李 菲，李 喆，覃仙玲，黃庶識，蘇芯瑩，潘信利**

(1.廣西科學院，廣西近海海洋環(huán)境科學重點實驗室，廣西南寧 530007；2.廣西科學院，廣西海洋天然產(chǎn)物與組合生物合成化學重點實驗室，廣西南寧 530007)

0 引言

中國是農(nóng)業(yè)種植和畜禽養(yǎng)殖的大國，農(nóng)作物秸稈的露天焚燒及畜禽糞便的隨意排放給環(huán)境帶來嚴重的污染[1，2]。目前，高溫堆肥是農(nóng)作物秸稈及畜禽糞便資源化利用的重要方式。堆肥技術以微生物為主導[3]，對堆肥中結(jié)構(gòu)復雜的木質(zhì)纖維素原料進行解聚或分解[4，5]，轉(zhuǎn)化成農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上所需的肥料。堆肥的高溫期溫度可達55℃以上，是原料中病原菌、蟲卵和雜草種子滅活及驅(qū)動秸稈腐熟的主要階段[3]。但是，過高的溫度會抑制土著微生物的活性，降低堆肥中微生物的豐度和多樣性，甚至導致菌株活性喪失，從而限制木質(zhì)纖維素的降解速度[6，7]，而在堆肥過程中添加耐高溫纖維素分解菌則可以有效解決這些問題[8]。研究表明，添加纖維素降解微生物，特別是高溫降解微生物，能夠加快木質(zhì)纖維素降解，促進堆肥腐熟，提高堆肥效率[9-11]。目前，國內(nèi)外學者已從堆肥中分離出多種高溫纖維素降解菌，如鏈霉菌Streptomycessp.CN9[12]，煙曲霉菌AspergillusfumigatusZ5[13]，解淀粉芽孢桿菌BacillusamyloliquefaciensXD-3[14]，梭狀芽孢桿菌Clostridiumsp.，假絲酵母菌Candidasp.[15]等。然而，已有報道中高溫纖維素分解菌耐受溫度大多為50-60℃，而實際生產(chǎn)中好氧堆肥高溫期的溫度可高達70℃，這使得大部分菌株的活性降低甚至失活，從而導致該階段的纖維素分解速度大幅下降，難以適應生產(chǎn)需求。為了更好地滿足實際生產(chǎn)需求，篩選耐高溫的纖維素降解菌并研究其纖維素酶活的熱穩(wěn)定性，對加速高溫好氧堆肥的腐熟進程具有重要意義。

紅樹林作為熱帶和亞熱帶的獨特潮間帶生態(tài)系統(tǒng)，常年受到海水周期性浸淹、波浪、強風、強流、徑流、沉積物及污水(廢水)等特殊因素的影響，促使其組成成分多樣化，能量和物質(zhì)循環(huán)速度加快，生產(chǎn)力和有機質(zhì)的降解活性增強，大量的植物殘體和落葉的堆積，不斷為微生物提供纖維素等物質(zhì)[16]。胡芮等[17]在紅樹林土壤中獲得一株產(chǎn)嗜熱纖維素酶的枯草芽孢桿菌，該菌株在55-60℃時可維持較高酶活；曾思泉等[18]從三亞紅沙河紅樹林區(qū)分離出一株降解纖維素的枝孢屬真菌SCSIO 43503，在45-50℃時纖維素酶活性較高?？梢?，從紅樹林生境獲得產(chǎn)纖維素酶菌株具有廣泛的研究前景。廣西山口紅樹林是廣西紅樹林濕地特征的紅樹林自然保護區(qū)之一[19]，屬北熱帶季風區(qū)，生長著白骨壤、桐花樹、秋茄等紅樹植物，有111種大型底棲動物[20]，其海水污染程度低，動植物資源豐富，具有較強的研究價值。

本研究以廣西山口紅樹林保護區(qū)內(nèi)的土壤作為研究對象，通過16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹分析，獲得紅樹林土壤中可培養(yǎng)芽孢桿菌的多樣性信息。同時，結(jié)合剛果紅纖維素培養(yǎng)法、濾紙條崩解試驗、纖維素酶活測定法，篩選出具有耐高溫、穩(wěn)定性強的纖維素酶活性菌株，為從海洋環(huán)境中尋找新的微生物資源提供理論依據(jù)和實踐指導。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 紅樹林土壤樣本

2019年5月從廣西山口紅樹林自然保護區(qū)(109°38′14″ E，21°28′53″ N)中采集潮間帶低潮3處土壤樣本(每處相距5 m，由近岸紅樹林往外采集)，每處土壤取至地下0.5 m深，將樣品混合后裝于密封袋，4℃低溫保藏備用。

1.1.2 主要試劑和儀器

培養(yǎng)基原料、TAE緩沖液、2×EasyTaq SuperMix、擴增引物、DNA Marker、GoldView核酸染料等購于北京康為世紀生物科技有限公司，Chelex 100樹脂購于美國BioRad公司。使用的儀器包括SW-CJ-2F型超凈工作臺、HH.B11-BS-II型恒溫培養(yǎng)箱、TS-100C型恒溫振蕩器、VB-55型高壓滅菌鍋、Tgradient型PCR擴增儀、伯樂電泳儀、凝膠成像儀、泰斯特SYG數(shù)顯實驗水浴鍋、Thermo酶標儀等。

1.1.3 培養(yǎng)基

(1)細菌分離培養(yǎng)基：M7、M10、M5和P3，其配方詳見表1。

表1 細菌分離培養(yǎng)基配方

(2)純化培養(yǎng)基：鏈霉菌培養(yǎng)基2號(ISP2)的改良固體培養(yǎng)基[21]。

(3)纖維素酶初/復篩培養(yǎng)基：剛果紅纖維素培養(yǎng)基，參照文獻[22]配制，羧甲基纖維素鈉10.0 g，復合鹽母液10 mL，2 g/L剛果紅染液1 mL，瓊脂14.0 g。

(4)羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)發(fā)酵培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉5.0 g，復合鹽母液10 mL，蒸餾水1 000 mL。

(5)濾紙條培養(yǎng)基配方：胰蛋白胨1.0 g，2張1 cm×6 cm濾紙條，去離子水1 000 mL。

1.1.4 其他試劑配制

(1)DNS溶液：酒石酸鉀鈉182 g，3,5-二硝基水楊酸6.3 g，NaOH 21 g，苯酚5 g，蒸餾水1 000 mL；儲存至棕色瓶中，室溫條件下放置7 d后使用，有效期6個月。

(2)檸檬酸-Na2HPO3緩沖液A：7.16 g Na2HPO3溶于水，加入2.1 g檸檬酸，定容至200 mL，pH值約為5.0。

1.2 方法

1.2.1 菌株分離純化

稱取2.0 g樣品裝于20 mL無菌水中搖勻，即為原液；將原液按10-2和10-3比例進行稀釋，備用。取200 μL樣液分別涂布至4種分離培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)3-7 d，并隨時觀察菌株的生長情況，挑取肉眼可見菌落進行純化培養(yǎng)，記錄其形態(tài)特征和菌落數(shù)，以30%(V∶V)甘油-ISP2混合液作為保護劑，將純化好的菌株保存于凍存管并置于-70℃冰箱內(nèi)。

1.2.2 16S rRNA基因測序和系統(tǒng)發(fā)育分析

采用chelex-100樹脂[23]快速提取細菌的DNA并作為PCR模板，根據(jù)Walsh等[24]的方法對其進行PCR擴增。擴增和測序引物均為細菌通用引物27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3′)和1522R (5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′)，PCR反應條件參照李菲等[25]的方法設定。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，委托北京擎科新業(yè)生物技術有限公司進行測序分析。序列經(jīng)BioEdit Sequence Alignment Editor軟件整理后，利用EzBioCloud數(shù)據(jù)庫(https://www.ezbiocloud.net/)進行在線比對[26]；選取同源性最高菌株的序列作為參比對象，采用MEGA 10.0軟件中的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，通過重復取樣1 000次所獲得的自舉值檢測各分支的置信值，對各菌株的系統(tǒng)發(fā)育地位進行分析[27]。采用Excel軟件計算多樣性指數(shù)，計算公式如下：

Simpson指數(shù)：

λ=1-∑(Ni/N)2；

Shannon-Wiener指數(shù)：

H′=-∑Ni/N(lnNi/N)；

Pielou指數(shù)：

P=∑[(Ni/N)(N-Ni)/(N-1)]，

其中，N為分離到的細菌菌株數(shù)總和，Ni為第i個菌種的菌株數(shù)。

1.2.3 產(chǎn)纖維素酶菌的篩選

運用點植法將待測芽孢桿菌接種于纖維素酶活初篩培養(yǎng)基上，40℃恒溫培養(yǎng)3 d。用平板透明圈法初步判定菌株的纖維素酶活性，對選出具有纖維素酶活性的菌株進行50，60和70℃耐高溫復篩，觀察培養(yǎng)基上菌苔產(chǎn)生透明圈的情況；并用游標卡尺測量菌落直徑(D)和透明圈直徑(H)，計算H/D值，直徑比大表示菌株水解CMC的能力強[28]。選取酶活性顯著的菌株進行下一步研究(濾紙條崩解試驗)。用0.9%滅菌的生理鹽水將新鮮的活性菌株制成菌懸液，調(diào)節(jié)OD600值至0.6。在98 mL濾紙條培養(yǎng)基中接入2 mL菌液，在37℃、180 r/min下培養(yǎng)7 d，以不接種菌種的濾紙條培養(yǎng)基作為空白組，每組3個重復。根據(jù)濾紙條的斷裂崩解程度來初步判斷菌株的降解性能[29]。

1.2.4 纖維素酶活力測定

(1)粗酶液制備

挑取新鮮活性菌株，加入0.9%滅菌的生理鹽水制成菌懸液，用麥氏比濁管將菌懸液濃度調(diào)至約1×108CFU/mL，取2%菌懸液接種至10 mL CMC-Na發(fā)酵培養(yǎng)基中，50℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)3 d，6 000 r/min離心10 min，上清液即為粗酶液。

(2)葡萄糖標準曲線繪制

分別取0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7 mg/mL的葡萄糖溶液2 mL，加入1 mL DNS溶液，沸水浴10 min，冷卻后補加21.5 mL蒸餾水。在540 nm波長下測定其吸光值，并繪制葡萄糖標準曲線。

(3)菌株纖維素酶活力測定

通過測定濾紙酶活(FPA)、內(nèi)切酶酶活(CMCase)和外切酶酶活(C1)，綜合表征菌株粗酶液纖維素酶活力。測定參數(shù)和反應條件如表2所示。待反應結(jié)束，分別加入1.5 mL DNS試劑，沸水浴10 min后置于冷水中冷卻；用酶標儀測定其吸光值，設定波長為540 nm。參照葡萄糖標準曲線方程[y=0.5148x-0.0171 (R2=0.997 8)]，分別計算這4株菌株的濾紙酶(FPase)、纖維素內(nèi)切酶(CMCase)和外切酶(C1)酶活，分析其在50-90℃時相對酶活的變化規(guī)律，以此表征與木質(zhì)纖維素降解過程相關酶的熱穩(wěn)定性。

表2 纖維素酶活測定條件

(4)酶活力計算

按照江高飛等[28]的方法進行數(shù)據(jù)處理，在水溫50℃下，1 mL粗酶液在1 min內(nèi)水解底物生成1 μg葡萄糖所需的酶量為1個纖維素酶酶活力單位(U/mL)。相對酶活性(%)=(樣品酶活性-對照酶活性)/對照酶活性×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅樹林土壤芽孢桿菌的多樣性

從廣西山口紅樹林保護區(qū)的土壤中分離出可培養(yǎng)芽孢桿菌171株，通過形態(tài)、大小和顏色等形態(tài)學特征進行初步排重，選取77株細菌進行16S rRNA基因測序，結(jié)果獲得40種芽孢桿菌，隸屬于4科12屬；構(gòu)建其Neighbor-Joining系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)，其中芽孢桿菌屬為優(yōu)勢菌屬，占分離菌株的60%。

圖1 土壤中芽孢桿菌的16S rRNA基因序列Neighbor-Joining系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 培養(yǎng)基的分離效果

采用4種分離培養(yǎng)基，從土壤中共分離出171株芽孢桿菌，分離效果見表3。結(jié)果顯示：以菌屬數(shù)為評價標準，培養(yǎng)基的分離效果從優(yōu)到劣排序為M7>P3>M5>M10；以菌種數(shù)為評價標準，培養(yǎng)基的分離效果從優(yōu)到劣排序為M7=P3>M5>M10；以菌株數(shù)為評價標準，培養(yǎng)基的分離效果從優(yōu)到劣排序為M7>P3>M5>M10。綜合多樣性指數(shù)分析，4種培養(yǎng)基分離出的芽孢桿菌多樣性相近，但M7和P3培養(yǎng)基分離出芽孢桿菌的數(shù)量和種類均較為豐富。此外，本研究發(fā)現(xiàn)燕麥、甘油和海藻糖可作為分離紅樹林生境中細菌潛在的理想碳源，脯氨酸、天門冬氨酸和水解酪素為潛在的理想氮源。

表3 不同培養(yǎng)基分離出芽孢桿菌多樣性情況

2.3 產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選鑒定

運用點植法將40株芽孢桿菌接種至剛果紅纖維素培養(yǎng)基上，置于4個不同溫度(40，50，60和70℃)條件下培養(yǎng)3 d，結(jié)果獲得9株能產(chǎn)生明顯透明水解圈的菌株(圖2)。該9株菌均在40℃和50℃時生長良好，B1235在60℃時生長緩慢，其余8株細菌在60℃時生長良好，在70℃時生長緩慢。水解圈試驗結(jié)果表明，不同溫度下分離菌株的纖維素分解能力存在顯著差異，即在剛果紅纖維素培養(yǎng)基上水解圈與菌落直徑比(H/D)不同(表4)：在40，50，60和70℃條件下，9株菌的H/D值分別為4.4-10.5，4-10.5,3-16.5和1.5-7.2。不同活性菌株之間的H/D值存在較大的差異，菌株B26、B299、B1081、B2954和B925的H/D值在40℃和50℃時沒有明顯波動，在60℃時達到最高，70℃時最小，說明該5株菌在60℃時產(chǎn)生的纖維素酶活性最高，纖維素酶量最大；其余4株菌(B2550、B521、B1235、B194)，在50℃以上均表現(xiàn)出H/D值變小，且同一溫度下4株菌的H/D值均較小。雖然水解圈直徑和菌落直徑的比值可以直觀表征酶濃度的高低，但不能作為菌株酶活的唯一定量指標，故需進一步測定這些菌株的產(chǎn)酶能力。

圖2 9株產(chǎn)纖維素酶菌株在不同溫度下的平板酶活性

表4 產(chǎn)纖維素酶菌株初篩結(jié)果

將初篩得到的9株菌接種到濾紙條培養(yǎng)基中，50℃恒溫培養(yǎng)7 d后，測定濾紙條的崩解程度。如圖3所示，菌株B1081、B2954、B26和B299將濾紙片崩解成塊狀，濾紙整體膨脹，崩解效果顯著。相比之下，包括B1235在內(nèi)的另外5株菌僅使濾紙邊緣有一定程度的膨脹，幾乎沒有降解效果。

圖3 5株產(chǎn)纖維素酶菌株培養(yǎng)7 d后對濾紙的降解效果

2.4 高效降解纖維素酶的熱穩(wěn)定性

由于菌株B1081、B2954、B26和B299對濾紙的崩解效果顯著，因此有必要進一步研究這些菌株的酶活力。如圖4所示，4株高溫纖維素降解菌的纖維素內(nèi)切酶活性和濾紙酶活性熱穩(wěn)定性變化趨勢相似，即都隨著溫度的升高總體呈先升高后降低的趨勢，在80℃時相對活性達到最高，酶活性大小排序均為B1081>B2954>B299>B26。但4株菌的外切酶活性熱穩(wěn)定性表現(xiàn)不一致，B1081，B299和B2954隨溫度升高，其活性降低，即在50℃時最高；而B26隨溫度增加，其活性先增加后降低，在60-70℃時活性較高，但其活性在80-90℃時未檢測出，可能是高溫導致其失活。

圖4 4株活性菌株的3種纖維素酶的熱穩(wěn)定性

3 討論

芽孢桿菌(Bacillus)是紅樹林土壤區(qū)系中常見的細菌類群[30]，且大多數(shù)情況下為優(yōu)勢菌群，其繁殖能力強，可產(chǎn)耐熱、耐旱、抗紫外線的芽孢，具有提升植物抗逆能力與促進植物生長的特性。目前，芽孢桿菌廣泛應用于工農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥衛(wèi)生、環(huán)保等領域，在處理工業(yè)廢水、降解原油及土壤中的難溶化合物，防治植物病蟲害等方面取得很好的成效[31]。陳蓉等[32]在湛江海濱公園的紅樹林淤泥樣品中分離出兩株具有高效產(chǎn)酶活性和部分耐藥性的芽孢桿菌。趙雅慧等[22]從山口紅樹林土壤中分離出具有多種功能酶活性的細菌，其中芽孢桿菌為優(yōu)勢菌屬。Shome等[33]發(fā)現(xiàn)印度南部的Andaman紅樹林沉積物中，Bacillus類群占細菌區(qū)系的50%；Ranjan等[34]也獲得同樣結(jié)果，即Bacillus類群為印度Bhitarkanika 熱帶紅樹林環(huán)境土壤細菌中的優(yōu)勢菌屬。在九龍江口、福建漳江口、廈門鳳林灣及八門灣等紅樹林土壤微生物類群中Bacillus屬均為各自的優(yōu)勢菌屬[35-38]。本研究對廣西山口紅樹林土壤可培養(yǎng)芽孢桿菌資源進行系統(tǒng)的報道，采用4種成分差異較大的培養(yǎng)基對廣西山口紅樹林土壤中的芽孢桿菌進行定量分析，其中M7和P3培養(yǎng)基上菌落數(shù)較為豐富，M7和P3培養(yǎng)基中碳源較為豐富，利于更多芽孢菌群的生長。

國內(nèi)外對高溫纖維素降解菌的研究主要集中于芽孢桿菌屬，早在1917年由荷蘭學者分離到的嗜熱脂肪芽孢桿菌(Geobacillusstearothermophilus)[39]，從糖廠、溫泉及棕櫚油廠分離到的、在60℃高溫下具有穩(wěn)定纖維素降解酶活性的地芽孢桿菌[40-42]，從雞糞鋸末好氧堆肥樣品中分離到的，具有持續(xù)耐高溫且具纖維素酶活性的地芽孢桿菌[43]等。然而，單一菌種的降解能力有限，且酶活穩(wěn)定性難以保持[44，45]。嗜熱脂肪地芽孢桿菌在60-70℃時，能促進好氧堆肥的腐熟進程且改善堆體理化性質(zhì)，溫度超過70℃時堆體理化性質(zhì)會發(fā)生異常，影響堆肥進程[46]。相比之下，本研究中獲得的Bacillussubtilissubsp.Inaquosorum B2954和BacillussiamensisB1081，耐熱性更強，在80℃甚至更高溫度下仍然保持較高的纖維素酶活力，可更好地在堆肥或農(nóng)作物環(huán)境中充分發(fā)揮其各種胞外酶的作用。

4 結(jié)論

芽孢桿菌屬是廣西山口紅樹林保護區(qū)內(nèi)土壤中的優(yōu)勢菌屬，且種類豐富，纖維素酶活性顯著，具有較大的挖掘潛力。其中，芽孢桿菌B1081、B2954、B26和B299具有顯著的纖維素酶活力及熱穩(wěn)定性，而B2954和B1081具有更強的纖維素酶活性和環(huán)境相容性。