侯巖君，田進(jìn)海，王立斌，何進(jìn)喜

0 引言

肺癌已經(jīng)是發(fā)達(dá)國(guó)家和發(fā)展中國(guó)家男性癌癥死亡的主要原因[1]，中國(guó)腫瘤流行病現(xiàn)狀顯示，中國(guó)肺癌男性發(fā)病率居首位，女性發(fā)病率居第二位，但是中國(guó)肺癌在男性及女性的死亡率中均居首位[2]，肺癌分為非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）和小細(xì)胞肺癌（SCLC），非小細(xì)胞肺癌主要分為：腺癌、鱗癌和大細(xì)胞肺癌[3]。非小細(xì)胞肺癌較小細(xì)胞肺癌發(fā)展和轉(zhuǎn)移慢，受到現(xiàn)有的檢查方式，體檢意識(shí)，醫(yī)療資源分配等相關(guān)因素的影響，大部分患者診斷肺癌時(shí)已為晚期，5年生存率不足20%[4]，晚期診斷的主要原因是患者癥狀出現(xiàn)晚，不易早期發(fā)現(xiàn)，所以發(fā)現(xiàn)新的可以早期診斷肺癌的標(biāo)志物迫在眉睫。

環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）在最初發(fā)現(xiàn)時(shí)被認(rèn)為是剪接錯(cuò)誤的產(chǎn)物[5]，隨著科技的發(fā)展高通量RNA測(cè)序的普及，發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RNA在真核細(xì)胞中豐富且穩(wěn)定[6]。它是一類新興的非編碼RNA分子，與傳統(tǒng)的線性RNA不同，circRNA的分子結(jié)構(gòu)呈封閉環(huán)形，不易被核酸內(nèi)切酶降解[7]，并且具有疾病和組織特異性。越來(lái)越多的研究顯示，circRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演了重要的角色[8-9]。有報(bào)道已經(jīng)表明circRNA參與了很多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移等過(guò)程[10-13]，結(jié)合circRNA的這些特點(diǎn)，其具備可以成為疾病診斷標(biāo)志物的潛力。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

收集2018年4月—2019年8月寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院普胸外科手術(shù)的56對(duì)肺癌組織和與其配對(duì)的癌旁組織標(biāo)本，其中4對(duì)用于芯片篩選。排除標(biāo)準(zhǔn)為：（1）合并其他腫瘤的患者；（2）術(shù)前有放化療病史；（3）臨床信息不完善。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）有明確肺癌的病理診斷；（2）既往沒(méi)有癌癥病史；（3）沒(méi)有艾滋/艾滋病病毒感染；（4）患者術(shù)前均無(wú)放療或化療史。本研究獲寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者或其家屬均簽署知情同意書(shū)。

1.2 樣本及臨床信息采集

收集肺癌組織和離腫瘤邊緣＞5 cm處癌旁組織，立即放入液氮內(nèi)，之后取出整理放于-80℃冰箱長(zhǎng)期保存，最終病理診斷由病理科2名主任醫(yī)師確診。其中Ⅰ期28例，Ⅱ期7例，Ⅲ期11例，Ⅳ期6例，其中Ⅰ期和Ⅱ期為早期肺癌，Ⅲ期和Ⅳ期為中晚期肺癌。收集所有患者信息，包括：（1）基本信息：患者年齡、性別、電話、登記號(hào)、住院號(hào)、患者手術(shù)時(shí)間、吸煙、飲酒等；（2）肺癌診斷和分型；（3）肺癌患者的臨床特征：腫瘤大小、是否轉(zhuǎn)移、腫瘤TNM分期等臨床指標(biāo)；（4）血清檢驗(yàn)結(jié)果：血常規(guī)、腫瘤標(biāo)志物指標(biāo)（CA125、CA199、CEA）等。

1.3 circRNA芯片分析

使用Arraystar Human circRNA Array（V2.0）（北京博奧生物有限公司，中國(guó)）和GeneSpring 13.0（Agilent）軟件對(duì)4對(duì)肺癌患者的肺癌和癌旁組織樣品進(jìn)行芯片篩選。對(duì)RNA進(jìn)行消化、擴(kuò)增及標(biāo)記后，通過(guò)人circRNA表達(dá)譜芯片（Human circRNA array version 2.0，北京博奧生物有限公司，中國(guó)）檢測(cè)樣品中circRNA表達(dá)情況，該芯片覆蓋162351條已知circRNA的探針。檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行初步過(guò)濾和質(zhì)控去除不達(dá)標(biāo)部分，剩余數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選，篩選條件為：差異倍數(shù)（fold change,FC）≥5,P＜0.01，熒光信號(hào)值≥100。使用Feature Extraction（CapitalBio）軟件提取芯片數(shù)據(jù)，GeneSpring V13.0軟件（Agilent）分析差異倍數(shù)、熒光信號(hào)值和顯著性，Cluster3.0軟件進(jìn)行差異聚類分析。

1.4 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

首先從組織中提取總RNA，應(yīng)用OMEGA的E.Z.N.A.Total RNA Kit Ⅰ試劑盒按照說(shuō)明進(jìn)行組織RNA的提取，提取后使用分光光度計(jì)Nano-Drop2000（Thermo Fisher Scientific）測(cè)定RNA的純度和濃度，OD260/280的比值約為1.9～2.0，然后通過(guò)GoScript反轉(zhuǎn)錄（RT）系統(tǒng)（Promega Corporation，F(xiàn)itchburg，WI，USA）將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。反轉(zhuǎn)錄體系為：1 μl總RNA（約500 ng），1 μl 隨機(jī)引物，10 μl ddH2O，2 μl dNTP，4 μl反轉(zhuǎn)錄緩沖液，1 μl RNA酶抑制劑，1 μl反轉(zhuǎn)錄酶，總體積20 μl；反應(yīng)條件為：25℃ 5 min；42℃ 60 min，70℃ 5 min。RNA及cDNA置于-80℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 qRT-PCR檢測(cè)circRNA hsa_circ_0044569在肺癌及癌旁組織的表達(dá)差異

使用反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)合成cDNA。qRT-PCR使用TB Green qPCR Mastermix（TaKaRa，日本），在LightCycler480實(shí)施PCR反應(yīng)。qRT-PCR反應(yīng)的總體積為20 μl，其中包括0.8 μl正向/反向引物，10 μl TB Green，6.4 μl二次蒸餾水和2 μl cDNA。循環(huán)程序95℃下持續(xù)10 s，然后再40個(gè)循環(huán)中95℃持續(xù)15 s，退火溫度30 s，β-actin在表達(dá)中起內(nèi)參對(duì)照作用，基因的相對(duì)表達(dá)量使用ΔCT法計(jì)算。所有樣品進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，見(jiàn)表1。

表1 qRT-PCR引物Table 1 qRT-PCR primers

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS23.0，GraphPad Prism7.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s），從肺癌組和癌旁對(duì)照組之間的分布差異計(jì)算每個(gè)circRNA的倍數(shù)變化，并通過(guò)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析顯著性，使用SPSS23.0構(gòu)建接收器工作特征曲線（ROC），當(dāng)AUC≤0.5時(shí)，circRNA沒(méi)有診斷價(jià)值，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺癌患者組織中的circRNA表達(dá)譜芯片分析

結(jié)果顯示：肺癌及癌旁組織間存在大量差異表達(dá)的circRNA，見(jiàn)圖1。通過(guò)芯片設(shè)定的差異篩選標(biāo)準(zhǔn)和生物信息學(xué)分析最終獲得19個(gè)差異表達(dá)的circRNA，其中11個(gè)表達(dá)上調(diào)，8個(gè)表達(dá)下調(diào)的circRNA作為候選分子進(jìn)行進(jìn)一步研究，經(jīng)臨床標(biāo)本驗(yàn)證最終選擇在肺癌中穩(wěn)定顯著上調(diào)的hsa_circ_0044569作為研究目標(biāo)，見(jiàn)圖2。

圖1 肺癌與癌旁組織之間差異表達(dá)的circRNA火山圖Figure 1 Volcano map of differentially-expressed circRNA between lung cancer and adjacent tissues

圖2 肺癌與癌旁組織之間差異表達(dá)的circRNA聚類圖Figure 2 Clustergram of differentially-expressed circRNA between lung cancer and adjacent tissues

2.2 hsa_circ_0044569的表達(dá)與肺癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系

結(jié)果顯示：hsa_circ_0044569表達(dá)與肺癌患者年齡、性別、腫瘤大小、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、CEA、CA12-5、CA19-9、飲酒、吸煙等差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但與肺癌的病理類型之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 hsa_circ_0044569的表達(dá)與肺癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系 (±s)Table 2 Correlation between expression of hsa_circ_0044569 and clinicopathological characteristics of lung cancer patients (±s)

表2 hsa_circ_0044569的表達(dá)與肺癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系 (±s)Table 2 Correlation between expression of hsa_circ_0044569 and clinicopathological characteristics of lung cancer patients (±s)

Notes:CEA:carcinoembryonic;CA19-9:carbohydrate antigen 19-9;CA12-5:carbohydrate antigen 12-5 antigen.

2.3 hsa_circ_0044569在肺癌組織中的表達(dá)

對(duì)5 2 對(duì)肺癌患者癌和對(duì)應(yīng)的癌旁組織中hsa_circ_0044569表達(dá)水平進(jìn)行分析結(jié)果顯示，hsa_circ_0044569在肺癌組織中的表達(dá)水平高于與其對(duì)應(yīng)的癌旁組織，見(jiàn)圖3A～B；肺癌組織46例表現(xiàn)出高表達(dá)（88.5%），6例表現(xiàn)為低表達(dá)（11.5%），見(jiàn)圖3C。

圖3 qRT-PCR驗(yàn)證在肺癌和癌旁組織中差異表達(dá)的hsa_circ_0044569 Figure 3 Differential hsa_circ_0044569 expression between lung cancer tissues and adjacent tissues verified by qRT-PCR

2.4 hsa_circ_0044569在肺癌中的診斷價(jià)值

應(yīng)用ROC曲線評(píng)價(jià)hsa_circ_0044569對(duì)肺癌的診斷價(jià)值，獲得hsa_circ_0044569在52對(duì)肺癌組織中的臨界值值為9.62，曲線下面積AUC值為0.758,P＜0.01，敏感度為0.712，特異性為0.712，見(jiàn)圖4。因此，hsa_circ_0044569具備早期肺癌診斷的潛能。

圖4 肺癌與配對(duì)癌旁組織中hsa_circ_0044569表達(dá)的ROC曲線Figure 4 ROC curves of hsa_circ_0044569 expression in lung cancer and adjacent tissues

2.5 與hsa_circ_0044569結(jié)合的miRNA預(yù)測(cè)分析

hsacirc_0044569 結(jié)合的miRNA預(yù)測(cè)結(jié)果，見(jiàn)圖5。本研究采用miRanda數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)與hsa_circ_0044569結(jié)合miRNA情況，hsa_circ_0044569共計(jì)有138個(gè)miRNA結(jié)合位點(diǎn)，根據(jù)結(jié)合位點(diǎn)類型（Site type）、結(jié)合位點(diǎn)總評(píng)分（Context++score）及miRNA家族的保守靶向概率（PCT）計(jì)算與hsa_circ_0044569結(jié)合的靶向miRNA排名靠前的前20個(gè)，供進(jìn)一步機(jī)制研究參考。

圖5 通過(guò)miRanda數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)到與hsa_circ_0044569結(jié)合的miRNA結(jié)合位點(diǎn)分布Figure 5 Distribution of miRNA binding sites that bind to hsa_circ_0044569 predicted by miRanda database

3 討論

環(huán)狀RNA的種類和形式多種多樣，可以起源于基因組序列的任何區(qū)域[14]，根據(jù)來(lái)源主要分為 3 類:內(nèi)含子序列形成的環(huán)狀RNA（circular intronic RNA,ciRNA），外顯子序列形成的環(huán)狀RNA（exonic circular RNA,ecircRNA）以及內(nèi)含子和外顯子序列共同形成的環(huán)狀RNA（exon-intron circular RNA,EIciRNA）外顯子環(huán)狀RNA可以由一個(gè)或者多個(gè)外顯子序列組成，主要存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，而內(nèi)含子環(huán)狀RNA主要分布在細(xì)胞核內(nèi)[15]。環(huán)狀RNA廣泛存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，與線性RNA相比，它們有著較高的表達(dá)水平。circRNA的兩個(gè)最重要的特性是它們高度保守且非常穩(wěn)定。與其他非編碼RNA相比，這些優(yōu)勢(shì)為circRNA提供了成為診斷癌癥疾病的理想生物標(biāo)志物的潛力[16]。隨著RNA測(cè)序和其他檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用，我們注意到，環(huán)狀RNA在許多腫瘤中都存在差異表達(dá)的現(xiàn)象，如膀胱癌[17]、結(jié)腸癌[18]、肝細(xì)胞癌[19]等腫瘤，由于環(huán)狀RNA比線性RNA更穩(wěn)定，并±s且環(huán)狀RNA由細(xì)胞囊泡儲(chǔ)存并通過(guò)胞吐方式釋放進(jìn)入血液，致使環(huán)狀RNA在臨床工作中易于獲取。以上特點(diǎn)為環(huán)狀RNA在腫瘤診斷方面提供了臨床優(yōu)勢(shì)。

本研究發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0044569在鑒別肺腺癌及肺鱗癌之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是與患者的年齡，性別、腫瘤大小、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、CEA、CA12-5、CA19-9、飲酒、吸煙等之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。目前為止，很多實(shí)驗(yàn)都驗(yàn)證了circRNA與肺癌患者臨床特點(diǎn)之間的關(guān)系。Cheng等[20]的研究表明，肺鱗癌中circTP63被上調(diào)，并且其上調(diào)與肺鱗癌患者中更大的腫瘤大小和更高的TNM分期相關(guān)。升高的circTP63在體外和體內(nèi)均可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖。Wang等[21]的研究顯示，環(huán)狀RNA circ_0020123通過(guò)海綿miR-590-5p調(diào)控THBS2促進(jìn)NSCLC細(xì)胞增殖和遷移，抑制細(xì)胞凋亡。Liu等[22]的研究顯示，基因微陣列檢測(cè)結(jié)果表明hsa_circ_0046264是最顯著的上調(diào)基因，qRT-PCR檢測(cè)進(jìn)一步證明hsa_circ_0046264在腫瘤患者組織中表達(dá)顯著上調(diào)。臨床分析表明，hsa_circ_0046264的表達(dá)水平與患者的年齡、腫瘤大小、腫瘤分期（TNM）和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)（P＜0.01）。

早期診斷是有效治療肺癌的重要前提，胸部CT可早期發(fā)現(xiàn)肺部病變，然而，有些病變通過(guò)CT很難區(qū)分良惡性；支氣管鏡檢查和經(jīng)皮肺穿刺可以獲取病理組織，但侵入性檢查通常有不良反應(yīng)甚至?xí)＜暗交颊呱?；痰液脫落?xì)胞學(xué)檢查和血清中與肺癌相關(guān)蛋白質(zhì)標(biāo)志物檢測(cè)的敏感度和特異性有限，需要新的標(biāo)志物來(lái)輔助肺癌的臨床診斷?；赾ircRNA的特點(diǎn)其不易被核酸外切酶降解，故它可以作為肺癌早期診斷的有效生物標(biāo)志物。

本研究結(jié)果顯示hsa_circ_0044569在肺癌中表達(dá)顯著上調(diào)，且穩(wěn)定性較好，ROC曲線分析其具備成為肺癌早期診斷標(biāo)志物的潛能。hsa_circ_0044569對(duì)于診斷肺癌具有重要意義，且對(duì)于肺腺癌和肺鱗癌的鑒別有一定的作用。因本實(shí)驗(yàn)納入的樣本數(shù)量有限，存在選樣偏倚的可能性，后期需要更多的臨床實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)一步的研究其可行性。