陸眉，楊曉娟，鄒潔雅，郭瑢，王鑫，張倩，鄧學鵬，陶建芬，聶建云，楊莊青

0 前言

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，發(fā)病率及死亡率高居女性惡性腫瘤首位，嚴重危害女性身心健康[1]。化療是乳腺癌全身治療的重要手段，新輔助化療（neoadjuvant chemotherapy,NAC）指術(shù)前化療，是臨床上常用的全身治療手段，與輔助化療相比，它在保證長期臨床療效的同時還能使無法手術(shù)的腫瘤變得可手術(shù)，并提高了保乳手術(shù)的比率[2]。更重要的是，NAC的帶瘤治療可視為一個研究平臺，在該平臺上可以描述傳統(tǒng)抗癌藥物的生物學作用，鑒定預后和尋找預測性生物標志物，并加快靶向藥物的開發(fā)[3]。

乳腺癌NAC療效最為直觀的病理指標是病理完全緩解[4]（pathological complete response,pCR）。pCR是指NAC后原發(fā)灶無浸潤性癌殘留以及區(qū)域淋巴結(jié)陰性，分期達到y(tǒng)pT0N0或ypT0/is/ypN0。無論分子亞型或化療方案是否相同，新輔助治療后達到pCR均意味著復發(fā)率約降低80%[5]，此外，達pCR患者可獲得更好的長期預后[6]。

乳腺癌的診治已經(jīng)進入了精準醫(yī)學時代，傳統(tǒng)的免疫組織化學已經(jīng)不能滿足乳腺癌個體化治療的預后判斷，需要進一步將基因表達特征納入臨床風險分層，以協(xié)助判斷腫瘤預后[7]。因此，我們選擇乳腺癌NAC患者作為研究對象，以NAC后是否達到術(shù)后pCR作為療效分組指標，通過比對乳腺癌NAC前后不同療效組間基因表達差異，識別乳腺癌化療耐藥相關(guān)基因，為精準治療提供科學數(shù)據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

經(jīng)昆明醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院倫理委員會批準（倫理審批號：KYLX202134）后，收集2018年9月—2019年3月昆明醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院（云南省腫瘤醫(yī)院）收治的60例乳腺癌患者化療前穿刺癌組織、化療后癌組織（NAC后達pCR的患者無術(shù)后癌組織）標本、臨床及病理特征等。入組標準：（1）簽署知情同意書，自愿加入研究；（2）初診腫瘤大于2 cm，接受NAC；（3）使用基于蒽環(huán)和紫杉類的化療方案，化療不少于6周期，每兩周期化療使用MRI進行療效評估；（4）HER2陽性患者需使用曲妥珠單抗靶向治療。排除因患者個人因素、中途因經(jīng)濟原因或身體原因、無法規(guī)范化行新輔助化療的患者。

1.2 實驗方法

1.2.1 標本采集方法 所收集標本均由昆明醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院病理科確診為乳腺癌，采用真空微創(chuàng)旋切針取標本約0.5 g并切碎放置于RNALatte液中，常溫放置10 min后，置于-80°C冰箱保存。

1.2.2 高通量RNA-seq樣本檢測 由北京諾禾致源生物有限公司完成，主要過程包括總RNA樣品檢測、文庫構(gòu)建及庫檢、合格樣本上機測序及原始數(shù)據(jù)處理[8-10]。其中，使用Illumina公司高通量測序平臺（HiSeq/MiSeq）進行測序。

1.2.3 分組標準 本研究根據(jù)NAC后是否達pCR分為化療敏感組及化療耐藥組，患者達術(shù)后pCR視為NAC敏感組，未達pCR（non-pCR）視為NAC不敏感和（或）耐藥組。病理完全緩解[4]（pCR）的定義為：NAC后病理診斷乳房及腋窩淋巴結(jié)均未找到癌細胞或僅殘存導管內(nèi)癌，即術(shù)后分期達到y(tǒng)pT0ypN0或ypT0/is/ypN0。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用卡方檢驗評估不同療效組間患者的基本特征。采用單因素、多因素二元Logistic回歸分析評價臨床病理特征。非參數(shù)U檢驗、W檢驗評估目標預測基因在NAC前后表達差異及不同療效組間表達的差異，建立單因素及多因素Logistic回歸模型，將模型用來制作列線圖并預測每例患者NAC后能達到non-pCR的可能性。采用隨機抽樣法進行內(nèi)部驗證，抽樣次數(shù)設為1 000，用Hosmer-Lemeshow擬合優(yōu)度檢驗評價校正曲線。檢驗方法均采用雙尾檢驗，統(tǒng)計軟件使用SPSS25.0和R軟件3.5.1版，檢驗水準設定P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 患者基線信息特征

兩組患者臨床特征基線齊，差異無統(tǒng)計學意義，具有可比性，見表1。

表1 新輔助化療pCR組與non-pCR組化療前基本特征Table 1 Basic information of pCR group and non-pCR group before NAC

2.2 60例乳腺癌患者NAC前后RNA-Seq表達變化

2.2.1 NAC后療效反應及non-pCR組NAC前后RNA-Seq表達變化接受NAC后，37例（61.7%）患者未獲得pCR（non-pCR），23例（38.3%）患者獲術(shù)后pCR，無化療后癌組織標本，所以僅收取NAC前腫瘤標本。在non-pCR組中，在排除非編碼RNA的基礎(chǔ)上，選取NAC前后上調(diào)或下調(diào)大于2倍、P＜0.05的差異基因，其中，化療后殘余癌組織基因表達上調(diào)953個，下調(diào)2 041個，見圖1。

圖1 新輔助化療前（左半部分）后（右半部分）基因表達差異Figure 1 Different gene expressions before (left half part) and after (right half part) neoadjuvant chemotherapy

2.2.2 non-pCR組與pCR組RNA-Seq表達差異 37例non-pCR與23例pCR相比，選取上調(diào)或下調(diào)大于兩倍、P＜0.05的差異基因，其中，nonpCR組較pCR組上調(diào)基因457個，下調(diào)基因1 361個，見圖2。

圖2 non-pCR（圖左半部分前37列）與pCR（右半部分后23列）患者部分基因高表達Figure 2 High expression of some genes in non-pCR group (the left anterior 37 columns) and pCR group (the right posterior 23 columns)

2.2.3 乳腺癌NAC潛在耐藥基因的篩選 進一步篩選NAC后表達上調(diào)大于兩倍同時在non-pCR患者中顯著高于pCR患者兩倍的差異基因，最后，共找到滿足條件的基因28個，見圖3。在這28個基因中，通過基因在乳腺癌中的表達量、基因功能、在腫瘤中的相關(guān)研究作為參考指標，最終選定AHNAK、CIDEA、ADIPOQ、AKAP12作為研究對象，它們可能與化療耐藥密切相關(guān)，具有預測患者NAC療效的潛力。

圖3 乳腺癌新輔助化療NAC潛在耐藥基因篩選流程Figure 3 Screening of potential drug-resistant genes in breast cancer for NAC

接受NAC后，在37例non-pCR組中，采用非參數(shù)威爾科克森W檢驗（Wilcoxon test）進行評估，結(jié)果顯示，目標預測基因AHNAK、CIDEA、ADIPOQ、AKAP12在NAC前后表達差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖4。

圖4 AHNAK、CIDEA、ADIPOQ、AKAP12在乳腺癌新輔助化療前后表達箱式圖Figure 4 Box-plot of AHNAK,CIDEA,ADIPOQ,AKAP12 expression before and after NAC in non-pCR group

2.2.4 目標預測因子在NAC前后及pCR組與nonpCR組的表達 接受NAC前，根據(jù)37例non-pCR組與23例pCR組中AHNAK、CIDEA、ADIPOQ、AKAP12的表達中位數(shù)、25%分位數(shù)、75%分位數(shù)繪制箱式圖，采用非參數(shù)曼-惠特尼U檢驗（Mann Whitney U test）評估兩組數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示，AHNAK、CIDEA、ADIPOQ、AKAP12基因表達在pCR組與non-pCR組間差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖5。

圖5 pCR組與non-pCR組中RAHNAK、CIDEA、ADIPOQ、AKAP12在乳腺癌新輔助化療前表達箱式圖Figure 5 Box-plot of AHNAK,CIDEA,ADIPOQ and AKAP12 expression before NAC in pCR and non-pCR group

2.3 目標預測因子與NAC后是否達pCR的Logistic關(guān)系

所有臨床指標及表達差異顯著的基因均列入候選變量，通過單因素分析顯示，年齡、T分期、N分期、Ki-67、月經(jīng)狀況與乳腺癌患者接受NAC后是否達到non-pCR無關(guān)，而AHNAK、CIDEA、ADIPOQ、AKAP12高表達增加了患者無法達到pCR（non-pCR）的可能性，預測基因的表達差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。將單因素分析中有差異的指標AHNAK、CIDEA、ADIPOQ、AKAP12采用進入法納入多因素模型分析，4個因素均納入時各因子OR均＞1（P＜0.05），見表2。因此，AHNAK、CIDEA、ADIPOQ、AKAP12的表達量增高可能是乳腺癌患者NAC療效不佳（nonpCR）的危險因素。

表2 乳腺癌新輔助化療療效單因素及多因素分析 (N=60)Table 2 Univariate and multivariate logistic regression analyses for NAC efficacy (N=60)

2.4 構(gòu)建乳腺癌NAC療效預測模型并驗證

2.4.1 療效預測模型列線圖繪制 將患者AHNAK、CIDEA、ADIPOQ、AKAP12納入療效預測模型，采用R軟件繪制列線圖，AHNAK、CIDEA、ADIPOQ、AKAP12均為連續(xù)變量（由于各基因表達量較大，故以10為1個單位），見圖6。

圖6 基于AHNAK、CIDEA、ADIPOQ、AKAP12表達構(gòu)建的乳腺癌NAC療效預測模型列線圖Figure 6 Nomogram for efficacy prediction model of NAC on breast cancer based on expression of AHNAK,CIDEA,ADIPOQ and AKAP12

2.4.2 模型預測能力評價 從模型區(qū)分度和校正情況進行模型預測能力評價，首先計算模型的預測值，根據(jù)預測值計算AUC為0.8249（95%CI:0.7227～0.9271），見圖7A。隨后采用bootstrap內(nèi)部驗證，將抽樣次數(shù)設為1 000次，校正后的AUC為0.7761，見圖7B，擬合優(yōu)度檢驗（Hosmer-Lemeshow）P=0.4945，說明模型預測概率和實際概率之間差異無統(tǒng)計學意義?？梢姡瑢HNAK、CIDEA、ADIPOQ、AKAP12這4個基因納入乳腺癌NAC療效預測模型，具有良好預測價值。

圖7 乳腺癌新輔助化療預測模型AUC(A)及校正曲線(B)Figure 7 AUC(A) and calibration curves(B) of the prediction model of NAC on breast cancer

3 討論

化療耐藥是乳腺癌治療失敗的最主要原因，臨床上僅30%～50%患者接受NAC后能獲得pCR。相較于non-pCR的患者，NAC后達到pCR的患者可獲得更好的長期預后[5-6]?；熌退幍漠a(chǎn)生與基因表達存在密切而復雜的關(guān)系，乳腺癌固有的異質(zhì)性使耐藥與基因表達關(guān)系更為復雜。一些原本就更傾向發(fā)生耐藥的亞細胞群，在治療選擇壓力下，擴增或出現(xiàn)進化，最后表現(xiàn)出對治療的抵抗[11]。腫瘤異質(zhì)性意味著乳腺癌耐藥基因的表達存在差異，對化療的敏感度也存在差異，細化乳腺癌分子分型，針對各種類型進行個性化治療是極其必要的[12]。

高通量轉(zhuǎn)錄組測序（RNA sequencing,RNASeq）能夠在單核苷酸水平上對任意物種的所有轉(zhuǎn)錄活動進行檢測，除量化基因的表達外[13]，還可檢測到新的轉(zhuǎn)錄本、識別選擇性剪接基因位點、檢測腫瘤異質(zhì)性[14]、鑒定耐藥標志物[15-16]等，通過這些新的生物信息學方法，學者們發(fā)現(xiàn)在乳腺癌NAC前，耐藥基因已存在，化療的干預可使耐藥基因選擇性進化，從而出現(xiàn)耐藥表型[17-20]。因此，對乳腺癌NAC前后標本進行檢測，可識別出與化療療效相關(guān)的基因。

通過全基因轉(zhuǎn)錄組測序我們定位到4個可能導致乳腺癌一線NAC藥物（蒽環(huán)和紫杉類）耐藥的潛在相關(guān)基因。AHNAK是一種蛋白質(zhì)編碼基因，編碼AHNAK核蛋白。在腫瘤耐藥的相關(guān)研究中，Davis等首次報道在乳腺癌細胞系以及荷瘤小鼠模型中AHNAK表達下調(diào)抑制了多柔比星誘導的半胱天冬酶蛋白7的表達和細胞周期停滯，而其過表達則相反[21]。AHNAK作為一種巨型支架蛋白（約700 kDa）[22]，是乳腺癌細胞遷移的關(guān)鍵蛋白，并且可通過腫瘤微環(huán)境中囊泡通訊促進癌癥進展，同時，還有研究報道AHNAK的過表達可使乳腺癌細胞系出現(xiàn)多柔比星抗藥性。從本研究結(jié)果來看，AHNAK的高表達提示了乳腺癌新輔助化療耐藥，AHNAK是潛在的耐藥基因，這個結(jié)論與既往學者報道基本相符，但本研究只揭示了AHNAK的高表達使乳腺癌NAC出現(xiàn)耐藥，具體機制需進一步驗證。

AKAP12基因編碼A激酶錨蛋白（The A-kinase anchor proteins），該蛋白是與細胞生長相關(guān)的蛋白質(zhì)，在信號轉(zhuǎn)導中用作支架蛋白。在腫瘤耐藥研究中，奧西替尼是EGFR突變肺腺癌的靶向藥物，而ESR1-AKAP12發(fā)生融合可使EGFR突變肺腺癌對奧西替尼產(chǎn)生耐藥[23]。另外，AKAP12顯著誘導前列腺癌細胞對多西紫杉醇的化學耐藥性[24]。本研究鑒定出AKAP12基因的高表達與乳腺癌NAC耐藥相關(guān)，是乳腺癌NAC是否獲得pCR的獨立危險因素，研究入組患者使用蒽環(huán)類藥物序貫紫杉類藥物的化療方案，而既往研究提示AKAP12與癌癥紫杉類藥物耐藥相關(guān)。臨床上更換化療藥物時再次穿刺取材格外困難，因此我們無法區(qū)分出AKAP12的過表達是與乳腺癌紫杉類化療耐藥相關(guān)或是與蒽環(huán)類及紫杉類同時相關(guān)，需繼續(xù)設計基礎(chǔ)實驗深入研究。

而CIDEA（cell-death-inducing DNA fragment factor 45-like effector A）和脂聯(lián)素（Adiponectin,ADIPOQ）均是脂肪代謝、糖代謝的關(guān)鍵因子，與代謝性疾病密切相關(guān)[25]，有研究表明二者在乳腺癌組織及脂肪組織均高表達，CIDEA和ADIPOQ的過表達可促進癌細胞系凋亡，可能對癌細胞的生長具有負性調(diào)節(jié)作用，是惡性腫瘤預后良好的指標[26]。但有學者報道CIDEA在脂肪細胞與乳腺癌細胞之間存在信號交互作用，調(diào)節(jié)乳腺上皮細胞行為，從而出現(xiàn)腫瘤進展[27]。此外，也有研究提示Adipoq-AdipoqR1信號軸可預測轉(zhuǎn)移性腎細胞癌對酪氨酸激酶抑制劑的治療反應，是潛在的治療靶點[28]。然而目前CIDEA和ADIPOQ的表達與乳腺癌患者化療療效的關(guān)系或機制研究尚未見報道，需進一步實驗加以驗證。

乳腺癌精準治療已走在其他癌癥的前列，目前國際上認可檢測BRCA1/2的突變來預測乳腺癌發(fā)生風險，用21基因檢測、70基因檢測評估復發(fā)風險[29]，盡管最新的報道提示70基因檢測也可用來預測乳腺癌患者NAC療效，但是，該方面的臨床資料較為匱乏，尚處于探索階段。BluePrint是基于I-SPY2研究的一種根據(jù)蛋白功能對乳腺癌進行分子分型的80基因檢測方法，利用BluePrint方法對MammaPrint風險評估為高風險的乳腺癌患者重新進行分子分型，協(xié)助新輔助化療的選擇，提高了乳腺癌新輔助化療pCR率[30]。I-SPY2研究通過對乳腺癌NAC前后癌組織測序數(shù)據(jù)進一步分析隨訪得出結(jié)果，而BluePrint則是基于I-SPY2研究篩選出可能與乳腺癌NAC療效密切相關(guān)的基因，構(gòu)建了具有預測乳腺癌NAC療效的、相對成熟的基因模型，但BluePrint數(shù)據(jù)主要來源于歐美人群，符合亞裔人群的數(shù)據(jù)模型有待進一步開發(fā)。我們的研究在有限范圍內(nèi)提供了小樣本的數(shù)據(jù)，可為今后亞裔人群乳腺癌NAC療效預測模型的構(gòu)建提供數(shù)據(jù)支持。

本研究結(jié)果提示，AHNAK、AKAP12、CIDEA和ADIPOQ的高表達降低了患者獲得pCR的概率，是乳腺癌NAC療效欠佳的危險因素；將AHNAK、AKAP12、CIDEA和ADIPOQ作為因子構(gòu)建的化療療效預測模型，有望成為挑選適合NAC乳腺癌患者人群的新方法。但本研究樣本量有限，具有一定局限性，后續(xù)將進一步采集臨床樣本，通過免疫組織化學、Western blot等方法從蛋白層面去驗證這幾個基因在臨床實踐中的可靠性。