包繼文，李子揚(yáng)，堯歡珍，吳 蓓，周文彥，顧樂(lè)怡，王 玲

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院腎臟內(nèi)科，上海 200127

慢性腎臟?。╟hronic kidney disease，CKD）是全球衛(wèi)生保健中的一個(gè)重要問(wèn)題。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球有超過(guò)10%的人口受到該病影響，其發(fā)病率逐年上升，容易進(jìn)展到終末期腎臟?。╡nd stage kidney disease，ESRD），導(dǎo)致遠(yuǎn)期療效較差，并且醫(yī)療費(fèi)用高昂［1］。蛋白尿是CKD早期常見標(biāo)志［2］。足細(xì)胞損傷不僅與蛋白尿的嚴(yán)重程度有關(guān)，而且還與腎小球硬化發(fā)生、發(fā)展以及腎功能下降有關(guān)［3-4］，是多種腎小球疾病的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因子，包括微小病變、局灶節(jié)段性腎小球硬化和糖尿病腎病等［5-7］。

足細(xì)胞是終末分化的腎小球臟層上皮細(xì)胞，在腎小球?yàn)V過(guò)屏障功能的維持中發(fā)揮重要作用。足細(xì)胞結(jié)構(gòu)以黏著斑和裂隙膜為核心，調(diào)控其自身的形態(tài)和功能。足細(xì)胞的肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架相互聯(lián)系緊密，使其能適應(yīng)外界環(huán)境變化，以維持腎小球?yàn)V過(guò)屏障的完整性［8］。Nephrin、synaptpodin、podocin和Wilms’tumor 1（WT1）等蛋白既是足細(xì)胞的特異性標(biāo)志物，同時(shí)也在足細(xì)胞肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)控中發(fā)揮各種關(guān)鍵的調(diào)控作用［9-11］。然而，足細(xì)胞損傷機(jī)制十分復(fù)雜。探索足細(xì)胞損傷過(guò)程中可能存在的新的分子及其作用機(jī)制，對(duì)于臨床上診斷和治療蛋白尿、各種腎小球疾病以及預(yù)防CKD的進(jìn)展等均有重要意義。

隨著科學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，生物信息學(xué)已經(jīng)作為一種強(qiáng)大的工具，為疾病分子機(jī)制的研究提供了更為全面的視角，并且可以發(fā)現(xiàn)疾病潛在的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)［12-13］。在腎臟病領(lǐng)域中，有學(xué)者通過(guò)對(duì)信號(hào)通路進(jìn)行全面生物信息學(xué)分析和驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)3個(gè)全新的因子，包括AHR、GRHL2和KIAA0101，可以作為透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌潛在的生物標(biāo)志物［13］。有研究通過(guò)對(duì)胰島素敏感-足細(xì)胞組和胰島素抵抗-足細(xì)胞組的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)可能參與蛋白尿相關(guān)腎臟病調(diào)控的全新基因NPY，抑制其參與的信號(hào)通路可能是未來(lái)的研究方向［14］。因此，生物信息學(xué)分析對(duì)腎臟病研究具有重要價(jià)值。

本研究通過(guò)對(duì)足細(xì)胞損傷相關(guān)芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，識(shí)別足細(xì)胞損傷中的差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs），并且對(duì)其中一個(gè)基因進(jìn)行蛋白水平的驗(yàn)證。

1 對(duì)象與方法

1.1 足細(xì)胞損傷相關(guān)m RNA芯片數(shù)據(jù)處理及分析

從NCBI_GBO數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gds）中下載一個(gè)足細(xì)胞損傷相關(guān)RNA芯片數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)集為GSE108629，其中包括了4例正常足細(xì)胞樣本（正常足細(xì)胞組）和4例損傷足細(xì)胞樣本（損傷足細(xì)胞組），通過(guò)主成分分析和箱線圖對(duì)數(shù)據(jù)集的質(zhì)量以及樣本的分組情況進(jìn)行控制，將芯片數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化成表達(dá)量度。采用limma軟件包和affy軟件包對(duì)質(zhì)控后的RNA表達(dá)譜進(jìn)行組間DEGs分析。對(duì)基因表達(dá)倍數(shù)變化（fold change，F(xiàn)C）進(jìn)行l(wèi)og2轉(zhuǎn)換，以符合|log FC|≥2并且校正P值（q值）＜0.05 作為篩選DEGs的基本條件。

1.2 主要試劑與儀器

阿 霉 素（adriamycin，ADR）（Sigma-Aldrich，美國(guó)），低溫高速離心機(jī)（Eppendorf，德國(guó)），倒置熒光顯微鏡（ZEISS，Axio Vert A1，德國(guó)），Western blotting圖像分析系統(tǒng)（上海天能科技有限公司，中國(guó)）。

1.3 臨床樣本研究

1.3.1 研究樣本收集 收集2015年3月至2020年3月在上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院進(jìn)行腎活檢的大量蛋白尿患者（大量蛋白尿組）。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡≥18歲；24 h尿蛋白總量＞3.5 g；腎活檢病理結(jié)果為局灶節(jié)段性腎小球硬化或者微小病變。排除繼發(fā)于其他因素的腎小球腎炎患者。

對(duì)照組為同期在該院因“血尿”或者“泡沫尿”而堅(jiān)持行腎活檢，尿常規(guī)檢測(cè)結(jié)果為尿蛋白陰性或者24 h尿蛋白總量＜1 g，且腎活檢病理結(jié)果為病變輕微或者良性腎小動(dòng)脈硬化癥的患者。

收集患者基本信息，包括姓名、年齡、性別、身高、體質(zhì)量、血壓、既往疾病史和用藥史等信息；患者實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)項(xiàng)目包括尿常規(guī)、腎功能、24 h尿蛋白。研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（仁濟(jì)倫審［2017］084號(hào)），研究對(duì)象均簽署知情同意書。

1.3.2 免疫熒光染色 石蠟切片脫蠟處理后，高溫加熱進(jìn)行抗原修復(fù)，封閉1 h后，一抗4℃孵育過(guò)夜；次日熒光二抗常溫避光孵育1 h，DAPI染細(xì)胞核。使用的抗體分別 為METTL10抗 體（1∶100，Biorbyt，美 國(guó)）、podocalyxin抗體（1∶1 000，Proteintech，中國(guó)）。

1.4 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.4.1 阿霉素誘導(dǎo)小鼠腎病模型BAL/BC小鼠（雄性，6～8周齡，體質(zhì)量20～22 g），購(gòu)自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司［生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（京）2019-0020，使用許可證號(hào)為SYXK（滬）2016-0009］。所有實(shí)驗(yàn)小鼠均在SPF級(jí)別動(dòng)物房?jī)?nèi)飼養(yǎng)，隨機(jī)將小鼠分為2組：對(duì)照組（n=6）和阿霉素（adriamycin，ADR）處理組（n=6）；ADR處理組按照10mg/kg尾靜脈注射ADR誘導(dǎo)腎病模型，對(duì)照組尾靜脈注射等體積PBS。分別在注射前（Day0）和注射14 d（Day14）時(shí)用代謝籠收集小鼠24 h尿液，于第15日處死小鼠，收集小鼠腎臟組織標(biāo)本。

1.4.2 尿液白蛋白與肌酐檢測(cè) 采用白蛋白和肌酐檢測(cè)試劑盒（南京建成，中國(guó)），檢測(cè)小鼠24 h尿液白蛋白與肌酐含量，計(jì)算尿白蛋白肌酐比值（urinary album in creatinine ratio，UACR）。

1.4.3 組織蛋白免疫印跡檢測(cè) 提取小鼠腎皮質(zhì)組織總蛋白，加蛋白樣品至10%SDS-PAGE凝膠中分離，250mA恒流轉(zhuǎn)膜70min，PVDF膜常溫封閉1 h，一抗4℃孵育過(guò)夜，二抗常溫孵育1 h，滴加ECL化學(xué)發(fā)光液進(jìn)行條帶顯影。使用的抗體如下：METTL10抗體（Thermo Fisher Scientific，美國(guó)；1∶500），nephrin抗體（Abcam，美國(guó)；1∶200），synatopodin抗體（Proteintech，中國(guó)；1∶500），WT1抗體（Proteintech，中國(guó)；1∶500），podocin抗體（Proteintech，中國(guó)；1∶500），tubulin抗體（Beyotime，中國(guó)；1∶1 000），GAPDH抗體（Beyotime，中國(guó)；1∶1 000）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 23.0 與GraphPad Prism7.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。其中，正態(tài)分布的定量資料采用xˉ±s表示，非正態(tài)分布的定量資料采用中位數(shù)（四分位數(shù)間距）表示；2組間樣本均數(shù)的比較采用兩樣本獨(dú)立t檢驗(yàn)，雙側(cè)P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 足細(xì)胞損傷模型中總DEGs分析

與正常足細(xì)胞組樣本相比，在損傷足細(xì)胞組樣本中共有5 353個(gè)DEGs（圖1），其中有3 402個(gè)基因顯著上調(diào)，1951個(gè)基因顯著下調(diào)。圖2展示了前50個(gè)DEGs。其中，與正常足細(xì)胞組比較，METTL10在足細(xì)胞損傷組中顯著下調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.013），見圖3。

圖1 足細(xì)胞損傷中的DEGs火山圖Fig 1 Identification of DEGs in injured podocytes shown by the volcanoplot

圖2 足細(xì)胞損傷中前50個(gè)差異表達(dá)基因聚類熱圖Fig 2 Heatmap for the top50 of DEGs in injured podocytes

圖3 METTL10m RNA在足細(xì)胞損傷中的表達(dá)變化Fig 3 Changes of METTL10 mRNA level in damaged podocytes

2.2 大量蛋白尿患者腎小球組織中METTL10的表達(dá)

共納入3例大量蛋白尿患者及3例對(duì)照者。對(duì)照組患者的年齡、性別、血壓、血清肌酐（serum creatinine，Scr）、估算腎小球?yàn)V過(guò)率（estimated glomerular filtration rate，eGFR）均與大量蛋白尿組匹配（均P＞0.05）；與對(duì)照組比較，大量蛋白尿組患者24 h尿蛋白含量顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.012），見表1。免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示：METTL10在人體正常腎小球組織中表達(dá)，METTL10與足細(xì)胞標(biāo)志物podocalyxin存在共定位；與對(duì)照組比較，METTL10在大量蛋白尿患者腎小球組織中的表達(dá)明顯下降（圖4）。

表1 大量蛋白尿組和對(duì)照組的人口學(xué)及基線資料Tab 1 Demographic and baseline characteristics of control group and patients with massive proteinuria

圖4 免疫熒光染色檢測(cè)患者腎小球組織中METTL10的表達(dá)(×400)Fig 4 Immunofluorescence staining for detection of METTL10 expression in glomerula(×400)

2.3 METTL10在ADR誘導(dǎo)腎病小鼠模型中的表達(dá)

經(jīng)ADR或PBS尾靜脈注射后，2組小鼠UACR的變化見圖5。對(duì)照組小鼠Day0和Day14的UACR比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；ADR處理組小鼠Day14的UACR較對(duì)照組顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.005）。

圖5 2組小鼠UACR的變化Fig 5 Change of UACR in the two groups

ADR處理組小鼠腎臟組織synaptopodin、nephrin、podocin、WT1蛋白水平與對(duì)照組比較均顯著下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見圖6。免疫印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示，METTL10蛋白在ADR處理組小鼠腎臟組織中的表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組（P=0.001），見圖7。

圖6 小鼠腎臟組織足細(xì)胞標(biāo)志物蛋白的表達(dá)(n=6)Fig 6 Expression of podocyte markers in kidney tissue of mice(n=6)

圖7 小鼠腎臟組織中METTL10蛋白表達(dá)（n=6）Fig 7 Expression of METTL10 protein in kidney tissue of mice(n=6)

3 討論

METTL10，也被命名為EEF1AKMT2，是真核細(xì)胞翻譯延長(zhǎng)因子A1（eukaryotic translation elongation factor，eEF1A1）在賴氨酸318位點(diǎn)的三甲基轉(zhuǎn)移酶［15-17］。在一項(xiàng)關(guān)于CKD人群的全基因組關(guān)聯(lián)分析（genome-wide association study，GWAS）中，通過(guò)細(xì)胞譜系的RNA序列分析，發(fā)現(xiàn)在正常小鼠腎臟的各個(gè)細(xì)胞類型中，METTL10在足細(xì)胞中的表達(dá)顯著高于集合管、遠(yuǎn)端小管、近端小管等其他腎臟細(xì)胞類型［18］。綜上，我們推測(cè)METTL10可能參與足細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的調(diào)控，在本研究中將METTL10篩選為目的基因。

本研究中，通過(guò)對(duì)GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中的一個(gè)足細(xì)胞損傷模型芯片數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)了眾多差異表達(dá)基因，這些基因可能通過(guò)不同的生物學(xué)功能和信號(hào)通路在足細(xì)胞損傷中發(fā)揮各自的作用。我們從中篩選出了METTL10基因，同時(shí)也對(duì)篩選出的總差異表達(dá)基因進(jìn)行了KEGG通路富集分析（結(jié)果未列出）。以所富集到的前15條信號(hào)通路結(jié)果為例，其中有7條信號(hào)通路（MAPK信號(hào)通路、PI3K-AKT信號(hào)通路、細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白調(diào)控、細(xì)胞黏附、腫瘤壞死因子信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路以及細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用），在目前足細(xì)胞病的相關(guān)機(jī)制中均發(fā)揮重要作用。MAPK通路參與調(diào)控足細(xì)胞凋亡，通過(guò)阻斷MAPK通路可以減輕足細(xì)胞損傷［19］；活化的PI3K-AKT信號(hào)通路參與調(diào)控足細(xì)胞自噬，自噬受損誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷，參與糖尿病腎病及其他腎臟疾病的發(fā)生［11］；足細(xì)胞參與腎小球?yàn)V過(guò)的功能依賴于其細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白的調(diào)控，細(xì)胞黏附則是維持足細(xì)胞骨架動(dòng)力學(xué)的重要通路之一，該過(guò)程失調(diào)會(huì)導(dǎo)致蛋白尿發(fā)生［11］；其余通路與心肌病、癌癥或病毒感染有關(guān)。然而，通過(guò)本次生物信息學(xué)分析，尚未發(fā)現(xiàn)METTL10富集的相關(guān)信號(hào)通路。可能是由于本研究?jī)H收集并分析了一個(gè)數(shù)據(jù)集，結(jié)果具有一定局限性。目前，關(guān)于腎病的生物信息學(xué)分析更常見的是收集多個(gè)數(shù)據(jù)集，整合性分析差異基因表達(dá)。例如，一項(xiàng)關(guān)于CKD診斷標(biāo)志物的研究［21］，通過(guò)收集多個(gè)CKD相關(guān)數(shù)據(jù)集，并按照腎小球組織和腎小管間質(zhì)來(lái)源分類，同時(shí)與患者各項(xiàng)臨床特征相聯(lián)系，分別分析相應(yīng)的差異基因表達(dá)以及功能模塊等，分析內(nèi)容更為全面和豐富。關(guān)于METTL10可能參與的信號(hào)通路，將進(jìn)一步在細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)中加以探索和驗(yàn)證。

本研究進(jìn)一步對(duì)臨床患者的腎活檢標(biāo)本進(jìn)行免疫熒光染色，結(jié)果提示METTL10在人正常腎小球組織表達(dá)，且與足細(xì)胞標(biāo)志物podocalyxin共染陽(yáng)性，提示了METTL10在足細(xì)胞中存在特異性表達(dá)。這一現(xiàn)象也與相關(guān)研究［18］所述METTL10在健康小鼠腎臟足細(xì)胞中高表達(dá)的結(jié)果相符合。因而，我們推測(cè)METTL10可能與足細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能有關(guān)。免疫熒光染色結(jié)果還初步提示了在大量蛋白尿患者腎小球中METTL10表達(dá)下調(diào)。本研究中蛋白尿患者腎組織病理類型為局灶節(jié)段性腎小球硬化或微小病變。局灶節(jié)段性腎小球硬化作為臨床上難治性腎病綜合征常見的病理分型，多表現(xiàn)為激素治療耐藥或藥物依賴，嚴(yán)重者會(huì)進(jìn)展到不可逆的終末期腎臟?。?2］。有研究表明，局灶節(jié)段性腎小球硬化的嚴(yán)重程度和療效均與足細(xì)胞受損密不可分，保護(hù)足細(xì)胞是治療局灶節(jié)段性腎小球硬化的關(guān)鍵；足細(xì)胞損傷是蛋白尿產(chǎn)生的重要環(huán)節(jié)［7］。因此，我們推測(cè)METTL10可能與蛋白尿發(fā)生和發(fā)展有關(guān)，并且提示在足細(xì)胞損傷時(shí)METTLE表達(dá)下調(diào)。

成年人腎臟中的每個(gè)腎小球結(jié)構(gòu)中有500～600個(gè)足細(xì)胞［23］。足細(xì)胞作為高度分化的上皮細(xì)胞，增殖能力有限，成熟的足細(xì)胞無(wú)法進(jìn)行完整的有絲分裂。損傷刺激所致的足細(xì)胞破壞，包括細(xì)胞凋亡、細(xì)胞自噬受損、細(xì)胞有絲分裂障礙（足細(xì)胞重新進(jìn)入細(xì)胞周期，但有絲分裂不完全，致細(xì)胞死亡）等都可以導(dǎo)致足細(xì)胞數(shù)量減少，進(jìn)而促使腎小球硬化的發(fā)生和發(fā)展［24］。在結(jié)構(gòu)方面，各種損傷刺激最終導(dǎo)致足細(xì)胞損傷的共同特點(diǎn)是足細(xì)胞骨架蛋白系統(tǒng)失調(diào)，足突回縮［25］。

本研究進(jìn)一步在ADR誘導(dǎo)小鼠腎病模型中檢測(cè)到METTL10的表達(dá)下調(diào)，這與芯片數(shù)據(jù)分析和蛋白尿患者標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果相一致。同時(shí)，伴隨著幾個(gè)重要的足細(xì)胞標(biāo)志物蛋白的表達(dá)下降，其中synaptopodin是使緊密相接的足細(xì)胞骨架蛋白得以保持穩(wěn)定的重要調(diào)控分子［9］；nephrin和podocin是足細(xì)胞裂隙膜結(jié)構(gòu)的重要成分，裂隙膜不僅在結(jié)構(gòu)上作為濾過(guò)屏障阻止蛋白尿發(fā)生，還是足細(xì)胞應(yīng)對(duì)各種應(yīng)激的重要信號(hào)中心［10］；WT1作為一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子，除了可以通過(guò)調(diào)控下游分子包括nephrin、podocin、Neph3等裂隙膜相關(guān)蛋白分子表達(dá)，同時(shí)也在足細(xì)胞的分化過(guò)程中扮演重要角色［11］?？紤]到ADR可以同時(shí)誘導(dǎo)小鼠腎小球中METTL10蛋白與這幾種重要的足細(xì)胞蛋白表達(dá)下降，雖然尚未確定兩者之間的因果關(guān)系，仍可以得出初步結(jié)論，即METTL10表達(dá)下調(diào)有可能與足細(xì)胞損傷有關(guān)。

盡管METTL10調(diào)控eEF1A1的甲基化修飾作用尚不明確，但現(xiàn)有許多研究表明METTL10的底物eEF1A 1通過(guò)與肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架相互作用，調(diào)控蛋白翻譯過(guò)程，同時(shí)也調(diào)控肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架動(dòng)力學(xué)［26-28］。在今后研究中可以關(guān)注足細(xì)胞的METTL10是否參與其細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)調(diào)控。有研究發(fā)現(xiàn)METTL10參與真核細(xì)胞的細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的磷酸化修飾［17］；也有研究提出ADR可以誘導(dǎo)足細(xì)胞重新進(jìn)入細(xì)胞周期，進(jìn)而異常的有絲分裂導(dǎo)致非典型的細(xì)胞死亡［29］。我們將在后續(xù)研究中通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，調(diào)控足細(xì)胞中的METTL10基因表達(dá)，構(gòu)建足細(xì)胞損傷體外模型，進(jìn)一步研究METTL10與足細(xì)胞的細(xì)胞周期調(diào)控之間的可能聯(lián)系，從而進(jìn)一步揭示METTL10在足細(xì)胞損傷中可能的調(diào)控作用及其機(jī)制。

綜上，本研究初步發(fā)現(xiàn)了METTL10表達(dá)下調(diào)可能與蛋白尿發(fā)生及足細(xì)胞損傷有關(guān)，該結(jié)論為今后探索足細(xì)胞損傷的分子機(jī)制提供新的線索。

參·考·文·獻(xiàn)

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