劉洪璐，羅 煜，夏加偉，陸霓虹

（昆明市第三人民醫(yī)院 1．呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科；2．腫瘤科；3．重癥醫(yī)學(xué)科，云南 昆明 650041）

肺結(jié)核是嚴(yán)重危害人類身體健康的乙類傳染病。中國是全球30個結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家之一，結(jié)核患者占全球9%，發(fā)病人數(shù)86.6萬例[1]。有學(xué)者曾報道早期分泌性抗原靶6（early secretory antigenic target-6，ESAT-6）對肺結(jié)核尤其是菌陰肺結(jié)核診斷的特異性和靈敏度均較高，可作為肺結(jié)核的輔助診斷方法[2]。項目組前期對ESAT-6與肺結(jié)核病程進(jìn)展之間的關(guān)系進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)ESAT-6蛋白在涂陽患者外周血中表達(dá)量高于涂陰患者[3]。但未見外周血ESAT-6蛋白及其mRNA用于診斷肺結(jié)核的報道。本研究通過比較肺結(jié)核患者及健康體檢者外周血ESAT-6蛋白及mRNA表達(dá)，并與傳統(tǒng)痰檢（包括痰涂片和痰培養(yǎng)）、灌洗液X-pert檢查、斑點試驗等檢測方法進(jìn)行對比，評估ESAT-6蛋白及其mRNA 在肺結(jié)核診斷中的臨床價值，現(xiàn)報告如下。

1 方法與步驟

1.1 病例來源

選擇昆明市第三人民醫(yī)院2018年1月-2019年1月收治的診斷為肺結(jié)核的患者41例。肺結(jié)核診斷按2017年肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)（WS288-2017）[4]進(jìn)行。體檢中心胸部X線無異常健康對照者20例，2組之間性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。抽取空腹靜脈血分別進(jìn)行ESAT-6蛋白和mRNA 檢測。結(jié)核患者完善痰涂片、培養(yǎng)、灌洗液X-pert 檢查、斑點試驗等結(jié)核相關(guān)檢測，完善血常規(guī)、感染指標(biāo)、血沉、凝血等指標(biāo)。該研究已通過醫(yī)院倫理委員會審核（編號2017091403），所有入組患者均簽署知情同意書。

納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴符合上述診斷標(biāo)準(zhǔn)的各組人群；⑵年齡18-80歲；⑶首次發(fā)病就診，未抗結(jié)核治療，檢查資料完整。

排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴檢查資料不完全或上述檢查未完成患者；⑵合并其他肺部病變或其他系統(tǒng)嚴(yán)重疾病不能配合者；⑶未簽署知情同意書。

1.2 主要設(shè)備及試劑

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、高速冷凍離心機(jī)、酶標(biāo)儀、定量PCR儀、紫外分光光度計；人ESAT-6酶聯(lián)免疫分析試劑盒、Trizol、天根逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑。

1.3 試驗方法

1.3.1 血樣處理

抗凝管收集3mL空腹血液標(biāo)本，4℃2000rpm轉(zhuǎn)速離心5min，收集上清（血漿）用于RNA提取。血清管收集3mL空腹血液標(biāo)本，4℃2000rpm轉(zhuǎn)速離心5min，收集上清（血清）用于酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）。

1.3.2 ESAT-6 RNA表達(dá)量

廣州invitrogen公司設(shè)計并合成引物，引物序列：

ESAT-6 F Primer：5'-GAGCAGCAGTGGAATTTC-3'

ESAT-6 R Primer：5'-GTCAAGGAGGGAATGAATG-3'

用總RNA 提取試劑（total RNA extraction reagent，Trizol）一步法抽提總RNA。按照FastKing RT Kit（With gDNase）試劑盒說明，進(jìn)行ESAT6 mRNA 的提取檢測。采用2-△△Ct法分析結(jié)果，2-△△Ct＝2-［（Ct實驗組目的基因-Ct實驗組內(nèi)參基因）-（Ct對照組目的基因-Ct對照組內(nèi)參基因）］。

1.3.3 ESAT-6蛋白表達(dá)量

按人ESAT-6酶聯(lián)免疫分析（ELISA）試劑盒說明書檢測ESAT-6蛋白并計算ESAT-6蛋白含量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS22.0軟件統(tǒng)計分析，偏態(tài)分布的計量資料以“中位數(shù)（四分位數(shù)）》［M（Q1，Q3）］表示，2 組間差異的比較采用Mann-Whitney U檢驗。年齡、性別基線比較采用卡方檢驗，不同檢測方法之間的比較采用McNemar檢驗，相關(guān)性分析采用Spearman 秩相關(guān)P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。檢驗效率及界值使用受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC）分析。

2 結(jié)果

2.1 ESAT-6蛋白及mRNA在2組患者中的表達(dá)情況

肺結(jié)核患者ESAT-6 蛋白表達(dá)量為26.061（21.785，24.547）pg/mL，顯著高于健康對照組的0.000pg/mL（P＜0.001）；肺結(jié)核患者ESAT-6的mRNA 相對表達(dá)量為8.271（2.206，24.547），高于健康對照組的0.064（0.036，1.509） （P＜0.001），因此ESAT-6可用于肺結(jié)核的診斷，且蛋白優(yōu)于mRNA，見圖1的A、B。

圖1 A．ESAT-6 蛋白在2 組人群中的表達(dá)量；B．ESAT-6 mRNA 在2 組人群中的相對表達(dá)量

2.2 ESAT-6 mRNA表達(dá)與其他結(jié)核檢測手段之間的關(guān)系，見表1。

表1 肺結(jié)核不同檢測方法與ESAT-6 mRNA、ESAT-6 蛋白表達(dá)之間的關(guān)系

肺結(jié)核患者ESAT-6的mRNA陽性率為87.8%，與傳統(tǒng)結(jié)核檢測方法痰檢、X-pert相比，陽性率不同（P＜0.05），高于痰檢的36.59% （15/41） 和X-pert 檢測的24.39% （10/41），與斑點試驗、ESAT-6 蛋白相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。肺結(jié)核患者ESAT-6 蛋白檢測陽性率為92.68%，與傳統(tǒng)結(jié)核檢測方法相比陽性率不同（P＜0.05），高于痰檢的36.59%、斑點試驗的68.29% （28/41）和X-pert檢測的24.39%。

2.3 ESAT-6蛋白及mRNA對肺結(jié)核診斷的敏感性和特異性

ESAT-6蛋白診斷肺結(jié)核的ROC曲線下面積（area under curve，AUC）為0.963［＜0.001，95%CI（0.915，1.000）］。ESAT-6 mRNA診斷肺結(jié)核的AUC 為0.894［P＜0.001，95%置信區(qū)間（0.817，0.971）］，兩者均對肺結(jié)核患者有較高的診斷價值，且ESAT-6 蛋白診斷效率優(yōu)于mRNA。根據(jù)ROC曲線計算約登指數(shù)和乘積指數(shù)最大值、歐氏指數(shù)最小值、綜合三者確定最佳閾值，并計算靈敏度和特異性。ESAT-6蛋白的cut off值為9.272 pg/mL，此時靈敏度為92.68%，特異性為100.00%。ESAT-6 mRNA 的cut off值為2.004，此時靈敏度為78.05%，特異性為85.00%，見圖2。

圖2 ESAT-6蛋白及mRNA對肺結(jié)核診斷的ROC曲線

3 討論

ESAT-6屬于ESAT-6/WXG-100超家族成員，結(jié)構(gòu)包括具有保守結(jié)構(gòu)的Trp-X-Gly序列和對生物的活性構(gòu)象、分泌和分枝桿菌毒力至關(guān)重要的Leu29 序列[5]，與結(jié)核分枝桿菌（M.tuberculosis，MTB）的毒力和致病性相關(guān)。ESAT-6可與層粘連蛋白結(jié)合引起肺上皮細(xì)胞溶解，在MTB的傳播中起作用[6]。因此，檢測ESAT-6表達(dá)可用于人類是否感染MTB 的診斷，以及進(jìn)一步評估感染后病情嚴(yán)重程度。

ESAT-6作為毒力因子，僅在致病性MTB中表達(dá)，所以肺結(jié)核患者組均見升高，而在健康對照組因未感染MTB，檢測無ESAT-6蛋白表達(dá)，與文獻(xiàn)報道相符[7]。本研究顯示肺結(jié)核患者ESAT-6蛋白檢測陽性率高于mRNA，考慮mRNA在血液中半衰期較短，不容易檢測到，而翻譯成蛋白質(zhì)后性質(zhì)較穩(wěn)定，因此部分患者mRNA表達(dá)量不高。

斑點試驗是一種以T細(xì)胞免疫應(yīng)答為基礎(chǔ)的γ干擾素釋放實驗。一項Meta分析顯示斑點試驗對菌陰肺結(jié)核輔助診斷的靈敏度為87.4%、特異度為84.5%，有較高的診斷價值[8]。本研究結(jié)果顯示，斑點試驗陽性率僅為68.29%，符合文獻(xiàn)報道，但與ESAT-6 蛋白與mRNA檢測陽性率比較相對偏低，提示ESAT-6蛋白與mRNA檢測與常規(guī)檢測方法比較準(zhǔn)確率更高。

文獻(xiàn)報道腦脊液中ESAT-6 蛋白敏感性在67.35%-88%之間[9]，與患者腦脊液MTB濃度相關(guān)，當(dāng)濃縮腦脊液后其敏感性可達(dá)到100%[10]。濃縮的腦脊液及胸水中ESAT-6 蛋白檢測的靈敏度為72.4%，特異度為90%[11]。有學(xué)者檢測痰液培養(yǎng)標(biāo)本中的ESAT-6蛋白，其敏感性為84.4%，特異性為95.9%[12]。在本研究中，根據(jù)ROC曲線計算，當(dāng)外周血ESAT-6蛋白的cut off值為9.272 pg/mL時，具有較高的檢測效能，靈敏度、特異性分別為92.68%和100.00%。因此，直接檢測ESAT-6蛋白表達(dá)有助于結(jié)核的診斷。

菌陰性肺結(jié)核患者在結(jié)核患病人群中占比超過60%，因缺乏臨床診斷證據(jù)診斷困難。通過本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ESAT-6蛋白和mRNA檢測與其他傳統(tǒng)檢測手段相比，陽性率明顯高于痰涂片和X-pert診斷。在26 例痰檢陰性肺結(jié)核患者中有23 例ESAT-6 mRNA 陽性，25例ESAT-6蛋白陽性，提示ESAT-6 與mRNA可聯(lián)合用于菌陰肺結(jié)核的輔助診斷，提高臨床確診率。

綜上所述，外周血ESAT-6蛋白及mRNA檢測在肺結(jié)核患者中診斷陽性率優(yōu)于其他傳統(tǒng)檢測方法，可用于診斷肺結(jié)核，尤其是菌陰肺結(jié)核的確診，從而減少肺結(jié)核的漏診及誤診，具有較高的臨床價值及意義。