童天嬌，劉 偉，胥鑫萌，李恒睿，劉軍海

（陜西理工大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，陜西 漢中 723000）

近年來國內(nèi)外學(xué)者在對秦皮的大量研究中發(fā)現(xiàn)，秦皮具有極高的臨床藥用價值[1-2]，秦皮的主要化學(xué)成分是香豆素[3]。白芷[4]、北沙參[5]等植物中都含有香豆素類成分，其多以糖類化合物的形式存在于植物器官中，如花、嫩葉、果實等，此外，在某些真菌中也發(fā)現(xiàn)有香豆素類成分存在[6]。香豆素類成分的生物活性極高，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)已經(jīng)證實香豆素類成分對于多種人類頑疾[7]具有治療功效，且存在進(jìn)一步的研究價值。醫(yī)學(xué)上發(fā)現(xiàn)香豆素對腫瘤、過敏、發(fā)炎具有一定的治療效果[8-13]，香豆素還是一種天然抗氧化劑[14]，可延緩人體的衰老，增強(qiáng)自身抵抗力。大量研究從生物化學(xué)分子構(gòu)成上闡述了天然香豆素的藥理功效，天然香豆素的母核不同位置的不同取代基對于其生物活性的影響起決定性作用[15]。秦皮甲素屬于香豆素類化合物，因此本文以秦皮甲素標(biāo)準(zhǔn)品[16]來研究提取總香豆素的含量。借助超聲波輔助法提取秦皮中香豆素，并對提取物進(jìn)行抗氧化性研究，以期為秦皮中香豆素的提取、開發(fā)以及綜合利用提供理論參考和試驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

秦皮，購自藥材店，符合《中華人民共和國藥典》規(guī)定，無水乙醇（分析純，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.7%）；秦皮甲素對照品（分析標(biāo)準(zhǔn)級，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%），酷爾生物科技有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

FW100 型高速萬能粉碎機(jī)、WGLL-230BE 型電熱鼓風(fēng)干燥箱，天津市泰斯特儀器有限公司；BSA2245-CW型電子天平，維多利斯科學(xué)儀器（北京）公司；JP-010型數(shù)控超聲波清洗器，深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司；722G 型紫外可見分光光度計，上海儀電分析儀器有限公司；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；LC-2030 型液相色譜儀，島津企業(yè)管理有限公司。

1.2 方法

1.2.1 原料預(yù)處理

精確稱取秦皮粉末1.00 g，將其置于燒杯中，將乙醇作為提取溶劑，固定超聲功率100 W；超聲溫度50 ℃；超聲時間50 min；提取次數(shù)為3 次，用200 目紗篩進(jìn)行過濾，將濾液趁熱減壓抽濾，最后用乙醇定容于100 mL 容量瓶中，測定香豆素的含量并計算得率。

1.2.2 單因素試驗設(shè)計

1.2.2.1 表面活性劑用量的篩選

分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0、1%（0.01 g）、3%（0.03 g）、5%（0.05g）、7%（0.07g）的表面活性劑十二烷基硫酸鈉，按“1.2.1”中的條件提取，研究不同表面活性劑用量對秦皮香豆素得率的影響。

1.2.2.2 乙醇濃度的篩選

加入的乙醇濃度分別為50%、60%、70%、80%、90%，按“1.2.1”中的條件提取，研究不同乙醇濃度對秦皮香豆素得率的影響。

1.2.2.3 提取溫度的篩選

分別設(shè)定提取溫度為30、40、50、60、70 ℃，按“1.2.1”中的條件提取，研究不同提取溫度對秦皮香豆素得率的影響。

1.2.2.4 提取時間的篩選

分別設(shè)定提取時間為20、30、40、50、60 min，按“1.2.1”中的條件提取，研究不同提取時間對秦皮香豆素得率的影響。

1.2.2.5 料液比的篩選

用60%乙醇進(jìn)行提取，設(shè)置料液比分別為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g/mL），按“1.2.1”中的條件提取，研究不同料液比對秦皮香豆素得率的影響。

1.2.3 正交試驗設(shè)計

以提取時間、提取溫度、溶劑濃度、料液比為主要影響因素，以香豆素得率為考察指標(biāo)，進(jìn)行L9(34)正交試驗，試驗因素與水平見表1。

表1 L9(34)正交試驗因素水平表Table 1 L9(34)orthogonal test factors and levels table

1.2.4 香豆素得率的測定

用電子天平稱取秦皮甲素標(biāo)準(zhǔn)品8 mg，用無水乙醇溶解定容至100 mL 的容量瓶中，制備成質(zhì)量濃度為0.08 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，然后分別量取2.5、5、7.5、10、12.5、15 mL，用無水乙醇定容到50 mL 的容量瓶中，搖勻后靜置，配制成標(biāo)準(zhǔn)溶液。

色譜條件：C18（4.6 mm×150 mm，5 μm），流動相為0.1%甲酸溶液∶甲醇＝1∶9 進(jìn)行洗脫，檢測波長：334nm，進(jìn)樣量：10 μL，柱溫：30 ℃，流速：0.6 mL/min，保留時間約為3 min，測定香豆素色譜峰面積。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到峰面積（Y）與香豆素質(zhì)量濃度X（μg/mL）的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y＝39 564.45 X-19 828.13，其中R2＝0.999 53。按照香豆素標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定方法測定樣品色譜峰面積，按下式計算香豆素得率。

式中：c 為香豆素標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出的提取液濃度（mg/mL）；v 為樣品溶液體積（mL）；n 為稀釋倍數(shù)；m為秦皮粉末質(zhì)量（mg）。

1.2.5 抗氧化性試驗

1.2.5.1 DPPH 自由基清除率的測定

參照謝佳函等[17]的方法，稍作修改。精密稱取DPPH 2.5 mg，用無水乙醇定容到100 mL 容量瓶中，取7支10mL 具塞試管，分別量取1、1.5、2、2.5、3、3.5、4mL 濃度為1.897 mg/mL 的香豆素提取液，分別加入2 mL 的DPPH 溶液（現(xiàn)配現(xiàn)用，避光放置），搖勻后靜置30 min，用可見分光光度計測量吸光度值為A，波長調(diào)至517nm，以無水乙醇加DPPH 溶液為空白對照，記為A0；待測樣品和無水乙醇加DPPH 溶液的混合液為空白，記為B?？瞻讓φ罩蠨PPH 的濃度與加入不同體積的香豆素提取液的濃度一致。VC 作為對照組。按下式計算清除率。

1.2.5.2 羥自由基清除率的測定

參照薛天樂[18]的方法，稍作修改。取7 支20 mL具塞試管依次加入0.5 mL 濃度為9 mmol/L 的水楊酸-乙醇溶液，分別量取0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5 mL濃度為1.897 mg/mL 的香豆素提取液于試管中，加入0.5 mL 濃度為9 mmol/L 的硫酸亞鐵溶液、3.5 mL 蒸餾水，最后再加入5.0 mL 濃度為88 mmol/L 的雙氧水，搖勻，靜置15 min。待溶液反應(yīng)完全，于510 nm 處測定吸光度A，參比為蒸餾水。用0.5 mL 的蒸餾水代替雙氧水溶液測得的吸光度為B，參比為蒸餾水。用0.5 mL 的蒸餾水代替秦皮中香豆素提取液所測得的吸光度為A0，參比為蒸餾水?？瞻讓φ罩蠨PPH 的濃度與加入不同體積的香豆素提取液濃度一致。VC 作為對照組。按“1.2.5.1”中公式計算清除率。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

使用Origin 8.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 香豆素提取單因素試驗結(jié)果

2.1.1 表面活性劑用量對秦皮香豆素得率的影響

由圖1 可知，隨表面活性劑的增加，秦皮中香豆素得率呈先上升后下降的趨勢。當(dāng)表面活性劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%時，得率達(dá)到最大，這可能是因為表面活性劑所特有的雙親分子結(jié)構(gòu)在香豆素提取過程中使表面張力降低，更容易讓乙醇滲入到香豆素中，內(nèi)擴(kuò)散速度加快。綜上考慮，表面活性劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%較為適宜。

圖1 表面活性劑用量對秦皮香豆素得率的影響Fig.1 Effects of surfactants additions on extraction yields of coumarin from cortex fraxini

2.1.2 乙醇濃度對秦皮香豆素得率的影響

由圖2 可知，隨著乙醇濃度的增大，得率呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢。當(dāng)乙醇濃度達(dá)到60%時，香豆素得率達(dá)到最高點，這可能是因為60%乙醇濃度的極性與香豆素的極性非常接近。所以，選擇60%的乙醇濃度較為適宜。

圖2 乙醇濃度對秦皮香豆素得率的影響Fig.2 Effects of ethanol concentrations on extraction yields of coumarin from cortex fraxini

2.1.3 提取溫度對秦皮香豆素得率的影響

由圖3 可知，隨著溫度升高，得率先上升后下降，當(dāng)溫度達(dá)到50 ℃時，得率達(dá)到最高點，而超過50 ℃開始下降?？赡苁且驗闇囟冗^高，當(dāng)接近或達(dá)到沸點時，乙醇揮發(fā)變快，浸出過程難以穩(wěn)定，從而造成得率降低。另外，高溫條件下可能有更多的雜質(zhì)溶出，因此綜合考慮，選取50 ℃為較適宜的提取溫度。

圖3 提取溫度對秦皮香豆素得率的影響Fig.3 Effects of extraction temperatures on extraction yields of coumarin from cortex fraxini

2.1.4 提取時間對秦皮香豆素得率的影響

由圖4 可知，隨著提取時間的延長，得率先上升后下降，提取時間為50 min 時得率最高，之后得率下降，這可能是因為超聲波具有機(jī)械剪切作用，長時間作用破壞了香豆素的結(jié)構(gòu)，使得后續(xù)處理過程中秦皮香豆素?fù)p失而影響得率。因此，選擇提取時間為50 min 較為適宜。

圖4 提取時間對秦皮香豆素得率的影響Fig.4 Effects of extraction time on extraction yields of coumarin from cortex fraxini

2.1.5 料液比對秦皮香豆素得率的影響

由圖5 可知，在料液比（g/mL）為1∶5～1∶10 范圍內(nèi)，秦皮香豆素得率呈上升趨勢，這可能是因為當(dāng)秦皮質(zhì)量一定時，溶劑用量越大，它的體系滲透壓就越大，香豆素越容易提取出來。但繼續(xù)增大溶劑用量，得率趨于下降，這是因為當(dāng)提取溶劑用量增大到一定程度后，隨著提取的進(jìn)行，滲透壓變化減小，滲透壓的改變對香豆素提取不再有明顯的作用，當(dāng)溶劑用量過大時，增加了超聲波破碎細(xì)胞的阻力，使細(xì)胞破碎程度開始下降，故降低了有效成分的提取。因此，綜合考慮，選取料液比1∶10（g/mL）較為適宜。

圖5 料液比對秦皮香豆素得率的影響Fig.5 Effects of material-liquid ratios on extraction yields of coumarin from cortex fraxini

2.2 正交試驗結(jié)果

由表2 可知，秦皮中香豆素提取的最佳工藝條件為A2B1C1D2，即提取時間40 min、提取溫度60 ℃、乙醇濃度50%、料液比為1∶10（g/mL）。按此條件進(jìn)行3次驗證試驗，取平均值，得到秦皮中香豆素得率為1.038%。由表3 可知，4 種因素對得率的影響均不顯著。

表2 超聲輔助提取秦皮香豆素L9(34)正交試驗結(jié)果Table 2 L9(34)orthogonal test results of ultrasonic-assisted extraction of coumarin from cortex fraxini

表3 方差分析結(jié)果Table 3 Results of variance analysis

2.3 香豆素抗氧化性研究結(jié)果

2.3.1 香豆素提取液對DPPH 自由基的清除能力

由圖6 可知，香豆素提取液對DPPH 自由基有較好的清除能力，隨著濃度的升高清除能力逐漸增強(qiáng)，且顯著高于對照組VC 的清除率（P＜0.05），當(dāng)溶液體積為3 mL 以后清除作用逐漸平穩(wěn)。香豆素提取液和VC 對DPPH 自由基都具有良好的清除能力，表明香豆素具有很好的抗氧化作用，相同濃度下對DPPH 自由基的清除能力強(qiáng)于VC。

圖6 香豆素提取液和VC 對DPPH 自由基的清除作用Fig.6 Scavenging effects of coumarin extract and VC on DPPH free radicals

2.3.2 香豆素提取液對羥自由基的清除能力

由圖7 可知，香豆素提取液對羥自由基具有很強(qiáng)的清除能力，并且隨著樣品濃度升高其對羥自由基的清除作用加強(qiáng)。當(dāng)溶液體積增至2.5 mL 以后，VC 清除率趨于穩(wěn)定，香豆素提取液在3 mL 以后清除率趨于平穩(wěn)，且在相同濃度下，樣品溶液羥自由基清除能力均顯著高于VC 溶液（P＜0.05），說明香豆素提取液抗氧化活性高于VC 溶液。

圖7 香豆素提取液和VC 對羥自由基的清除作用Fig.7 Scavenging effects of coumarin extract and VC on hydroxyl radicals

3 結(jié)論

本文采用表面活性劑強(qiáng)化技術(shù)，通過超聲波輔助提取秦皮中香豆素，在單因素試驗基礎(chǔ)上，以正交試驗優(yōu)化了提取工藝。得到秦皮中香豆素的最佳提取工藝條件為：表面活性劑用量3%，提取時間40 min，提取溫度60 ℃，乙醇濃度50%，料液比1∶10（g/mL），平均得率為1.038%?？寡趸囼灲Y(jié)果表明，秦皮中香豆素具有很好的抗氧化作用，相同濃度下樣品溶液對DPPH 自由基和羥自由基的清除能力強(qiáng)于VC。

本文選取十二烷基硫酸鈉作為表面活性劑，對秦皮香豆素提取有強(qiáng)化作用，且成本較低，具有較好的發(fā)展前景，可為香豆素的提取以及秦皮的開發(fā)提供積極的參考價值。