趙 燦，莫 琰，劉傳菊，豁銀強，張 倩，楊 瑩，湯尚文,*

（1.湖北文理學院，湖北 襄陽 441053；2.襄陽市農業(yè)科學院，湖北 襄陽 441057；3.襄陽市公共檢驗檢測中心，湖北 襄陽 441104）

核桃屬胡桃科胡桃屬，為世界著名的四大堅果之一，在我國有著悠久的栽培歷史，是我國重要的栽培經濟樹種[1]。核桃營養(yǎng)價值豐富，其加工品如干核桃、炒核桃（仁）、核桃油和核桃粉等廣受消費者青睞。經自然演變和人工培育，目前我國核桃種質資源十分豐富，已有記載的無性系優(yōu)良品種（系）216 個，農家實生良種164 個，優(yōu)良單株（系）486 個[2]。雖然在研究人員長期實踐下，我國已篩選出一批核桃優(yōu)良新品種，如溫185、魯香、綠嶺和香玲等，但各核桃產區(qū)因成本、管理等原因，核桃品種混雜、良莠不齊[3]。

從加工角度來看，不同品種核桃的加工適宜性差別很大，有些品種油脂含量高，適宜于加工核桃油；有些品種蛋白含量高，適宜于加工核桃蛋白飲料；有些核桃香味突出、口感酥脆，適宜于干制鮮食。如何準確識別核桃品種、確定其加工適宜性以指導原料采購，是眾多中小核桃加工企業(yè)面臨的首要問題。有眾多研究人員采用分子標記[4-6]、光譜法[7-8]、同位素法[9]、元素分析法[10]、X 射線[11]、營養(yǎng)成分分析[12]和表型性狀[13]等方法研究核桃種質資源和產地的鑒定、分類。但DNA分子標記等方法對于試驗平臺和技術人員水平要求較高，普通加工企業(yè)難以具體操作。

眾多方法中通過表型性狀鑒定核桃品種是較為簡單易行的一種方法[13]，其通過簡單的測量和對外觀的觀察即可初步鑒定核桃品種。我國分別于2011 年和2016 年先后出臺了GB/T 26909—2011[14]《植物新品種特異性、一致性、穩(wěn)定性測試指南 核桃屬》和NY/T 2935—2016[15]《核桃種質資源描述規(guī)范》，兩份文件均以表型性狀為主要指標給出了核桃種質資源描述的方法，其對于核桃種質的鑒定具有指導性的作用。但兩份標準中均有大量指標需要通過研究人員的主觀觀察進行確定，例如堅果形狀、縫合線、核殼溝紋、核殼刻窩、取仁難易程度等，這些指標的判定會由于觀察人員的經驗和主觀性產生較大的差異。

鑒于上述問題，本文擬從核桃表觀性狀中挑選一批能夠客觀測量的指標，結合主成分分析法和聚類分析法研究不同品種核桃的差異，建立基于表型性狀的核桃品種區(qū)分方法，以期為核桃加工廠提供指導。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

試驗測試核桃均由襄陽金康園農業(yè)發(fā)展有限公司提供，其中綠嶺核桃（LL）由公司在?？凳召彛瑴?85 核桃（W）、新新2 號（XX）采購于新疆，大泡核桃（DP）采購于云南，綿核桃（M）采購于山西。脂肪和蛋白質測定所用試劑和藥品均為國產分析純。

1.1.2 儀器與設備

K1100 全自動凱氏定氮儀和SOX406 索氏提取儀，山東海能科學儀器有限公司；MS-70 快速水分測定儀，日本AND 公司；OXITEST 油脂氧化測定儀，意大利VELP 公司。

1.2 方法

1.2.1 核桃形態(tài)數(shù)據(jù)采集

1.2.1.1 單果質量、果仁質量和出仁率

參照NY/T 2935—2016[15]采用稱重計算核桃堅果的單果質量、果仁質量和出仁率。不同樣品隨機選取10 個堅果，手工去殼取出核桃仁，稱核桃單果質量和果仁質量，并計算出仁率。

出仁率（%）=m1/m2×100式中：m1為果仁質量，g；m2為核桃單果質量，g。

1.2.1.2 核桃單果3 徑測量

參照文獻[16]的方法，各樣品隨機選取10 個堅果，使用游標卡尺，按圖1 所示量取核桃3 徑。核桃堅果中部胴部之間的距離記為側徑D1，核桃堅果中部縫合線之間的距離記為橫徑D2，核桃堅果頂部與底部之間的距離記為縱徑H，側徑、橫徑、縱徑的3 徑平均值為A。以上單位均為mm。

圖1 核桃測量示意圖Fig.1 Schematic diagram of walnut measurement

1.2.2 測定項目與方法

水分含量：參照GB 5009.3—2016[17]中第一法（直接干燥法）規(guī)定的內容進行測定。

脂肪含量：參照GB 5009.6—2016[18]中第一法（索氏抽提法）規(guī)定的內容進行測定。

蛋白質含量：參照GB 5009.5—2016[19]中第一法（凱式定氮法）規(guī)定的內容進行測定。

由于單個核桃仁質量在6～10 g 的樣品量較少，水分、蛋白、脂肪檢測時將多個核桃仁混合后進行檢測，脂肪和蛋白質含量測定后折算成干物質含量表示，單位為g/100 g 干物質。

1.2.3 核桃氧化誘導期測試

核桃去殼后研磨混合均勻稱取10 g 樣品，放入樣品盤平鋪后密封，向樣品倉充入純氧至氧壓為600 kPa，測試溫度設置為90 ℃。每種核桃平行測試3 次。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Origin 2018 計算及進行顯著性分析，表示方法為±s；主成分分析和聚類分析采用Origin 2018（Principal Component Analysis 插件和Heat Map with Dendrogram 插件）進行分析并繪圖。

2 結果與分析

2.1 核桃外觀形貌分析

圖2 為供試5 種核桃的外觀形貌。根據(jù)NY/T2935—2016[15]中所述方法，對5 種核桃表型差異進行觀察并描述。DP 核桃在外觀上與其他4 種有明顯不同，核桃堅果形狀為方圓形，截面呈橢圓形，果頂有明顯凹陷，核桃仁呈圓形；顏色較深，果形較??；表面核殼溝紋密集，核殼刻窩較深。W、LL、XX 和M 核桃在果實表型上較為接近，但亦有細微差別。XX 核桃果頂較平，M核桃堅果形狀為長橢圓形，W 核桃相對LL、XX 和M3 核殼溝紋密集且核殼刻窩較深。根據(jù)核桃果實表型形狀對核桃進行分類和鑒定雖然簡便易行，但受觀察人員主觀判斷因素影響較大，不同觀察人員對同一核桃果實外觀表型的觀察結果很可能各不相同。

圖2 五種核桃外觀形貌Fig.2 The appearance morphology of five kinds of walnuts

2.2 核桃表型及成分分析

為方便在加工前對核桃品種進行準確辨識，對5 種核桃的D1、D2、H、A、D1/D2、D1/H、D2/H、m1、m2和m1/m2共10 項表型數(shù)據(jù)以及蛋白質和脂肪含量進行了測量和計算，結果見表1。

表1 核桃表型及成分數(shù)據(jù)Table 1 Phenotype and composition data of walnuts

表1 中表型數(shù)據(jù)均為單個核桃的測量和計算數(shù)據(jù)。由表1 可以看出，DP 核桃的3 徑平均值A、橫徑D2和縱徑H 均顯著低于其他品種（P＜0.05）；W 和LL核桃的側徑D1、3 徑平均值A 和單果質量m2相近，均顯著高于其他3 個品種（P＜0.05）；W 核桃的橫徑D2、橫縱徑比D2/H、果仁質量m1和出仁率m1/m2以及LL核桃的縱徑H 顯著高于其他品種（P＜0.05）；W 核桃脂肪含量顯著低于其他品種（P＜0.05），LL 核桃的脂肪以及蛋白含量較高。從商品屬性上來說，較大的單果尺寸和出仁率有利于核桃的銷售[20-21]，蛋白和脂肪含量較高也意味著營養(yǎng)價值高，因此W 核桃和LL 更適合于作為商品化品種。

2.3 核桃表型數(shù)據(jù)的主成分分析（PCA）

核桃的表型性狀數(shù)據(jù)通過簡單的測量取和稱量即可獲得，操作簡單易行。對5 種核桃的10 項表型數(shù)據(jù)進行采集和計算后，采用主成分分析法（PCA）和系統(tǒng)聚類分析法對所得數(shù)據(jù)進行分析（核桃脂肪和蛋白含量未納入PCA 和聚類分析基礎數(shù)據(jù)，主要由于這兩種統(tǒng)計方法要求由同一樣品完成所有測試指標數(shù)據(jù)采集，相互間才有可比較性，但單個核桃仁質量僅為6～10 g，樣品質量達不到重復檢測3 次的要求），以期能通過簡單的表型數(shù)據(jù)對核桃進行分類和鑒定，結果見表2～4 及圖3～4。

PCA 分析法可將原來有一定相關的指標重新組合成一組相互無關的綜合指標來明確度量各個指標的重要性[22]，以找出核桃表型分類的主要貢獻因子。從表2 可知，前3 個主成分因子提取特征值均大于1[23]，且累計方差貢獻率達到93.079%，能夠覆蓋試驗樣本的大部分表型信息。因此確定提取前3 個主成分因子進行進一步的分析。

表2 核桃表型數(shù)據(jù)評價因子特征值和累計方差貢獻率Table 2 Evaluation factor eigenvalues and cumulative variance contribution rates of walnuts phenotypic data

由表3 可知，D2、A 和m1等指標在第1 主成分（PC1）上有較高的載荷（一般認為因子載荷絕對值大于0.5 表明該變量對提取的主成分有較大貢獻，下同），說明第1 主成分主要涵蓋與核桃尺寸和質量相關的信息，可將其歸納為核桃大小信息（貢獻率為53.712 7%）；D1/H 和D2/H 在第2 主成分（PC2）上有較高的載荷，因D1/H 和D2/H 均為計算數(shù)據(jù)，從數(shù)據(jù)意義上可反映出核桃縱向剖面的形狀，因此可將其歸納為核桃縱向形狀信息（貢獻率為26.866 7%）；D1/D2在第3 主成分（PC3）上有較高的載荷，D1/D2可反映出核桃橫向截面的形狀，可將其歸納為核桃橫向形狀信息（貢獻率為12.499 4%）。

表3 核桃表型數(shù)據(jù)初始因子載荷和特征向量Table 3 Initial factor loads and eigenvectors of walnuts phenotypic data

將D1、D2、H、D1/D2、D1/H、D2/H、A、m1、m2和m1/m2共10 個指標原始數(shù)據(jù)經標準化后分別用X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10表示，經主成分分析建立核桃表型信息模型，得到如下線性關系式，式中F1、F2和F3表示3 個主成分的得分值，F(xiàn) 為綜合得分，各主成分系數(shù)由表2 中特征值計算得出。

根據(jù)表3 推測，F(xiàn)1（核桃大?。┱蛉≈翟酱?，核桃尺寸越大，核桃仁質量越大；F2（核桃縱向形狀）正向取值越大，核桃縱向剖面越趨向于圓形，取值越小，果形越長；F3（核桃橫向形狀）正向取值越大，核桃橫向剖面越趨向于橢圓形，取值越小，截面越圓。

提取PC1、PC2、PC3 主成分繪制主成分得分圖，如圖3 所示。從圖3 可以看出，W 核桃在PC1 正向取值上分布較多，說明W 核桃尺寸大、核桃仁質量大；DP 核桃在PC1 負向取值上分布較多，說明DP 核桃尺寸小、核桃仁質量?。籛 核桃在PC2 正向取值和PC3 負向取值上分布較多，說明W 核桃形狀呈圓球形；DP 核桃在PC2 正向取值和PC3 正向取值上分布較多，說明DP 核桃形狀呈扁橢圓形；LL 核桃在PC3正向取值上分布較多，XX 核桃在PC2 負向取值和PC3 負向取值上分布較多，M 核桃在PC2 負向取值上分布較多，說明LL、XX 和M 3 種核桃形狀呈長橢圓形。從圖3 亦可看出，圖中橢圓形區(qū)域為不同品種核桃表型數(shù)據(jù)PCA 因子的95%置信區(qū)間，圖中各橢圓區(qū)域均有交集，說明未能完全分離不同品種。由上可知，僅靠核桃表型數(shù)據(jù)很難將不同品種完全分離。

圖3 核桃表型數(shù)據(jù)主成分得分圖Fig.3 Principal component scores of walnuts phenotypic data

按上述模型分別計算提取3 個主成分的得分及綜合得分，結果見表4。F1、F2和F3得分最高的分別為W、W/DP 和LL 核桃，綜合得分F 最高的為W 核桃，其次為LL 核桃。說明，W 和LL 核桃從表型數(shù)據(jù)上看具有更好的商品屬性。

表4 核桃表型數(shù)據(jù)主成分綜合得分及排序Table 4 Comprehensive scores and ranking of principal components in walnuts phenotypic data

2.4 核桃表型數(shù)據(jù)的系統(tǒng)聚類分析

對5 種核桃本的10 項表型數(shù)據(jù)標準化轉換后進行系統(tǒng)聚類分析，聚類方法采用平均法，距離類型采用歐氏距離，聚類熱圖如圖4 所示。圖中顏色由綠到紅表示指標值由低到高，顏色越紅代表指標值越高，顏色越綠代表指標值越低。

圖4 核桃表型數(shù)據(jù)系統(tǒng)聚類分析圖Fig.4 Systematic cluster analysis diagrams of walnuts phenotypic data

由圖4 可以看出，在歐氏距離為3.309 2～4.295 2時，可將50 個樣本分為4 類（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ），每類分別含5、10、28 和7 個樣本；在歐氏距離為4.295 2～4.863 5 時，可分為3 類（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ+Ⅳ），每類分別含5、10 和35 個樣本；在歐氏距離大于4.863 5 時，可分為2 類（Ⅰ、Ⅱ+Ⅲ+Ⅳ），每類分別含5 和45 個樣本。但無論歐氏距離如何取值劃分，DP 核桃在表型數(shù)據(jù)聚類中均可自成一類，與其他4 種核桃在表型上有顯著性差異，其他品種核桃單果樣本聚類分析結果相互混雜，無法有效區(qū)分。且D1/D2和D1/H 兩個指標在DP核桃上顯著高于其他品種，這兩個指標較高代表DP核桃在外型上趨近于扁橢圓形。

對于10 個表型數(shù)據(jù)指標，在歐氏距離為6.129 7～8.132 8 時，可將指標分為3 類（Ⅰ#、Ⅱ#、Ⅲ#）；在歐氏距離＞8.132 8 時，可將指標分為2 類（Ⅰ#、Ⅱ#+Ⅲ#）。其中Ⅰ#可解釋為核桃大小信息，Ⅲ#可解釋為核桃形狀信息，這與前述PCA 分析結果類似。但Ⅱ#中形狀（D2/H）和質量信息（m1/m2）均存在，單獨作為一類指標進行分析較為牽強，可將10 個指標按Ⅰ#和Ⅱ#+Ⅲ#兩類進行分類，Ⅰ#代表核桃大小信息，Ⅱ#+Ⅲ#代表核桃形狀信息。

2.5 核桃的氧化曲線及氧化誘導期

干制核桃水分降低至安全水分含量之下時即可長期貯藏[24]，但由于核桃油脂含量豐富，在較長的貯藏期內會逐漸被氧化，影響其食用品質。采用油脂氧化測定儀繪制不同品種核桃的加速氧化曲線，同時推算其氧化誘導期。氧化誘導期從側面反映了核桃的耐貯藏性，誘導期越長說明其貯藏性越好[25]。圖5 為核桃的加速氧化曲線和5 種核桃的氧化誘導期，圖中Y1和Y2的交點對應的時間即為氧化誘導期。氧化曲線分為兩個階段：Ⅰ階段在測試開始至誘導期這段時間內，油脂緩慢吸收氧氣形成過氧化物；Ⅱ階段從誘導期時間點開始，油脂迅速吸收氧氣，過氧化物形成的同時由于高溫的影響迅速分解[26]。從圖中可以看出DP 核桃誘導期顯著大于其他4 種核桃（P＜0.05），其次為W、XX 和LL/M 核桃。

圖5 核桃的加速氧化曲線（A）和5 種核桃的氧化誘導期（B）Fig.5 Accelerated oxidation curves of walnuts and oxidation induction periods of five kinds of walnuts

2.6 表型、成分和氧化誘導期綜合聚類分析

以D1、D2、H、A、D1/D2、D1/H、D2/H、m1、m2、m1/m2、脂肪、蛋白質和氧化誘導期共13 項指標的平均值為基礎數(shù)據(jù)，進一步采用聚類分析法直觀地反映不同核桃指標間的差異，結果見圖6。

由圖6 可以看出，DP 核桃在D1/D2、D1/H、氧化誘導期和脂肪共4 項指標上顯著高于其他品種，在D2、A 和H 共3 項指標上顯著低于其他品種；W 核桃在D2、m1、D2/H 和m1/m2共4 項指標上顯著高于其他品種，在脂肪指標上顯著低于其他品種；LL 和XX 核桃在蛋白質指標上顯著高于其他品種；XX 核桃在D1和D1/H 共2 項指標上顯著低于其他品種；M 核桃在蛋白質含量上顯著低于其他品種。

圖6 核桃的聚類熱圖Fig.6 Clustering heat maps of walnuts

在歐氏距離小于2.805 1 時，5 種核桃可以很好地被區(qū)分；歐氏距離在2.805 1～3.338 3 時，5 種核桃被分為4 類，其中M 和XX 核桃被歸為一類；歐氏距離在3.338 3～5.122 5 時，核桃被分為3 類，其中M、XX 和LL 核桃被歸為一類；歐氏距離大于5.122 5時，除DP 核桃外，其他核桃歸為一類。說明表型（尺寸、質量、成分）和氧化特性指標相結合可有效區(qū)分不同品種的核桃。

所有檢測指標在歐式距離大于2.812 4 時被分為兩類。D1、D2、H、A、D2/H、m1、m2、m1/m2和蛋白質共9 個指標被分為一類，這類指標主要和核桃大小及蛋白質含量有關；D1/D2、D1/H、脂肪和氧化誘導期共4 個指標被分為一類，這類指標主要和核桃形狀及脂肪含量、組成（脂肪組成與氧化誘導期相關）有關。

3 結論

（1）采用核桃表型數(shù)據(jù)對核桃品種進行區(qū)分，其操作簡便易行，經PCA 分析，結果表明：采用主成分得分圖無法直觀有效地區(qū)分核桃品種，但采用主成分綜合評分法可對不同品種核桃的商品屬性進行評分和排序，5 種核桃中W 和LL 核桃具有較好的商品屬性。

（2）將表型（尺寸、質量、成分）和氧化特性指標相結合，采用系統(tǒng)聚類分析，通過聚類熱圖可直觀反映不同品種核桃的指標差異，能有效區(qū)分不同品種核桃。

（3）采用PCA 和系統(tǒng)聚類法區(qū)分不同品種核桃時，數(shù)據(jù)的采集以單個核桃為基本單元進行采集，尺寸和質量等數(shù)據(jù)采集較為簡單，但水分、脂肪、蛋白質和氧化誘導期等數(shù)據(jù)采集需要較多的樣品量，單個核桃仁不能滿足檢測量的需求。后續(xù)研究中可采用隨機抽樣方法擴大樣本數(shù)量，將不同品種的核桃隨機分為多份，每一份進行數(shù)據(jù)采集取平均值后再進行統(tǒng)計分析。