趙素月，張玲，鄭瑩，姚麗，王乾合，李迅,3，朱克祥,3

0 引言

胰腺癌是具有強侵襲性的惡性腫瘤[1]。胰腺癌患者臨床癥狀不易發(fā)現(xiàn)，轉移率高，死亡率高，患者五年生存期短，生活質(zhì)量差[2-3]。全球范圍內(nèi)，胰腺癌是男性和女性癌癥第七大死亡原因[4]。因此迫切希望尋找到與胰腺癌相關基因，此基因具有早期診斷胰腺癌以及未來作為胰腺癌治療的靶標等功能。為胰腺癌患者找到新的治療希望。S100蛋白家族是一個多基因的鈣結合家族，由25個成員組成，每個成員由一個單獨的基因編碼[5]。S100蛋白家族是一個低分子量的酸性鈣調(diào)節(jié)蛋白家族[6]。S100蛋白家族特征是存在兩個Ca2+調(diào)控的EF-hand型基序，c端是所有EF-hand蛋白的共同特征，另一個是n端S100家族特有。在c末端EF-hand區(qū)域之后是一段被稱為c末端延伸的氨基酸。在兩個EF-hand域之間的區(qū)域稱為鉸鏈。在不同的蛋白質(zhì)中，c端延伸和鉸鏈區(qū)域的可變性最大，因此它們決定了蛋白質(zhì)的特定生物學特性[7]。S100蛋白通過與靶蛋白相互作用，參與細胞生長、分化、運動、收縮、轉錄、信號轉導、蛋白磷酸化、細胞存活、細胞凋亡以及細胞周期調(diào)控等生物學過程[8]。S100蛋白與炎性反應、神經(jīng)退行性疾病、抑郁癥、唐氏綜合征、囊性纖維化和癌癥等許多疾病相關并參與其中[9]。S100A16是S100家族蛋白之一，從星形細胞瘤中分離出來，位于人類染色體1q21區(qū)域。S100A16在特定組織類型中廣泛表達，如脂肪組織和大腦[10]。S100A16還被發(fā)現(xiàn)與多種腫瘤密切相關。S100A16在膀胱癌、肺癌、胃癌和卵巢癌等多種癌癥中表達上調(diào)[11-14]。此外，S100A16的高表達與肺癌、前列腺癌和乳腺癌的不良預后顯著相關[15]。本研究通過免疫組織化學實驗探討S100A16在胰腺癌中的表達及其臨床意義。利用PPI預測等預測S100A16相互作用基因，揭示 S100A16與胰腺癌的相關性。

1 資料與方法

1.1 研究對象及數(shù)據(jù)收集

收集2015年6月—2019年12月于蘭州大學第一醫(yī)院普通外科確診為胰腺癌且已行胰腺癌根治術的65例患者的胰腺癌組織病理切片（其中包括胰腺癌及癌旁組織）。由我院病理科醫(yī)師采集標本及制作蠟塊，所有的腫瘤標本由病理科醫(yī)師確診為胰腺癌，且所取癌旁組織也經(jīng)證實為非腫瘤組織。納入的標準：（1）術后病理學診斷為胰腺導管腺癌；（2）手術達到R0切除的標準。排除標準：（1）術后病理學診斷為非胰腺導管腺癌的其他類型胰腺癌；（2）術前曾接受放療、化療等相關抗腫瘤治療。我們同時收集了所納入的65例胰腺導管腺癌患者相關臨床病理數(shù)據(jù)。納入內(nèi)容包括：性別、年齡、腫瘤的分化、TNM分期、血管侵犯、腫瘤部位、糖尿病病史、術前血清CA199水平、中位生存期。本研究經(jīng)蘭州大學第一醫(yī)院倫理委員會批準，納入研究患者均已知情同意。

1.2 實驗試劑

兔抗人S100A16單克隆抗體，購自美國SAB公司，免疫組織化學實驗工作滴度最終適合濃度為1:100；UltraSensitive TM S-P超敏試劑盒，DAB 顯色劑盒均從福州邁新生物技術開發(fā)有限公司購得；二甲苯試劑、無水酒精試劑、不同濃度梯度配置的乙醇、蘇木精染液，實驗于蘭州大學第一醫(yī)院東崗病理科完成。

1.3 S100A16的免疫組織化學染色及判定

制作好的組織蠟塊進行切片，二甲苯脫蠟，檸檬酸抗原修復，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，動物非免疫血清，一抗孵育：S100A16抗體使用一抗稀釋液稀釋至1:400，在2組玻片上分別滴加S100A16抗體和PBS（陰性對照），滴加生物素標記的IgG聚合物，滴加鏈霉素抗生素蛋白-過氧化物酶，最后顯色和蘇木精對比染色。由兩位病理科老師單獨進行閱片，閱片采用雙盲法。免疫組織化學染色結果判斷方法：陽性結果由染色指數(shù)所決定，染色指數(shù)SI=染色強度×染色范圍。染色強度的判斷：無色為0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分；細胞的染色范圍判定：陽性細胞數(shù)占所有細胞總數(shù)的百分比，1%～25%為1分，＞25%～50%為2分，＞50%則為3分[16]。

1.4 隨訪

患者治療出院后采用電話隨訪方式進行隨訪，隨訪時間由2015年6月截至2021年12月，出院后1月、3月、6月、12月，以后每半年隨訪一次。隨訪率為100%。

1.5 生物信息學分析方法

通過生物信息學方法，使用GeneMANIA數(shù)據(jù)庫對S100A16基因進行單基因預測分析，分析與S100A16相互作用蛋白。分子相互作用網(wǎng)絡圖展示了與目的基因有直接相互作用的所有分子之間的相互作用關系網(wǎng)絡。使用Cytoscape的MCODE插件對S100A16蛋白相互作用網(wǎng)絡進行關鍵子網(wǎng)絡分析，得到與S100A16具有重要作用的蛋白。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS26.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。用χ2檢驗比較S100A16蛋白的表達及與臨床病理參數(shù)間的相關性。用Kaplan-Meier生存分析計算S100A16不同表達情況下的生存率，并繪制生存曲線。然后通過Log rank檢驗法驗證S100A16的表達與預后的相關性。運用Cox比例風險模型進行預后的單因素及多因素分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 S100A16在胰腺癌與癌旁組織中的表達

免疫組織化學結果表明S100A16主要在胰腺癌細胞膜中呈陽性表達，并且胞質(zhì)同時表達，胰腺癌組織中的S100A16陽性表達率明顯高于相應癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=10.901,P=0.001），見表1、圖1。

表1 胰腺癌與相應癌旁組織中S100A16的表達Table 1 Expression of S100A16 in pancreatic cancer and corresponding adjacent tissues

圖1 S100A16在胰腺癌(A,×400)和癌旁組織(B,×400)中的免疫組織化學結果Figure 1 Immunohistochemical results of S100A16 expression in pancreatic cancer(A,×400) and adjacent tissues(B,×400)

2.2 S100A16的表達與胰腺癌患者臨床病理參數(shù)之間的相關性

S100A16蛋白的表達與胰腺癌臨床病理參數(shù)中的血管浸潤和淋巴結轉移有關，而與其中的性別、發(fā)病年齡、腫瘤的發(fā)生部位、是否具有糖尿病史、術前CA199水平、腫瘤的分化程度、腫瘤大小和TNM分期無關，見表2。

表2 S100A16的表達與胰腺癌患者的臨床病理參數(shù)之間的相關性(n(%))Table 2 Correlation between S100A16 expression and clinicopathological parameters of pancreatic patients (n(%))

2.3 S100A16蛋白表達水平及臨床病理參數(shù)與胰腺癌患者總體生存時間的相關性

截至2021年12月，65例胰腺癌患者僅有5名患者生存。生存分析結果顯示S100A16表達水平是胰腺癌患者預后的獨立預后因素，并且S100A16蛋白表達陽性是S100A16蛋白表達陰性患者死亡風險的1.528倍，見表3。

表3 S100A16蛋白表達水平及臨床病理參數(shù)與胰腺癌患者總生存時間的單因素和多因素分析Table 3 Univariate and multivariate analyses of S100A16 protein expression level,clinicopathological parameters and overall survival time of patients with pancreatic cancer

2.4 S100A16表達水平與胰腺癌患者生存時間的相關性

Kaplan-Meier生存曲線、Log rank檢驗結果顯示S100A16蛋白陽性表達組的中位生存時間為8月，S100A16蛋白表達陰性的中位生存時間為19月。S100A16蛋白陽性表達預后較陰性表達差異有統(tǒng)計學意義（P=0.037），見圖2。

圖2 胰腺癌組織中S100A16蛋白陽性表達與陰性表達的Kaplan-Meier生存曲線Figure 2 Kaplan-Meier survival curves of pancreatic cancer patients with positive and negative expression of S100A16 protein

2.5 S100A16基因與其他相互作用基因預測

數(shù)據(jù)庫預測分析分子相互作用網(wǎng)絡圖，展示了與目的基因有直接相互作用的所有分子之間的相互作用關系網(wǎng)絡，見圖3。PPI預測S100A16相互作用蛋白包括S100A14、CPNE2、UBAC2、IDH3A、MDM2、STIM1、MSN、UCHL5、S100A13、SGSH、PERP、ESRRB、MPZL3、STMN1、PRDM1、PITX1、TMED10、TMEM9、IL36G、EPSTI1。使用Cytoscape的MCODE插件進行關鍵子網(wǎng)絡分析，其中S100A14、IL36G、PITX1、PERP在相互作用網(wǎng)絡中具有重要作用。

圖3 鈣結合蛋白S100A16 PPI分析結果和Cytoscape對PPI網(wǎng)絡進行關鍵子網(wǎng)絡分析圖（引自GeneMANIA數(shù)據(jù)庫）Figure 3 PPI analysis results of S100A16 and Cytoscape key sub-network analysis of PPI network (cited from GeneMANIA database)

3 討論

S100A16與腫瘤關系密切，在膀胱癌、肺癌、甲狀腺癌和卵巢癌等多種癌癥中表達上調(diào)。并且S100A16的高表達與肺癌、前列腺癌和乳腺癌的不良預后顯著相關[17-18]。本研究首先通過生物信息學方法得到S100A16基因在胰腺癌患者中高表達，高表達的患者具有較差預后。在癌癥大數(shù)據(jù)的支持下進行了免疫組織化學實驗。該觀點在隨后的免疫組織化學實驗中得到證明，S100A16表達水平是胰腺癌患者預后的獨立預后因素，并且S100A16蛋白表達陽性是S100A16蛋白表達陰性患者死亡風險的1.528倍。通過分析S100A16共表達基因與其相互作用蛋白，我們可以得到S100A16與S100A14密切相關。Sapkota等[19]研究S100A16和S100A14在口腔鱗狀細胞癌中的相互作用，發(fā)現(xiàn)S100A14的過表達和敲低會導致細胞系中S100A16蛋白的上調(diào)和下調(diào)。然而，在S100A14過表達時，S100A16 mRNA沒有上調(diào)，這表明對S100A16表達的調(diào)節(jié)不是由于增強的轉錄活性，而是由于轉錄后的調(diào)節(jié)。與之相反，S100A16過表達與S100A14蛋白表達無相關性，提示S100A14與S100A16之間存在單向調(diào)控。用蛋白合成抑制劑環(huán)己酰亞胺處理細胞時，細胞內(nèi)S100A16和S100A14蛋白降解呈時間依賴性[19]。此外，該研究還發(fā)現(xiàn)，S100A16和S100A14降解的調(diào)控不依賴于蛋白質(zhì)降解的經(jīng)典蛋白酶體和溶酶體途徑[19]。日本學者Tanaka研究S100A14、S100A16的表達與乳腺癌相關性，結果顯示兩個蛋白的共表達比單個蛋白表達更能預測乳腺癌的不良預后。并且S100A14和S100A16可通過與細胞骨架動力學的相互作用促進乳腺癌細胞的侵襲活性[20]。S100A16與S100A14兩者是S100家族成員，位于同一染色體上。因此S100A16與S100A14關系并不明確，需要進一步的研究。

我們使用生物信息學分析S100A16與胰腺癌的相關性，不僅獲得該基因特點，更為以后實驗提供參考和指導。本研究認為S100A16與胰腺癌關系密切，有望成為胰腺癌新的診斷、預后標志物和治療的靶點。