劉桃，朱路，李剛，賈鵬，謝亮，劉瀚旻，劉斌

肺動脈高壓（ PAH）是一種以進行性肺血管壓力逐漸升高為特征，最終導(dǎo)致右心衰竭的致死性疾病[1-2]。PAH 以肺血管重構(gòu)為主要的病理特征，包括肺小動脈中膜層的肺動脈平滑肌細(xì)胞（PASMC）的廣泛增生、遷移和細(xì)胞外膠原蛋白的過度沉積[3]。血小板衍生生長因子-BB （ PDGF-BB）作為一種在PAH 進展中發(fā)揮關(guān)鍵作用的生長因子，在促進PASMC 增殖、遷移和膠原沉積中起著重要作用[4-5]。同時Wnt/β-連環(huán)蛋白（β-catenin）信號通路廣泛參與了PDGF-BB 的誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞增殖、遷移以及膠原沉積的過程[6]。

人參皂苷CK （ginsenoside compound K, CK）是從人參中提取和分解出來的一種活性物質(zhì)。在增殖性疾病等研究中發(fā)現(xiàn)，CK 在抑制腫瘤增殖和遷移中發(fā)揮著顯著的作用[7-8]。近年來研究認(rèn)為，PAH是一種血管壁準(zhǔn)惡性生長的疾病，PASMC 的生長呈現(xiàn)類腫瘤化的特點[9-10]。然而CK 是否存在對PASMC 的增殖和遷移作用目前尚不可知。本實驗采用PDGF-BB 誘導(dǎo)的體外PASMC 增殖、遷移以及細(xì)胞外膠原沉積，用CK 作為干預(yù)藥物進行干預(yù)，來探討CK 在PAH 中可能存在的相關(guān)作用以及相應(yīng)的機制。以此為PAH 疾病在治療方面提供新的研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

SD 大鼠（成都達(dá)碩生物科技有限公司）；胎牛血清（FBS）、DMEM 培養(yǎng)基、F12 培養(yǎng)基、胰蛋白酶、青/鏈霉素（美國Gibco 公司）；PDGF-BB（美國R&D 公司）；CK（美國sigma 公司）；CCK-8 試劑盒（日本同仁化學(xué)）；大鼠Ⅰ型膠原蛋白（COL Ⅰ）和Ⅲ型膠原蛋白（COL Ⅲ）α1 鏈酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒（武漢科鹿生物科技有限公司）；COL Ⅰ、COL Ⅲ和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）引物（成都生工生物工程有限公司）；Trizol（美國Thermo 公司）；互補DNA（cDNA）合成試劑盒（美國Roche 公司）；GoTaq?qPCR Master Mix 熒光定量試劑盒（美國Promega 公司）；兔抗大鼠COL Ⅰ、β-catenin、GAPDH 單克隆抗體，小鼠抗大鼠COL Ⅲ單克隆抗體（美國Abcam 公司）；RIPA 裂解液、BCA 蛋白濃度試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 SD 大鼠PASMC 的原代培養(yǎng)、鑒定和分組

大鼠PASMC 的原代細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定方法參考羅燕等[11]的文獻(xiàn)。取5 周齡、體重150～180 g 的健康雄性SD 大鼠，通過頸椎脫臼方法處死，無菌環(huán)境下分離肺動脈中膜層，并剪碎成1 mm3左右的組織塊平鋪于培養(yǎng)瓶瓶底，采用組織塊貼壁法培養(yǎng)PASMC，培養(yǎng)基為20%FBS 的DMEM/F12 培養(yǎng)液，置于37℃、5%二氧化碳（CO2）的培養(yǎng)箱中。隨后傳代換用含10%FBS 的培養(yǎng)液。根據(jù)細(xì)胞學(xué)形態(tài)以及免疫熒光檢測血管平滑肌特異性細(xì)胞表型標(biāo)志基因α-肌動蛋白（α-SMA）來對第二代細(xì)胞進行鑒定。實驗用鑒定合格且生長較好的3～6 代細(xì)胞。實驗共分為三組：對照組（僅加基礎(chǔ)培養(yǎng)基）、模型組（給予PDGF-BB 20 mg/L）和干預(yù)組（給予PDGF-BB 20 mg/L 和CK 5 μmol/L），每個實驗獨立重復(fù)3 次即n=3。PDGF-BB 的劑量參考以往文獻(xiàn)以及前期預(yù)實驗[6,12]，CK 劑量見下文1.2.2 實驗結(jié)果，選擇無細(xì)胞毒性且抑制增殖效果最佳的5 μmol/L 濃度。

1.2.2 CCK-8 法檢測PASMC 增殖情況

細(xì)胞增殖情況采用CCK-8 法。將PASMC 密度調(diào)整為3×104/ml，接種于96 孔板中（每孔100 μl），每組設(shè)5 個復(fù)孔。待細(xì)胞密度至70%時，換成無血清DMEM/F12 培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。按照分組進行培養(yǎng)24 h 后，每孔加入10 μl 的CCK-8 溶液，于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h。用酶標(biāo)儀測量450 nm 處的吸光度（OD）值。

1.2.3 細(xì)胞劃痕實驗檢測PASMC 遷移情況

細(xì)胞遷移情況采用細(xì)胞劃痕實驗。預(yù)先準(zhǔn)備6 孔板，底部直線標(biāo)記。將PASMC 密度調(diào)整為5×104/ml，接種于6 孔板（每孔2 ml），每組設(shè)3 個復(fù)孔。待細(xì)胞生長至70%，用1 ml 槍頭于每孔底部進行劃痕，保證每孔劃痕寬度一致，用磷酸鹽緩沖液（PBS）輕柔沖刷劃痕處脫落細(xì)胞。按照分組進行培養(yǎng)，分別在0 h、12 h 和24 h 時倒置相差顯微鏡下觀察劃痕寬度、采集圖像，并計算遷移率：

1.2.4 ELISA 法檢測PASMC 培養(yǎng)液中COL Ⅰ和COLⅢ的含量

細(xì)胞培養(yǎng)液中膠原含量檢測采用ELISA 法。將PASMC 密度調(diào)整為3×104/ml，接種于96 孔板中（每孔100 μl），每組設(shè)3 個復(fù)孔。待細(xì)胞密度至70%時，按照分組進行培養(yǎng)24 h。收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液，于4℃下2 000 g 離心10 min，取上清液進行實驗。參照大鼠COL Ⅰ和COL Ⅲ α1 鏈ELISA 試劑盒操作說明進行。用酶標(biāo)儀測量450 nm 處的OD 值，所測得的OD 值間接代表培養(yǎng)液中膠原蛋白含量。

1.2.5 實時熒光定量PCR （RT-qPCR）檢測PASMC 中COL Ⅰ和COL Ⅲ基因轉(zhuǎn)錄水平

細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄水平采用RT-qPCR 法。將PASMC以密度5×104/ml 接種在6 孔板中（每孔2 ml）。待細(xì)胞生長至70%融合，按照實驗分組培養(yǎng)，每組設(shè)3個復(fù)孔。用TRIzol 法提取總RNA，用cDNA 合成試劑盒逆合成為cDNA。使用GoTaq?qPCR Master Mix熒光定量試劑盒和CFX96 TouchTM Detection System儀器（Bio-Rad，美國）檢測信使RNA的相對表達(dá)水平。自行設(shè)計引物序列見表1，擴增基因包括COL Ⅰ α1（NM_031004）、COL Ⅲ α1（NM_032085）和內(nèi)參基因GAPDH（NM_0177008）。反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃，3 min；循環(huán)40 次，變性95℃ 10 s，退火58℃ 30 s，延伸72℃ 30 s。結(jié)果用2-ΔΔCt法計算mRNA 的相對表達(dá)量。

表1 引物序列

1.2.6 蛋白免疫印跡（Western blot）檢測PASMC 中COL Ⅰ、COL Ⅲ和β-catenin 蛋白的相對表達(dá)

細(xì)胞蛋白合成水平采用western blot 法。將PASMC 以密度5×104/ml 接種在6 孔板中。待密度達(dá)70%，按照實驗分組培養(yǎng)。用RIPA 裂解液提取總蛋白。BCA 試劑盒測定蛋白濃度后，取40 μg的蛋白樣品進行凝膠電泳分離。電泳完成后，將蛋白轉(zhuǎn)膜至聚偏氟乙烯膜。用5%脫脂牛奶封閉1 h，于4℃過夜孵育相應(yīng)抗體：COL Ⅰ （1 ∶500）、COLⅢ （1 ∶500）、β-catenin （1 ∶2 000） 和GAPDH（1 ∶500）。洗膜后室溫孵育相應(yīng)熒光二抗，稀釋比例均為1 ∶10 000。孵育完畢后雙色紅外激光成像系統(tǒng)（odyeesy 公司，美國）進行檢測，Image J 軟件測定各條帶的灰度值。結(jié)果以各條帶灰度值與GAPDH 灰度值的比值表示。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

統(tǒng)計分析采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進行。符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用單因素方差分析，應(yīng)用SNK-q 檢驗來進行組間兩兩比較，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SD 大鼠PASMC 原代細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定（圖1A、1B）

培養(yǎng)至7 d 左右可見大量細(xì)胞從組織塊邊緣萌出呈放射狀。傳代后細(xì)胞形態(tài)呈長梭形（圖1A）。免疫熒光進行α-SMA 染色，可見陽性染色呈束狀，與細(xì)胞長軸平行（圖1B）。陽性染色細(xì)胞達(dá)95%以上，表明該細(xì)胞為PASMC。

圖1 傳代細(xì)胞鏡下觀察(1A，×100)及免疫熒光α-肌動蛋白染色鑒定(1B，×200)

2.2 三組PASMC 增殖情況

細(xì)胞增殖情況采用CCK-8 法進行檢測。OD值：與對照組比較，模型組顯著升高（1.288±0.192 vs. 0.776±0.201，P＜0.01），與 模 型 組 比 較，干預(yù)組（0.989±0.231）顯著降低，三組比較差異均有 統(tǒng) 計 學(xué) 意 義（F=550.262，P均＜0.01）。且 當(dāng)CK 以5 μmol/L 濃度單獨處理PASMC 時其OD 值（0.758±0.147），與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。提示PDGF-BB 能明顯誘導(dǎo)PASMC 的增殖，而CK 能以非細(xì)胞毒性濃度顯著抑制PDGFBB 的誘導(dǎo)作用。

2.3 三組PASMC 遷移情況（圖2、圖3）

圖2 細(xì)胞劃痕實驗觀察肺動脈平滑肌細(xì)胞遷移情況（n=3，×40）

圖3 三組PASMC12 h 和24 h 遷移率比較 (x±s, n=3)

細(xì)胞遷移情況采用細(xì)胞劃痕實驗檢測。與對照組比較，模型組PASMC 在12 h、24 h 的遷移率[（37% vs. 26%）、（68% vs. 51%）]均呈顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，干預(yù)組PASMC 在12 h、24 h 的遷移率降低[（16% vs.37%）、（48% vs. 68%）]，細(xì)胞遷移明顯受到抑制，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.01）。這說明，CK 能顯著抑制PDGF-BB 誘導(dǎo)的PASMC 的遷移。

2.4 三組PASMC 培養(yǎng)液中COL Ⅰ和COL Ⅲ的蛋白含量（圖4）

圖4 三組COL Ⅰ (4A)和COL Ⅲ (4B)蛋白含量比較 (x±s, n=3)

與對照組比較，模型組中COL Ⅰ蛋白含量升高約3.5 倍，COL Ⅲ蛋白含量升高2.5 倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，干預(yù)組中COL Ⅰ蛋白含量減少了45%，COL Ⅲ 減少了56%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。這表明CK 能抑制PASMC分泌COL Ⅰ和COL Ⅲ。

2.5 三組PASMC 中COL Ⅰ和COL Ⅲ的信使RNA 相對表達(dá)量（圖5）

圖5 三組COL Ⅰ和COL Ⅲ 信使RNA 相對表達(dá)水平比較 (x±s, n=3)

與對照組比較，模型組中COL Ⅰ和COL Ⅲ信使RNA 表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，干預(yù)組中COL Ⅰ和COL Ⅲ信使RNA 表達(dá)明顯降低（P均＜0.01），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.6 三組PASMC 中COL Ⅰ、COL Ⅲ和β-catenin蛋白相對表達(dá)量（圖6）

圖6 三組COL Ⅰ、COL Ⅲ和β-catenin 蛋白電泳圖（6A）及其相對表達(dá)水平（6B）比較 (x±s, n=3)

與對照組比較，模型組中COL Ⅰ、COL Ⅲ和β-catenin 蛋白相對表達(dá)量均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，干預(yù)組中COL Ⅰ、COL Ⅲ和β-catenin蛋白相對表達(dá)量均顯著降低（P均＜0.01）。

3 討論

CK 是從人參中提取經(jīng)過細(xì)菌代謝轉(zhuǎn)化而來的一種活性物質(zhì)[13]。在一系列體內(nèi)體外研究中發(fā)現(xiàn)，CK 可通過多種信號途徑對增殖性疾病有積極作用，尤其是對各種腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡以及遷移產(chǎn)生顯著的影響[8,14-15]。然而CK 是否存在對PASMC 增殖和遷移的作用尚不可知。

PAH 是一種以肺血管重構(gòu)為病理特征的難治性疾病。各種因素導(dǎo)致的肺血管重構(gòu)從而引起肺動脈進行性縮窄和壓力增高，以遠(yuǎn)端的肺小動脈為主。肺小動脈壁的所有血管層（包括內(nèi)膜、中膜和外膜）均會受到影響，但以中膜層PASMC 的廣泛增生和遷移為主，遠(yuǎn)端肺小動脈平滑肌細(xì)胞向外周以及正常無梗阻的肺細(xì)小動脈擴展是PAH 的標(biāo)志之一[16]。同時PASMC 從血管中膜向內(nèi)膜下遷移形成新生內(nèi)膜往往標(biāo)志著肺血管嚴(yán)重?fù)p失和血管重構(gòu)出現(xiàn)不可逆狀態(tài)[17]。因此尋找PASMC 的增殖和遷移的機制和抑制其作用的藥物對阻止和逆轉(zhuǎn)PAH 進展具有十分重要的意義。本研究從大鼠中分離出肺動脈中膜，采用貼壁法進行原代培養(yǎng)，經(jīng)α-SMA 免疫熒光鑒定為PASMC，因此用于后續(xù)PASMC 相關(guān)的細(xì)胞實驗[18]。眾所周知，PDGF-BB 作為一種生長因子，在PAH 進程中促進PASMC 增殖和遷移發(fā)揮著不可或缺的重要作用[19]。因此，PDGF-BB 是干預(yù)PASMC 增殖和遷移重要靶標(biāo)之一。本研究中，根據(jù)以往文獻(xiàn)選擇PDGF-BB 以20 mg/L 的濃度作為誘導(dǎo)劑來誘導(dǎo)PASMC 的增殖和遷移[6,12]，與對照組比較，模型組的PASMC 增殖活性和遷移率均顯著提升，這提示本實驗成功誘導(dǎo)了PASMC 的增殖和遷移狀態(tài)。同時實驗發(fā)現(xiàn)濃度為5 μmol/L 的CK 來進行干預(yù)，與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，故后續(xù)實驗用5 μmol/L 的CK 來干預(yù)。干預(yù)組PASMC 的增殖能力與遷移能力明顯降低；與對照組比較，單獨用5 μmol/L 的CK 與PASMC 孵育增殖結(jié)果無差異。結(jié)果表明CK 具有抑制PDGF-BB 誘導(dǎo)PASMC 增殖和遷移的能力，而且這種作用是非細(xì)胞毒性的。

細(xì)胞外基質(zhì)沉積同樣是肺血管重構(gòu)的重要因素。細(xì)胞外基質(zhì)作為PASMC 的支持物和細(xì)胞間的連接物，在調(diào)節(jié)PASMC 生物學(xué)活性中具有重要作用，如果過度合成不僅會引起血管壁增厚還會刺激PASMC 增殖和遷移，進一步加重血管重構(gòu)[20]。細(xì)胞外基質(zhì)主要成分為COL Ⅰ和COL Ⅲ等，COL Ⅰ和COL Ⅲ與維持血管壁韌性和彈性有關(guān)，在維持血管壁完整性和和生理功能上起著重要作用[21]。然而COL Ⅰ和COL Ⅲ合成失控導(dǎo)致過度沉積則會造成血管重構(gòu)[22-23]。因此減少COL Ⅰ和COL Ⅲ的產(chǎn)生從而抑制膠原沉積同樣是防治PAH 的一個關(guān)鍵因素。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，20 mg/L 的PDGF-BB誘導(dǎo)24 h 后模型組中COL Ⅰ、COL Ⅲ 信使RNA 和蛋白合成，以及培養(yǎng)液中蛋白均顯著上升。這結(jié)果不僅表明本實驗成功誘導(dǎo)PASMC 外膠原沉積現(xiàn)象，同樣在細(xì)胞層面證實PDGF-BB 作為生長因子在膠原沉積中發(fā)揮了一定的作用[24]。通過以上結(jié)果可以推斷PDGF-BB 還通過參與促進細(xì)胞外基質(zhì)沉積來促進血管重構(gòu)。因此，通過干預(yù)PDGF-BB 信號通路來減少膠原沉積，對治療PAH 同樣具有潛在的價值。本研究表明，對比模型組，在5 μmol/L 的CK同時干預(yù)下干預(yù)組中COL Ⅰ、COL Ⅲ 信使RNA 和蛋白合成以及培養(yǎng)液中蛋白均明顯下降。這表明CK具有抑制PDGF-BB 誘導(dǎo)的細(xì)胞外膠原沉積的作用。

為進一步探討CK 在PDGF-BB 誘導(dǎo)下PASMC增殖、遷移以及膠原沉積中的作用機制，本實驗觀察了Wnt/β-catenin 信號通路在其中的作用。Wnt/β-catenin 信號通路是一條古老且進化保守的信號通路，在參與PASMC 增殖、遷移、分化等病理相關(guān)過程，在PAH 的病理進程中發(fā)揮重要調(diào)控作用[25]。并且研究發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin 信號通路也可通過促進平滑肌細(xì)胞中COL Ⅰ、COL Ⅲ合成和分泌中發(fā)揮著調(diào)控血管壁的作用[26]。β-catenin 是Wnt/β-catenin 信號通路的核心，當(dāng)通路激活時β-catenin 將上調(diào)并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核中發(fā)揮調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄作用[27]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，模型組中β-catenin 蛋白表達(dá)明顯升高。表明PDGF-BB 成功誘導(dǎo)該信號通路過表達(dá)。對比模型組，在CK 干預(yù)下干預(yù)組β-catenin 蛋白表達(dá)明顯下降。提示CK可能通過抑制Wnt/β-catenin 信號通路，來發(fā)揮抑制PDGF-BB 的誘導(dǎo)PASMC 增殖、遷移以及膠原沉積能力。

綜上所述，本研究揭示了CK 對PDGF-BB 誘導(dǎo)PASMC 增殖、遷移以及膠原沉積具有顯著的抑制作用，該作用可能是通過抑制Wnt/β-catenin 信號通路激活來發(fā)揮作用。并在細(xì)胞層面發(fā)現(xiàn)CK 具有改善膠原沉積的作用。但本研究局限于相關(guān)信號通路觀察較少，接下來還需進一步完善具體機制。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突