李 菲，李 喆，覃仙玲，黃庶識，蘇芯瑩，潘信利**

(1.廣西科學院，廣西近海海洋環(huán)境科學重點實驗室，廣西南寧 530007；2.廣西科學院，廣西海洋天然產物與組合生物合成化學重點實驗室，廣西南寧 530007)

0 引言

中國是農業(yè)種植和畜禽養(yǎng)殖的大國，農作物秸稈的露天焚燒及畜禽糞便的隨意排放給環(huán)境帶來嚴重的污染[1，2]。目前，高溫堆肥是農作物秸稈及畜禽糞便資源化利用的重要方式。堆肥技術以微生物為主導[3]，對堆肥中結構復雜的木質纖維素原料進行解聚或分解[4，5]，轉化成農業(yè)生產上所需的肥料。堆肥的高溫期溫度可達55℃以上，是原料中病原菌、蟲卵和雜草種子滅活及驅動秸稈腐熟的主要階段[3]。但是，過高的溫度會抑制土著微生物的活性，降低堆肥中微生物的豐度和多樣性，甚至導致菌株活性喪失，從而限制木質纖維素的降解速度[6，7]，而在堆肥過程中添加耐高溫纖維素分解菌則可以有效解決這些問題[8]。研究表明，添加纖維素降解微生物，特別是高溫降解微生物，能夠加快木質纖維素降解，促進堆肥腐熟，提高堆肥效率[9-11]。目前，國內外學者已從堆肥中分離出多種高溫纖維素降解菌，如鏈霉菌Streptomycessp.CN9[12]，煙曲霉菌AspergillusfumigatusZ5[13]，解淀粉芽孢桿菌BacillusamyloliquefaciensXD-3[14]，梭狀芽孢桿菌Clostridiumsp.，假絲酵母菌Candidasp.[15]等。然而，已有報道中高溫纖維素分解菌耐受溫度大多為50-60℃，而實際生產中好氧堆肥高溫期的溫度可高達70℃，這使得大部分菌株的活性降低甚至失活，從而導致該階段的纖維素分解速度大幅下降，難以適應生產需求。為了更好地滿足實際生產需求，篩選耐高溫的纖維素降解菌并研究其纖維素酶活的熱穩(wěn)定性，對加速高溫好氧堆肥的腐熟進程具有重要意義。

紅樹林作為熱帶和亞熱帶的獨特潮間帶生態(tài)系統(tǒng)，常年受到海水周期性浸淹、波浪、強風、強流、徑流、沉積物及污水(廢水)等特殊因素的影響，促使其組成成分多樣化，能量和物質循環(huán)速度加快，生產力和有機質的降解活性增強，大量的植物殘體和落葉的堆積，不斷為微生物提供纖維素等物質[16]。胡芮等[17]在紅樹林土壤中獲得一株產嗜熱纖維素酶的枯草芽孢桿菌，該菌株在55-60℃時可維持較高酶活；曾思泉等[18]從三亞紅沙河紅樹林區(qū)分離出一株降解纖維素的枝孢屬真菌SCSIO 43503，在45-50℃時纖維素酶活性較高?？梢姡瑥募t樹林生境獲得產纖維素酶菌株具有廣泛的研究前景。廣西山口紅樹林是廣西紅樹林濕地特征的紅樹林自然保護區(qū)之一[19]，屬北熱帶季風區(qū)，生長著白骨壤、桐花樹、秋茄等紅樹植物，有111種大型底棲動物[20]，其海水污染程度低，動植物資源豐富，具有較強的研究價值。

本研究以廣西山口紅樹林保護區(qū)內的土壤作為研究對象，通過16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹分析，獲得紅樹林土壤中可培養(yǎng)芽孢桿菌的多樣性信息。同時，結合剛果紅纖維素培養(yǎng)法、濾紙條崩解試驗、纖維素酶活測定法，篩選出具有耐高溫、穩(wěn)定性強的纖維素酶活性菌株，為從海洋環(huán)境中尋找新的微生物資源提供理論依據(jù)和實踐指導。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 紅樹林土壤樣本

2019年5月從廣西山口紅樹林自然保護區(qū)(109°38′14″ E，21°28′53″ N)中采集潮間帶低潮3處土壤樣本(每處相距5 m，由近岸紅樹林往外采集)，每處土壤取至地下0.5 m深，將樣品混合后裝于密封袋，4℃低溫保藏備用。

1.1.2 主要試劑和儀器

培養(yǎng)基原料、TAE緩沖液、2×EasyTaq SuperMix、擴增引物、DNA Marker、GoldView核酸染料等購于北京康為世紀生物科技有限公司，Chelex 100樹脂購于美國BioRad公司。使用的儀器包括SW-CJ-2F型超凈工作臺、HH.B11-BS-II型恒溫培養(yǎng)箱、TS-100C型恒溫振蕩器、VB-55型高壓滅菌鍋、Tgradient型PCR擴增儀、伯樂電泳儀、凝膠成像儀、泰斯特SYG數(shù)顯實驗水浴鍋、Thermo酶標儀等。

1.1.3 培養(yǎng)基

(1)細菌分離培養(yǎng)基：M7、M10、M5和P3，其配方詳見表1。

表1 細菌分離培養(yǎng)基配方

(2)純化培養(yǎng)基：鏈霉菌培養(yǎng)基2號(ISP2)的改良固體培養(yǎng)基[21]。

(3)纖維素酶初/復篩培養(yǎng)基：剛果紅纖維素培養(yǎng)基，參照文獻[22]配制，羧甲基纖維素鈉10.0 g，復合鹽母液10 mL，2 g/L剛果紅染液1 mL，瓊脂14.0 g。

(4)羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)發(fā)酵培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉5.0 g，復合鹽母液10 mL，蒸餾水1 000 mL。

(5)濾紙條培養(yǎng)基配方：胰蛋白胨1.0 g，2張1 cm×6 cm濾紙條，去離子水1 000 mL。

1.1.4 其他試劑配制

(1)DNS溶液：酒石酸鉀鈉182 g，3,5-二硝基水楊酸6.3 g，NaOH 21 g，苯酚5 g，蒸餾水1 000 mL；儲存至棕色瓶中，室溫條件下放置7 d后使用，有效期6個月。

(2)檸檬酸-Na2HPO3緩沖液A：7.16 g Na2HPO3溶于水，加入2.1 g檸檬酸，定容至200 mL，pH值約為5.0。

1.2 方法

1.2.1 菌株分離純化

稱取2.0 g樣品裝于20 mL無菌水中搖勻，即為原液；將原液按10-2和10-3比例進行稀釋，備用。取200 μL樣液分別涂布至4種分離培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)3-7 d，并隨時觀察菌株的生長情況，挑取肉眼可見菌落進行純化培養(yǎng)，記錄其形態(tài)特征和菌落數(shù)，以30%(V∶V)甘油-ISP2混合液作為保護劑，將純化好的菌株保存于凍存管并置于-70℃冰箱內。

1.2.2 16S rRNA基因測序和系統(tǒng)發(fā)育分析

采用chelex-100樹脂[23]快速提取細菌的DNA并作為PCR模板，根據(jù)Walsh等[24]的方法對其進行PCR擴增。擴增和測序引物均為細菌通用引物27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3′)和1522R (5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′)，PCR反應條件參照李菲等[25]的方法設定。擴增產物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，委托北京擎科新業(yè)生物技術有限公司進行測序分析。序列經(jīng)BioEdit Sequence Alignment Editor軟件整理后，利用EzBioCloud數(shù)據(jù)庫(https://www.ezbiocloud.net/)進行在線比對[26]；選取同源性最高菌株的序列作為參比對象，采用MEGA 10.0軟件中的Neighbor-Joining法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，通過重復取樣1 000次所獲得的自舉值檢測各分支的置信值，對各菌株的系統(tǒng)發(fā)育地位進行分析[27]。采用Excel軟件計算多樣性指數(shù)，計算公式如下：

Simpson指數(shù)：

λ=1-∑(Ni/N)2；

Shannon-Wiener指數(shù)：

H′=-∑Ni/N(lnNi/N)；

Pielou指數(shù)：

P=∑[(Ni/N)(N-Ni)/(N-1)]，

其中，N為分離到的細菌菌株數(shù)總和，Ni為第i個菌種的菌株數(shù)。

1.2.3 產纖維素酶菌的篩選

運用點植法將待測芽孢桿菌接種于纖維素酶活初篩培養(yǎng)基上，40℃恒溫培養(yǎng)3 d。用平板透明圈法初步判定菌株的纖維素酶活性，對選出具有纖維素酶活性的菌株進行50，60和70℃耐高溫復篩，觀察培養(yǎng)基上菌苔產生透明圈的情況；并用游標卡尺測量菌落直徑(D)和透明圈直徑(H)，計算H/D值，直徑比大表示菌株水解CMC的能力強[28]。選取酶活性顯著的菌株進行下一步研究(濾紙條崩解試驗)。用0.9%滅菌的生理鹽水將新鮮的活性菌株制成菌懸液，調節(jié)OD600值至0.6。在98 mL濾紙條培養(yǎng)基中接入2 mL菌液，在37℃、180 r/min下培養(yǎng)7 d，以不接種菌種的濾紙條培養(yǎng)基作為空白組，每組3個重復。根據(jù)濾紙條的斷裂崩解程度來初步判斷菌株的降解性能[29]。

1.2.4 纖維素酶活力測定

(1)粗酶液制備

挑取新鮮活性菌株，加入0.9%滅菌的生理鹽水制成菌懸液，用麥氏比濁管將菌懸液濃度調至約1×108CFU/mL，取2%菌懸液接種至10 mL CMC-Na發(fā)酵培養(yǎng)基中，50℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)3 d，6 000 r/min離心10 min，上清液即為粗酶液。

(2)葡萄糖標準曲線繪制

分別取0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7 mg/mL的葡萄糖溶液2 mL，加入1 mL DNS溶液，沸水浴10 min，冷卻后補加21.5 mL蒸餾水。在540 nm波長下測定其吸光值，并繪制葡萄糖標準曲線。

(3)菌株纖維素酶活力測定

通過測定濾紙酶活(FPA)、內切酶酶活(CMCase)和外切酶酶活(C1)，綜合表征菌株粗酶液纖維素酶活力。測定參數(shù)和反應條件如表2所示。待反應結束，分別加入1.5 mL DNS試劑，沸水浴10 min后置于冷水中冷卻；用酶標儀測定其吸光值，設定波長為540 nm。參照葡萄糖標準曲線方程[y=0.5148x-0.0171 (R2=0.997 8)]，分別計算這4株菌株的濾紙酶(FPase)、纖維素內切酶(CMCase)和外切酶(C1)酶活，分析其在50-90℃時相對酶活的變化規(guī)律，以此表征與木質纖維素降解過程相關酶的熱穩(wěn)定性。

表2 纖維素酶活測定條件

(4)酶活力計算

按照江高飛等[28]的方法進行數(shù)據(jù)處理，在水溫50℃下，1 mL粗酶液在1 min內水解底物生成1 μg葡萄糖所需的酶量為1個纖維素酶酶活力單位(U/mL)。相對酶活性(%)=(樣品酶活性-對照酶活性)/對照酶活性×100%。

2 結果與分析

2.1 紅樹林土壤芽孢桿菌的多樣性

從廣西山口紅樹林保護區(qū)的土壤中分離出可培養(yǎng)芽孢桿菌171株，通過形態(tài)、大小和顏色等形態(tài)學特征進行初步排重，選取77株細菌進行16S rRNA基因測序，結果獲得40種芽孢桿菌，隸屬于4科12屬；構建其Neighbor-Joining系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)，其中芽孢桿菌屬為優(yōu)勢菌屬，占分離菌株的60%。

圖1 土壤中芽孢桿菌的16S rRNA基因序列Neighbor-Joining系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 培養(yǎng)基的分離效果

采用4種分離培養(yǎng)基，從土壤中共分離出171株芽孢桿菌，分離效果見表3。結果顯示：以菌屬數(shù)為評價標準，培養(yǎng)基的分離效果從優(yōu)到劣排序為M7>P3>M5>M10；以菌種數(shù)為評價標準，培養(yǎng)基的分離效果從優(yōu)到劣排序為M7=P3>M5>M10；以菌株數(shù)為評價標準，培養(yǎng)基的分離效果從優(yōu)到劣排序為M7>P3>M5>M10。綜合多樣性指數(shù)分析，4種培養(yǎng)基分離出的芽孢桿菌多樣性相近，但M7和P3培養(yǎng)基分離出芽孢桿菌的數(shù)量和種類均較為豐富。此外，本研究發(fā)現(xiàn)燕麥、甘油和海藻糖可作為分離紅樹林生境中細菌潛在的理想碳源，脯氨酸、天門冬氨酸和水解酪素為潛在的理想氮源。

表3 不同培養(yǎng)基分離出芽孢桿菌多樣性情況

2.3 產纖維素酶菌株的篩選鑒定

運用點植法將40株芽孢桿菌接種至剛果紅纖維素培養(yǎng)基上，置于4個不同溫度(40，50，60和70℃)條件下培養(yǎng)3 d，結果獲得9株能產生明顯透明水解圈的菌株(圖2)。該9株菌均在40℃和50℃時生長良好，B1235在60℃時生長緩慢，其余8株細菌在60℃時生長良好，在70℃時生長緩慢。水解圈試驗結果表明，不同溫度下分離菌株的纖維素分解能力存在顯著差異，即在剛果紅纖維素培養(yǎng)基上水解圈與菌落直徑比(H/D)不同(表4)：在40，50，60和70℃條件下，9株菌的H/D值分別為4.4-10.5，4-10.5,3-16.5和1.5-7.2。不同活性菌株之間的H/D值存在較大的差異，菌株B26、B299、B1081、B2954和B925的H/D值在40℃和50℃時沒有明顯波動，在60℃時達到最高，70℃時最小，說明該5株菌在60℃時產生的纖維素酶活性最高，纖維素酶量最大；其余4株菌(B2550、B521、B1235、B194)，在50℃以上均表現(xiàn)出H/D值變小，且同一溫度下4株菌的H/D值均較小。雖然水解圈直徑和菌落直徑的比值可以直觀表征酶濃度的高低，但不能作為菌株酶活的唯一定量指標，故需進一步測定這些菌株的產酶能力。

圖2 9株產纖維素酶菌株在不同溫度下的平板酶活性

表4 產纖維素酶菌株初篩結果

將初篩得到的9株菌接種到濾紙條培養(yǎng)基中，50℃恒溫培養(yǎng)7 d后，測定濾紙條的崩解程度。如圖3所示，菌株B1081、B2954、B26和B299將濾紙片崩解成塊狀，濾紙整體膨脹，崩解效果顯著。相比之下，包括B1235在內的另外5株菌僅使濾紙邊緣有一定程度的膨脹，幾乎沒有降解效果。

圖3 5株產纖維素酶菌株培養(yǎng)7 d后對濾紙的降解效果

2.4 高效降解纖維素酶的熱穩(wěn)定性

由于菌株B1081、B2954、B26和B299對濾紙的崩解效果顯著，因此有必要進一步研究這些菌株的酶活力。如圖4所示，4株高溫纖維素降解菌的纖維素內切酶活性和濾紙酶活性熱穩(wěn)定性變化趨勢相似，即都隨著溫度的升高總體呈先升高后降低的趨勢，在80℃時相對活性達到最高，酶活性大小排序均為B1081>B2954>B299>B26。但4株菌的外切酶活性熱穩(wěn)定性表現(xiàn)不一致，B1081，B299和B2954隨溫度升高，其活性降低，即在50℃時最高；而B26隨溫度增加，其活性先增加后降低，在60-70℃時活性較高，但其活性在80-90℃時未檢測出，可能是高溫導致其失活。

圖4 4株活性菌株的3種纖維素酶的熱穩(wěn)定性

3 討論

芽孢桿菌(Bacillus)是紅樹林土壤區(qū)系中常見的細菌類群[30]，且大多數(shù)情況下為優(yōu)勢菌群，其繁殖能力強，可產耐熱、耐旱、抗紫外線的芽孢，具有提升植物抗逆能力與促進植物生長的特性。目前，芽孢桿菌廣泛應用于工農業(yè)、醫(yī)藥衛(wèi)生、環(huán)保等領域，在處理工業(yè)廢水、降解原油及土壤中的難溶化合物，防治植物病蟲害等方面取得很好的成效[31]。陳蓉等[32]在湛江海濱公園的紅樹林淤泥樣品中分離出兩株具有高效產酶活性和部分耐藥性的芽孢桿菌。趙雅慧等[22]從山口紅樹林土壤中分離出具有多種功能酶活性的細菌，其中芽孢桿菌為優(yōu)勢菌屬。Shome等[33]發(fā)現(xiàn)印度南部的Andaman紅樹林沉積物中，Bacillus類群占細菌區(qū)系的50%；Ranjan等[34]也獲得同樣結果，即Bacillus類群為印度Bhitarkanika 熱帶紅樹林環(huán)境土壤細菌中的優(yōu)勢菌屬。在九龍江口、福建漳江口、廈門鳳林灣及八門灣等紅樹林土壤微生物類群中Bacillus屬均為各自的優(yōu)勢菌屬[35-38]。本研究對廣西山口紅樹林土壤可培養(yǎng)芽孢桿菌資源進行系統(tǒng)的報道，采用4種成分差異較大的培養(yǎng)基對廣西山口紅樹林土壤中的芽孢桿菌進行定量分析，其中M7和P3培養(yǎng)基上菌落數(shù)較為豐富，M7和P3培養(yǎng)基中碳源較為豐富，利于更多芽孢菌群的生長。

國內外對高溫纖維素降解菌的研究主要集中于芽孢桿菌屬，早在1917年由荷蘭學者分離到的嗜熱脂肪芽孢桿菌(Geobacillusstearothermophilus)[39]，從糖廠、溫泉及棕櫚油廠分離到的、在60℃高溫下具有穩(wěn)定纖維素降解酶活性的地芽孢桿菌[40-42]，從雞糞鋸末好氧堆肥樣品中分離到的，具有持續(xù)耐高溫且具纖維素酶活性的地芽孢桿菌[43]等。然而，單一菌種的降解能力有限，且酶活穩(wěn)定性難以保持[44，45]。嗜熱脂肪地芽孢桿菌在60-70℃時，能促進好氧堆肥的腐熟進程且改善堆體理化性質，溫度超過70℃時堆體理化性質會發(fā)生異常，影響堆肥進程[46]。相比之下，本研究中獲得的Bacillussubtilissubsp.Inaquosorum B2954和BacillussiamensisB1081，耐熱性更強，在80℃甚至更高溫度下仍然保持較高的纖維素酶活力，可更好地在堆肥或農作物環(huán)境中充分發(fā)揮其各種胞外酶的作用。

4 結論

芽孢桿菌屬是廣西山口紅樹林保護區(qū)內土壤中的優(yōu)勢菌屬，且種類豐富，纖維素酶活性顯著，具有較大的挖掘潛力。其中，芽孢桿菌B1081、B2954、B26和B299具有顯著的纖維素酶活力及熱穩(wěn)定性，而B2954和B1081具有更強的纖維素酶活性和環(huán)境相容性。