王 芬，木 仁，張 雯，馬 媛，郭治友，崔寶祿，李 靜

（黔南民族師范學(xué)院生物科學(xué)與農(nóng)學(xué)院，貴州 都勻 558000）

0 引言

【研究意義】茶樹(shù)Camellia sinensis（L.）O.Kuntze屬山茶科、山茶屬，異花授粉植物，起源于中國(guó)西南一帶，為葉用經(jīng)濟(jì)作物，作為受大眾歡迎的世界性飲品，具有非常強(qiáng)的保健作用[1-2]。茶產(chǎn)業(yè)作為中國(guó)的優(yōu)勢(shì)特色產(chǎn)業(yè)，在助力貴州農(nóng)業(yè)農(nóng)村鄉(xiāng)村振興方面具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[3]。伴隨著茶葉貿(mào)易全球化，消費(fèi)者對(duì)茶葉質(zhì)量的追求日益提高，提高茶葉品質(zhì)是發(fā)展茶產(chǎn)業(yè)的重中之重。都勻毛尖茶在貴州省黔南州大面積推廣，種植面積高達(dá)160萬(wàn)畝，40萬(wàn)群眾以茶為業(yè)。都勻毛尖原料大部分為都勻本地種與引進(jìn)的福鼎大白茶，福鼎大白茶發(fā)芽率高、抗旱性強(qiáng)，是十分優(yōu)良的茶樹(shù)遺傳資源[4]。茶中的茶多酚、氨基酸和咖啡堿是茶葉滋味和品質(zhì)的主要組成成分，其中茶多酚和氨基酸具有多種保健功能[5-7]。目前基于二代轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)對(duì)茶樹(shù)的研究已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用[8-10]，但由于其讀長(zhǎng)短，拼裝困難，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄本的拼接組裝不完整，而三代牛津納米孔技術(shù)（Oxford Nanopore Technology, ONT）憑借其超長(zhǎng)讀長(zhǎng)的優(yōu)勢(shì)可以彌補(bǔ)二代測(cè)序技術(shù)的不足，在轉(zhuǎn)錄本等信息的識(shí)別上更全面?；贠NT全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序可以從理論水平上更全面地挖掘與茶葉品質(zhì)、獨(dú)特芳香以及產(chǎn)量相關(guān)的代謝通路和生物過(guò)程?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，單分子ONT技術(shù)已經(jīng)在動(dòng)物、植物、微生物等領(lǐng)域得到應(yīng)用。Jansen等[11]利用ONT技術(shù)對(duì)歐洲鰻鱺的基因組進(jìn)行了測(cè)序，與之前的草圖相比準(zhǔn)確性大大增加。Fellers等[12]通過(guò)ONT技術(shù)對(duì)感染小麥組織進(jìn)行測(cè)序，證實(shí)了小麥條紋花葉病毒的存在，該結(jié)果表明ONT技術(shù)可以更準(zhǔn)確地識(shí)別病原體。Giordano等[13]證明通過(guò)單分子ONT平臺(tái)測(cè)序的數(shù)據(jù)足以完整地組裝釀酒酵母S288C菌株。同時(shí)，一些茶樹(shù)的基因組相繼被測(cè)序，如云抗10號(hào)[14]、舒茶早[15-16]、小葉茶碧云[17]、古茶樹(shù)[18]等，為改良茶葉品質(zhì)、提高茶葉產(chǎn)量提供大量數(shù)據(jù)支持。RNA-Seq分析是解鎖生命密碼非常重要的工具，但由于第二代高通量測(cè)序平臺(tái)[19]的轉(zhuǎn)錄組技術(shù)測(cè)得數(shù)據(jù)的拼接準(zhǔn)確性不高，使得深入理解細(xì)胞生命活動(dòng)困難重重。與二代技術(shù)相比，第三代測(cè)序技術(shù)具有通量高、讀長(zhǎng)長(zhǎng)、成本低等優(yōu)點(diǎn)，讀長(zhǎng)可達(dá)10 kb[20-21]。基于ONT[22]的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)是一種單分子實(shí)時(shí)測(cè)序技術(shù)，并且在測(cè)序時(shí)無(wú)須打斷RNA片段，所測(cè)即所得[23]，大大縮減生物基因組重構(gòu)和組裝的時(shí)間和成本，為轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究減少阻礙。第三代測(cè)序技術(shù)的錯(cuò)誤率雖然比二代高，大約為15%[24]，但是利用更正軟件加大測(cè)序深度可以大大降低錯(cuò)誤率，可使準(zhǔn)確率達(dá)到99.9%[25]。此外，龐丹丹等[26]利用PacBio三代測(cè)序技術(shù)對(duì)苦茶全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析，研究結(jié)果為探索苦茶特異性狀相關(guān)基因標(biāo)記的開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。夏麗飛等[1]通過(guò)PacBio平臺(tái)對(duì)紫娟茶樹(shù)全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析，為開(kāi)展紫娟茶樹(shù)葉片呈色機(jī)理提供數(shù)據(jù)支持。【本研究切入點(diǎn)】目前，利用三代納米孔測(cè)序技術(shù)研究茶葉的品質(zhì)和滋味鮮有報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究利用三代測(cè)序平臺(tái)ONT技術(shù)對(duì)都勻福鼎大白茶葉、根和莖進(jìn)行全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序比較分析，旨在探究與茶葉品質(zhì)相關(guān)的差異基因和代謝通路，為后續(xù)分子生物學(xué)研究提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

采摘貴州省都勻市黔南民族師范學(xué)院試驗(yàn)基地長(zhǎng)勢(shì)一致的福鼎大白茶扦插苗9株，分為3組，每組3盆，采摘嫩葉、嫩根和嫩莖分別作為葉、根和莖處理，每個(gè)組織3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，共9個(gè)樣本，包括葉片L1、L2、L3，根R1、R2、R3，莖S1、S2、S3，放入液氮中進(jìn)行固樣。將采集的樣本放入干冰中送往北京百邁客生物科技有限公司進(jìn)行全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析。

1.2 RNA提取、文庫(kù)構(gòu)建

利用北京天根生物技術(shù)有限公司的RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（DP441）對(duì)都勻福鼎大白茶葉、根和莖的RNA進(jìn)行提取。采用Nanodrop、Agilent2100及Agilent RNA 6000 Nano Kit對(duì)RNA的濃度和完整性進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)合格的RNA樣品，使用oligod（T）磁珠從TotalRNA中純化出poly（A）+RNA。其次利用Superscript Ⅳ reverse transcriptase反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，再使用帶barcode的引物及LongAmpTaq2*Master Mix進(jìn)行PCR擴(kuò)增。然后使用NEBNext End repair/dA-tailing Module進(jìn)行末端修復(fù)及加A。再次使用ONT SQKLSK109試劑盒及NEBNext Quick Ligationg Module進(jìn)行測(cè)序接頭的連接。最后使用PromethION測(cè)序儀及PromethION Flow Cells 9.4進(jìn)行測(cè)序，并將三代轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)提交至NCBI-SRA數(shù)據(jù)庫(kù)，BioProject的編號(hào)為PRJNA562747。

1.3 全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序平臺(tái)使用Oxford Nanopore Technologies的PromethION，將原始下機(jī)序列中長(zhǎng)度小于500 bp、Qscore小于7的低質(zhì)量序列和核糖體RNA序列過(guò)濾掉，根據(jù)兩端是否存在引物得到全長(zhǎng)序列，對(duì)全長(zhǎng)序列進(jìn)行polish獲得一致性序列，然后與安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)第一版的中國(guó)種茶樹(shù)[27]基因組或構(gòu)建的contig進(jìn)行比對(duì)，將identity和coverage的值分別設(shè)置為0.9和0.85，去除冗余，得到轉(zhuǎn)錄本序列，再利用gffcompare v0.9.8將全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本與基因組已知的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行比較，獲得新基因和新轉(zhuǎn)錄本。隨后進(jìn)行SSR分析、ORF預(yù)測(cè)、轉(zhuǎn)錄因子分析、lncRNA分析，并且將所有的轉(zhuǎn)錄本、新轉(zhuǎn)錄本、新基因、開(kāi)放閱讀框、轉(zhuǎn)錄因子和LncRNA都上傳到FigShare數(shù)據(jù)庫(kù)，DOI號(hào)分別為：10.6084/m9.figshare.13671901；10.6084/m9.figshare.14370011。將Fold Change≥2且FDR＜0.01作為篩選差異表達(dá)基因的標(biāo)準(zhǔn)，預(yù)測(cè)出葉與根、葉與莖、莖與根的差異轉(zhuǎn)錄本。最后，應(yīng)用軟件Blast2GO v2.5對(duì)差異轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行GO注釋，并通過(guò)將轉(zhuǎn)錄本的蛋白序列和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄的蛋白序列進(jìn)行BLAST比對(duì)得到KEGG功能注釋信息，繼而使用軟件blast v2.2.31將轉(zhuǎn)錄本與kog202101數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，得到轉(zhuǎn)錄本的KOG注釋信息。葉與根、葉與莖、莖與根的差異轉(zhuǎn)錄本的GO、KEGG和KOG注釋信息上傳至figshare數(shù)據(jù)庫(kù)，DOI號(hào)為：10.6084/m9.figshare.13671901。

1.4 轉(zhuǎn)錄本表達(dá)定量

應(yīng)用CPM（Counts per million）[28]計(jì)算轉(zhuǎn)錄本表達(dá)量。

式中：R：比對(duì)到某一轉(zhuǎn)錄本上的reads數(shù)；T：比對(duì)到參考轉(zhuǎn)錄組的片段總數(shù)。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證

為確保轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)質(zhì)量準(zhǔn)確性高，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)隨機(jī)選擇的4個(gè)基因進(jìn)行驗(yàn)證。試驗(yàn)材料和取樣方法同1.1。利用Aidlab公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TUREscript 1st Stand cDNA SYNTHESIS Kit）進(jìn)行cDNA的合成。使用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)定量PCR引物（表1）。以茶樹(shù)的GAPDH（GE651107.1 EST1434）基因?yàn)閮?nèi)參基因，利用2-△△Ct計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量，試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系及程序按照Fermentas公司SYBR GREEN I說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

表1 qRT-PCR引物Table 1 qRT-PCR primer

2 結(jié)果與分析

通過(guò)Nanopore三代全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?qū)F州省都勻市種植的福鼎大白茶葉、根和莖進(jìn)行測(cè)序分析。每個(gè)樣品測(cè)序產(chǎn)出clean data均達(dá)到7.93 GB，并且所有樣本的平均質(zhì)量值都達(dá)到Q9，9個(gè)樣品得到的全長(zhǎng)序列個(gè)數(shù)介于3768495～5078770（表2），利用經(jīng)過(guò)polish處理的全長(zhǎng)序列與第一個(gè)版本的中國(guó)種茶樹(shù)進(jìn)行minimap2.1.1[29]比對(duì)（表2），提取出69379個(gè)轉(zhuǎn)錄本。然后進(jìn)行融合轉(zhuǎn)錄本的預(yù)測(cè)，9個(gè)樣品的融合轉(zhuǎn)錄本個(gè)數(shù)為188～248。最后，預(yù)測(cè)出93102個(gè)SSR，獲得7556個(gè)新基因位點(diǎn)，65795個(gè)新轉(zhuǎn)錄本，45852個(gè)ORF，6335個(gè)轉(zhuǎn)錄因子和2229個(gè)lncRNA，并完成了58398個(gè)新轉(zhuǎn)錄本的功能注釋。

表2 Clean data數(shù)據(jù)Table 2 Clean data

2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)分析

2.1.1 SSR分析 利用MISA1.0軟件[30]對(duì)福鼎大白茶葉、根和莖的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組做SSR檢測(cè)，將轉(zhuǎn)錄本的序列長(zhǎng)度≥500 bp作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，共檢測(cè)到50013條序列具有SSR位點(diǎn)，包含7種類型的SSR，共78931個(gè)。其中完美單堿基重復(fù)SSR個(gè)數(shù)為53433，數(shù)量最多，其次是完美雙堿基重復(fù)，為27961個(gè)，然后依次是完美三、四、五、六堿基重復(fù)，數(shù)量分別為10316、586、254、552個(gè)。以搜索標(biāo)準(zhǔn)為1～6個(gè)堿基基序重復(fù)次數(shù)分別≥10、6、5、5、5、5在SSR位點(diǎn)中檢測(cè)，單堿基重復(fù)出現(xiàn)頻率最高是T/A（38139）。雙堿基重復(fù)出現(xiàn)最多的是TC/GA（7356），其次是CT/AG（7226）。三堿基重復(fù)最多的是GAA/TTC（598）和CCA/TGG（581）。四堿基重復(fù)以TTTA/TAAA（70）和TTAT/ATAA（31）占優(yōu)勢(shì)。五堿基和六堿基重復(fù)頻率最高的分別是TGTTA/TAACA（13）和GGTGCT/AGCACC（15）。以上研究結(jié)果與紫娟茶樹(shù)[31]和藤茶[32]的結(jié)果基本一致，為未來(lái)開(kāi)展茶樹(shù)遺傳圖譜構(gòu)建、SSR分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)及培育良種提供理論基礎(chǔ)。

2.1.2 新基因編碼區(qū)序列預(yù)測(cè) 利用TransDecoder5.0.0（https://TransDecoder.sourceforge.net）預(yù)測(cè)出開(kāi)放閱讀框58355個(gè)，其中完整開(kāi)放閱讀框45852條。預(yù)測(cè)的完整開(kāi)放閱讀框編碼蛋白序列長(zhǎng)度范圍主要在0～800氨基酸，0～100氨基酸有30455個(gè)，占52.19%，100～200個(gè)氨基酸的有22949個(gè)，占39.33%，200～300氨基酸有3936個(gè)，占6.74%（圖1A），與云南金花茶[33]通過(guò)ESTScan預(yù)測(cè)的CDS長(zhǎng)度大體趨勢(shì)相似，以上結(jié)果表明轉(zhuǎn)錄組的序列質(zhì)量較高。

2.1.3 轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè) 使用iTAK1.6軟件[34]預(yù)測(cè)都勻福鼎大白茶轉(zhuǎn)錄因子，共預(yù)測(cè)到轉(zhuǎn)錄因子6335個(gè)，主要分為20類，其中GRAS家族轉(zhuǎn)錄因子數(shù)量最多，其次是MYB-related、RLK-Pelle_DLSV、WRKY和C3H（圖1B），這些轉(zhuǎn)錄因子家族成員的獲得為后續(xù)分子生物學(xué)的研究提理論參考。

2.1.4 LncRNA預(yù) 測(cè) 分 別 應(yīng) 用Cpc[35]、Cnci[36]、Cpat1.2.2[37]、Pfam1.6[38]預(yù)測(cè)lncRNA，4種方法取交集共2229個(gè)（圖1C）。lncRNA主要分為基因間lncRNA（LincRNA）（1878/84.3%）、反 義lncRNA（Antisense-lncRNA）（110/4.9%）、內(nèi) 含 子lncRNA（Intronic lncRNA）（34/1.5%）、正義lncRNA（SenselncRNA）（207/9.3%），其中LincRNA最多，以上數(shù)據(jù)為將來(lái)研究lncRNA在茶中的調(diào)控機(jī)制提供重要參考。

2.2 功能注釋

為了獲得轉(zhuǎn)錄本的注釋信息（表3），將得到的新轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行eggNOG、COG、NR、Pfam、Swissprot、KEGG、GO和KOG注釋。

表3 新轉(zhuǎn)錄本注釋Table 3 New isoform annotation

2.2.1 轉(zhuǎn)錄本表達(dá)量分析 根據(jù)CPM計(jì)算出轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)量。采用CPM箱線圖從整體上對(duì)9個(gè)樣品的表達(dá)量進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)他們的表達(dá)水平基本上一致（圖1D）。

圖1 開(kāi)放閱讀框、轉(zhuǎn)錄因子、長(zhǎng)鏈非編碼RNA和轉(zhuǎn)錄本表達(dá)量分析Fig. 1 Analyses on ORF, transcription factor, lncRNA, and transcript expression

2.2.2 差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本 利用DESeq1.18.0[39]進(jìn)行葉、根和莖轉(zhuǎn)錄本的差異表達(dá)分析，篩選條件為Fold Chang≥2且FDR＜0.01，葉和根的差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本最多，莖和根的差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本最少（表4）。對(duì)差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)的功能注釋，共注釋了14306個(gè)差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本，分別有9649、2825和7349個(gè)轉(zhuǎn)錄本注釋到GO、KEGG和KOG數(shù)據(jù)庫(kù)中。

表4 差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本注釋Table 4 Annotation of DETs

2.2.3 差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本GO注釋 對(duì)差異轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行GO注釋，一級(jí)分類主要包含3個(gè)類型，分別為生物過(guò)程、細(xì)胞組分和分子功能；二級(jí)分類主要分為52個(gè)類別。在葉與根的差異轉(zhuǎn)錄本中生物學(xué)過(guò)程涉及21個(gè)類別，以代謝過(guò)程（總轉(zhuǎn)錄本/差異轉(zhuǎn)錄本，29572/5019）、細(xì)胞過(guò)程（26938/4021）、單生物過(guò)程（19040/3581）最多。細(xì)胞組分包括16個(gè)功能組，其中細(xì)胞（27641/4454）、細(xì)胞部分（27478/4411）、膜（20620/3584）最多。分子功能分為15個(gè)功能類別，催化活性（30151/5408）、結(jié)合（24530/3744）、轉(zhuǎn)運(yùn)活性（3340/651）最多（圖2）。葉與莖、莖與根的差異轉(zhuǎn)錄本的GO、KEGG和KOG注釋信息上傳至figshare數(shù)據(jù)庫(kù)，DOI號(hào)為：10.6084/m9.figshare.13671901。研究結(jié)果豐富了都勻福鼎大白茶的分子生物學(xué)信息，可為進(jìn)一步研究茶葉的品質(zhì)提供理論參考。

2.2.4 差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本KEGG注釋 KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)共注釋到2825個(gè)葉與根的差異轉(zhuǎn)錄本，其中參與碳代謝（270、9.56%）、氨基酸生物合成（192、6.8%）、苯丙素生物合成（182、6.44%）、淀粉和蔗糖代謝（167、5.91%）、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（137、4.85%）的差異轉(zhuǎn)錄本最多（圖3）。參與茶葉品質(zhì)形成中涉及茶葉滋味相關(guān)代謝途徑的有氨基酸生物合成、各種氨基酸代謝、類黃酮生物合成和苯丙素生物合成。與香氣相關(guān)的代謝途徑有泛醌和其他萜烯醌生物合成和萜類骨架生物合成。研究結(jié)果為后期深入開(kāi)展提高茶葉品質(zhì)的研究提供理論基礎(chǔ)。

圖3 葉與根差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本KEGG功能分類Fig. 3 KEGG function annotation of DETs between leaf and root

2.2.5 差異轉(zhuǎn)錄本的KOG注釋 葉與根的差異轉(zhuǎn)錄本與KOG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)并根據(jù)其功能進(jìn)行分類，有7349個(gè)轉(zhuǎn)錄本得到注釋。按照功能一共分為25類，注釋到一般功能預(yù)測(cè)（1531）中的差異轉(zhuǎn)錄本最多，其次是翻譯后修飾、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換、伴侶蛋白（924），次級(jí)代謝生物合成運(yùn)輸和分解代謝（812）。注釋到KOG數(shù)據(jù)庫(kù)最少的葉與根差異轉(zhuǎn)錄本數(shù)是染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)（30）、真核細(xì)胞的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)（20）、核結(jié)構(gòu)（6）、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)（0）（表5）。

表5 部分葉與根差異轉(zhuǎn)錄本的KOG分類Table 5 DETs KOG classification between leaf and root

2.3 差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本qRT-PCR分析

以茶樹(shù)的GAPDH（GE651107.1 EST1434）基因?yàn)閮?nèi)參基因，隨機(jī)選取4個(gè)差異表達(dá)基因（ONT.4041、ONT.8670、TEA019914、TEA007016）進(jìn)行qRTPCR驗(yàn)證（圖4），結(jié)果表明其表達(dá)量與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果相一致，進(jìn)一步說(shuō)明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序質(zhì)量較高。

圖4 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果與qRT-PCR表達(dá)量比對(duì)Fig. 4 Comparison between RNA-seq and qRT-PCR

3 討論

ONT第三代測(cè)序技術(shù)是近年來(lái)新興的單分子測(cè)序技術(shù)[40]，DNA/RNA鏈以一定的速率通過(guò)納米孔通道蛋白時(shí)，單個(gè)堿基會(huì)引起不同電學(xué)信號(hào)的變化，根據(jù)電流信號(hào)對(duì)序列進(jìn)行實(shí)時(shí)測(cè)定[41-42]。本文利用ONT全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)及生物信息學(xué)分析獲得了福鼎大白茶葉、根和莖9個(gè)樣品的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組。通過(guò)CPM分析葉、根和莖9個(gè)樣品的轉(zhuǎn)錄本表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)它們的整體表達(dá)水平基本上一致。另外，我們共得到93102個(gè)SSR，其中完美單堿基重復(fù)和完美雙堿基重復(fù)最多。單堿基、雙堿基、三堿基和四堿基重復(fù)出現(xiàn)頻率最高，分別是T/A、CT/AG、GAA/TTC、TTTA/TAAA，與朱興正等[43]和鞠燁等[44]的研究結(jié)果基本一致，為未來(lái)開(kāi)展茶樹(shù)遺傳圖譜構(gòu)建、SSR分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)及培育良種提供理論基礎(chǔ)。預(yù)測(cè)的45852個(gè)完整ORF序列，蛋白序列長(zhǎng)度范圍主要在0～800氨基酸，0～300個(gè)氨基酸最多，與夏麗飛等[1]和潘敏等[45]的研究結(jié)果大體相似，表明轉(zhuǎn)錄組的序列質(zhì)量較高。我們還對(duì)轉(zhuǎn)錄因子、LncRNA進(jìn)行了分析，研究結(jié)果為將來(lái)研究LncRNA在茶中的調(diào)控機(jī)制提供重要參考，為后續(xù)分子生物學(xué)的研究提供理論參考。

根據(jù)GO功能顯著性富集分析，上調(diào)基因和下調(diào)基因在生物過(guò)程中，代謝過(guò)程（2162/2857），即葉與根中有2162差異轉(zhuǎn)錄本在生物過(guò)程中上調(diào)，2857個(gè)轉(zhuǎn)錄本在此過(guò)程中下調(diào)。單生物過(guò)程（1688/1893），細(xì)胞過(guò)程（1673/2348）、生物調(diào)節(jié)（1673/633）等顯著富集。在細(xì)胞組分中，細(xì)胞（1623/2831）、細(xì)胞部分（1608/2803）、膜（1597/1987）、膜部分（978/1201）等顯著富集。在分子功能中，催化活性（2496/2912）、結(jié)合性（1771/1973）、轉(zhuǎn)運(yùn)活性（331/320）等顯著富集。以上結(jié)果是葉與根差異轉(zhuǎn)錄本數(shù)最多的生物過(guò)程，朱興正[43]等采用PacBio平臺(tái)分析了保護(hù)品種云茶1號(hào)的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組，Unigene的GO功能注釋與本研究結(jié)果相一致。同時(shí)，以上結(jié)果顯示在這些生物過(guò)程中大部分下調(diào)轉(zhuǎn)錄本數(shù)都比上調(diào)轉(zhuǎn)錄本多，即在都勻福鼎大白茶樹(shù)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，參與葉生物過(guò)程的轉(zhuǎn)錄本比根多。

在KEGG中，葉與根的差異轉(zhuǎn)錄本中有182個(gè)差異基因參與苯丙素的生物合成，KEGG直系同源基因ID號(hào)為ko00940。對(duì)該通路的苯丙氨酸、絡(luò)氨酸、色氨酸的生物合成到木質(zhì)素的通路進(jìn)行深入分析，涉及6個(gè)節(jié)點(diǎn)，其中4個(gè)節(jié)點(diǎn)中的基因全部上調(diào)，2個(gè)節(jié)點(diǎn)既有上調(diào)又有下調(diào)基因。將涉及的所有基因根據(jù)基因表達(dá)量進(jìn)行聚類分析，TEA019411、TEA017242、TEA028682、 TEA029025、TEA006839、TEA017067、ONT.2421、TEA008747、TEA031671、TEA005749等基因在葉中高表達(dá)，都屬于K00430，并且親緣關(guān)系較近，與過(guò)氧化物酶有關(guān)，參與氧化應(yīng)激反應(yīng)。過(guò)氧化物酶與光合作用、呼吸作用有關(guān)，并能使組織中所含的某些碳水化合物轉(zhuǎn)化成木質(zhì)素，增加木質(zhì)化的程度，是組織老化的一種標(biāo)志。在氨基酸生物合成中，有192個(gè)差異基因參與，其中涉及谷氨酸合成酶的基因有ONT.24127.2和TEA003892.1等，并且這兩個(gè)差異基因在根中表達(dá)上調(diào)。茶氨酸是在茶樹(shù)根部由乙胺和谷氨酸在酶的催化下合成的，然后運(yùn)輸?shù)饺~部，參與代謝過(guò)程。而茶氨酸的降解與陽(yáng)光有關(guān)，影響茶氨酸向兒茶素轉(zhuǎn)化，因此，茶氨酸的合成與降解與茶葉品質(zhì)密切相關(guān)。以上結(jié)果表明，茶樹(shù)葉片通過(guò)光合作用等一系列反應(yīng)形成與茶葉品質(zhì)相關(guān)的化合物。

葉與根上調(diào)和下調(diào)差異轉(zhuǎn)錄本KOG分類中，一般功能預(yù)測(cè)（611/920），上調(diào)轉(zhuǎn)錄本611，下調(diào)轉(zhuǎn)錄本920。翻譯后修飾、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換、伴侶蛋白（349/575），碳水化合物的運(yùn)輸和代謝（339/405）的分類中，大部分下調(diào)轉(zhuǎn)錄本比上調(diào)轉(zhuǎn)錄本多，再一次說(shuō)明茶樹(shù)生長(zhǎng)過(guò)程中葉的重要性。本研究的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和各項(xiàng)結(jié)果豐富了茶樹(shù)的分子生物學(xué)信息，可為進(jìn)一步研究茶葉的品質(zhì)和獨(dú)特的芳香及與之相關(guān)的基因提供理論基礎(chǔ)。為保障茶葉產(chǎn)量和品質(zhì)打下良好基礎(chǔ)，為后續(xù)良種選育及分子生物學(xué)研究提供重要的數(shù)據(jù)支持。