所/湖北省農業(yè)科技創(chuàng)新中心/動物胚胎與分子育種湖北省重點實驗室，武漢 430064；2.湖北省畜牧良種場，武漢 434010）

江漢雞為中國地方品種，是湖北省非常重要的地方雞遺傳資源。江漢雞是在江漢平原上進化長時間馴化而成的，具有自身明顯的特征，以黃麻羽居多，體重較輕，屬蛋肉兼用型，自然群體里有部分雞產(chǎn)綠殼蛋［1］。雖然江漢雞具有產(chǎn)品品質好、抗逆性強、耐粗飼等優(yōu)點，但也存在一些不足，主要表現(xiàn)在生長速度較慢、產(chǎn)蛋少、飼料轉化率低、生產(chǎn)成本高［2］。湖北省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所家禽試驗場開展對江漢雞的保種與開發(fā)利用工作，基于江漢雞的配套利用［3］進行選育，挖掘江漢雞遺傳特色是對其進行開發(fā)利用的緊迫任務，獲取江漢雞群體遺傳變異信息，對功能位點的預測與篩選或許有利于今后的開發(fā)利用。

卵泡雌激素（FSH）是促卵泡素（Follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH），由垂體前葉分泌，是一種糖蛋白激素。FSH 分子是由α 和β 2 個亞基組成的異質二聚體，當β 亞基與α 亞基結合時其才具有生物學活性［4］。FSHβ基因對雞性成熟和生殖等具有調控作用，能刺激卵泡發(fā)育和成熟，產(chǎn)生雌激素和促進排卵。李江曼［5］在不同品種雞的FSHβ基因檢測到單堿基突變位點與寧都黃雞的產(chǎn)蛋性能顯著相關；秦玉梅等［6］在雞FSHβ基因中發(fā)現(xiàn)該位點與玫瑰冠雞和海蘭褐蛋雞300 日齡產(chǎn)蛋數(shù)顯著相關。本研究基于基因組重測序結果鑒定江漢雞群體FSHβ基因的遺傳變異信息，通過生物信息學方法預測功能性變異位點。

1 材料與方法

1.1 試驗樣品

江漢雞來源于湖北省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所家禽試驗雞場。在18 周齡時隨機抽取30 只進行腋下采血，于抗凝管中保存。DNA的提取采用天根DNA 提取試劑盒（TIANamp Blood DNA Kit）進行，提取的DNA 用NanoDrop 2 000 進行濃度測定。將各樣品稀釋到100 ng/μL，然后每個樣品取3 μL進行混池。

1.2 重測序分析

DNA 樣品送往百易匯能公司進行建庫測序。在獲取原始數(shù)據(jù)后，首先使用cutadapt 軟件進行clean reads 操作。下載Galgal6 參考基因組，使用bwa 軟件建立索引。運用SAMtools 軟件對clean reads 進行序列比對組裝。生成Bam 文件，建立索引后導入IGV軟件中收集變異位點。使用GATK 軟件對bam 文件進行變異位點整理生成vcf文件，該文件里包含基因組遺傳變異信息。

1.3 生物信息學預測

針對FSHβ基因序列中的遺傳變異，篩選潛在的功能性變異。分析內容包括3 個部分，分別為M6A 分析、調控元件分析和miRNA 結合位點預測分析。設定mRNA（NM_204257.1）序列第一個堿基為+1。使用RNAfold web server 進行cds 區(qū)二級結構分析；使用SRAMP（http：//www.cuilab.cn/sramp/）在線軟件對序列進行M6A 分析；在對調控元件進行分析時，采用JASPAR（http：//jaspar.genereg.net/）在線分析軟件，設置置信參數(shù)大于85。在對miRNA 結合位點預測分析時，采用miRDB（http：//mirdb.org/）在線軟件進行分析，保留target score為60以上的結果。

2 結果與分析

2.1 江漢雞群體FSHβ 基因遺傳變異

基于基因組重測序數(shù)據(jù)，獲取江漢雞群體FSHβ基因所有遺傳變異信息（圖1、圖2）。FSHβ基因包括有2 個內含子和3 個外顯子。外顯子又可以分為5′utr、cds和3′utr。本研究在江漢雞群體中發(fā)現(xiàn)該基因共有35 個SNPs 和2 個indels。其中外顯子有31個SNPs，其分布為5′utr 區(qū)0 個，cds 區(qū)2 個，3′utr 區(qū)29 個；內含子有4 個SNPs。此外，發(fā)現(xiàn)的2 個indels位于3′utr區(qū)。

圖1 江漢雞群體FSHβ 基因內遺傳變異信息統(tǒng)計

圖2 江漢雞FSHβ 基因內出現(xiàn)6 個連續(xù)堿基indel（紅框）

2.2 FSHβ 蛋白結構分析

在江漢雞中發(fā)現(xiàn)位于FSHβ基因cds 區(qū)有2 個SNPs，位于+297 位置G 突變成A，屬于非同義突變，造成其由甘氨酸變成絲氨酸。位于+431 位置C 突變成T，屬于同義突變，未發(fā)生氨基酸變化。比較非同義突變對RNA 二級結構的影響，結果發(fā)現(xiàn)，G 突變成A 自由能由-441.29 kJ/mol 變?yōu)?444.22 kJ/mol，C突變成T自由能由-441.29 kJ/mol變?yōu)?441.71 kJ/mol。+297 和+431 位點 突變 前后cds 區(qū)RNA 二級結構變化情況見圖3。甘氨酸突變成絲氨酸，蛋白質分子式由C643H967N161O203S17變成C644H969N161O204S17?？偲骄H水性由-0.069 變成-0.072，不穩(wěn)定指數(shù)和理論等電點未發(fā)生變化。

圖3 突變對FSHβ 二級結構的影響

2.3 FSHβ 基因M6A 分析

使用SRAMP 在線軟件對FSHβ的mRNA（NM_204257.1）序列進行分析，預測M6A 修飾位點。結果顯示該轉錄本內有10 個潛在的M6A 修飾位點，對應的位置分別在+110、+152、+376、+392、+518、+1398、+1408、+1684、+1691、+1874。其中，1 個位點具有極高置信度（very high confidence），5 個位點具有高置信度（high confidence），3 個位點具有中置信度（moderate confidence），1 個位點具有低置信度（low confidence），這10 個位點在江漢雞群體中沒有發(fā)生遺傳變異。

2.4 FSHβ 基因調控元件預測分析

使用JASPAR 在線軟件對FSHβ的mRNA（NM_204257.1）序列進行分析，預測轉錄因子結合位點。在設置置信參數(shù)為85%后，獲取70 個潛在的轉錄因子調控元件，主要涉及5 個轉錄因子（圖4），分別包括TFAP2A、RUNX1、AG、AGL3 和arnt。在江漢雞群體中，發(fā)現(xiàn)7 個SNPs 位于調控元件的序列中（表1）。值得注意的是，TFAP2A 靶向的調控元件序列中分別包含2 個SNPs，且都位于正鏈上。

表1 FSHβ 基因轉錄本內有江漢雞遺傳變異位點的調控作用元件

圖4 轉錄因子種類與數(shù)量統(tǒng)計結果

2.5 FSHβ 基因靶向miRNA 預測分析

使用miRDB 在線軟件對FSHβ的mRNA（NM_204257.1）序列進行分析，預測miRNA 結合位點。設置分數(shù)在60 以上后獲取51 個miRNAs，這些miRNAs具有靶向轉錄本調控基因表達的潛力。通過對這51個miRNAs的種子序列進行分析，發(fā)現(xiàn)部分miRNA的種子序列中包含有江漢雞SNPs。其中gga-miR-6605-5p的種子序列中包含多達3 個SNPs。將種子序列有SNPs的miRNAs 列出（表2），可用于江漢雞繁殖性狀中的調控作用研究。

表2 種子序列中包含有江漢雞遺傳變異位點的miRNAs

3 小結與討論

隨著基因組重測序技術的普及，獲取地方雞基因組遺傳變異信息變得越來越容易。但是，如何在海量的遺傳變異位點中篩選出功能性變異依然具有很大的挑戰(zhàn)性。地方遺傳資源的開發(fā)與利用，歸根結底要利用功能性的遺傳變異進行遺傳改良，而這也是應用性研究的主要內容。本研究關注繁殖激素FSH的β 亞基基因序列，利用基因組重測序技術，獲取該基因序列在江漢雞群體中所有的遺傳變異位點。通過M6A 預測分析、調控元件預測分析和miRNA 結合序列分析，篩選出具有潛在功能性的遺傳變異位點，用于今后的進一步研究。

FSHβ基因內有豐富的遺傳變異位點，且存在品種特性。王鵬等［7］在儋州雞FSHβ基因鑒定出25 個SNP 位點，其中21 個SNPs 也存在于江漢雞群體中。通過比較發(fā)現(xiàn)，兩個品種之間有部分SNPs 屬于品種特有，這些遺傳變異位點具有較高的研究價值。

FSHβ基因富含遺傳多態(tài)位點，有報道與產(chǎn)蛋性狀有關。在江漢雞+931 位置SNP，洪坤月等［8］發(fā)現(xiàn)該位點與綠殼蛋雞開產(chǎn)日齡相關。在江漢雞+1024位置有SNP，田艷苓等［9］發(fā)現(xiàn)該位點與濟寧百日雞開產(chǎn)日齡有關。李江曼［5］在+868 位置發(fā)現(xiàn)SNP 與寧都黃雞產(chǎn)蛋性能顯著相關，但是江漢雞群體中沒有該變異。在江漢雞轉錄本3′utr 區(qū)+1299 位置為純合型，但在玫瑰冠雞和海蘭褐蛋雞中，秦玉梅等［6］發(fā)現(xiàn)該位置的堿基突變，且與300 日齡產(chǎn)蛋數(shù)有關，該結果與孫杰等［10］的研究結果基本一致。王亞男［11］在FSHβ基因中發(fā)現(xiàn)了3 處SNPs 與京海黃雞體增重有關，3 處變異位點對應在轉錄本+606、+607 和+898位置，該位置與江漢雞變異情況一致，預測結果顯示+606、+607 位置位于TFAP2A 調控元件內，推測在體增重過程中其參與一定調控作用。韓厚明［12］在文昌雞FSHβ基因外顯子中發(fā)現(xiàn)3 處SNPs，其對應在轉錄本+898、+931 和+1024 位置，與江漢雞變異情況一致。不過，文昌雞中上述3 個位點未見與產(chǎn)蛋性能關聯(lián)。

總之，對江漢雞FSHβ基因進行遺傳多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)35 個SNPs 和2 個indels。值得注意的是，在這些變異位點之中，1 個SNP 位于cds 區(qū)造成甘氨酸變成絲氨酸。此外還發(fā)現(xiàn)7 個SNPs 位于潛在的調控元件序列中，7 個SNPs 和1 個indel 位于潛在的miRNA 結合序列中。所篩選的上述遺傳變異位點，可能參與了FSHβ基因的表達調控，在江漢雞遺傳特性中扮演一定的角色。