賈 睿，蔡 丹，葛思彤，任世達(dá)，劉景圣

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，小麥和玉米深加工國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130118）

食源性致病菌污染是影響食品安全和引發(fā)公共衛(wèi)生事件的潛在威脅因素，常見的致病菌包括大腸埃希菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和單核細(xì)胞增生李斯特菌等，這些致病菌具有較強(qiáng)的耐受干燥、酸、鹽、熱等環(huán)境因素的能力，導(dǎo)致其可以在食品生產(chǎn)、加工和貯藏過程中長(zhǎng)期生存。化學(xué)來源的抑菌劑是有效的防控方式，但其在抑制腐敗微生物和致病菌生長(zhǎng)的同時(shí)，可能存在安全隱患并可能使致病微生物產(chǎn)生耐藥性，從而引發(fā)了較多爭(zhēng)議[1]。研究發(fā)現(xiàn)，蒼山子中的槲皮素對(duì)金黃色葡萄球菌和溶血性鏈球菌具有較強(qiáng)的抑菌活性[2]；柑橘類水果中的柚皮素具有抑制鼠傷寒沙門氏菌的作用[3]；茶葉中的茶多酚可顯著抑制革蘭氏陽性菌生長(zhǎng)[4]。這些天然產(chǎn)物提取物除了表現(xiàn)出抑制致病菌活性外，還具有綠色、安全、高效等特點(diǎn)，往往采用單獨(dú)或與蛋白、多糖混合成膜噴灑、包埋或涂抹等方式應(yīng)用于食品的抑菌中。

糧食副產(chǎn)物中富含具有生物活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物，如酚類化合物。酚類化合物具有調(diào)節(jié)血糖、預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化、抗氧化和抗炎等多種生理活性，研究表明大麥提取物中的大麥多酚對(duì)金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌、大腸桿菌等均有抑制生長(zhǎng)作用[5-7]。紅豆（Vigna angularis）是一種一年生半纏繞草本植物，《本草綱目》中記載其有助于抗水腫、腹瀉和嘔吐等[8]。紅豆在現(xiàn)代糧食加工過程中常會(huì)產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物——紅豆皮，紅豆皮中富含三萜皂苷、酚類化合物、植物甾醇和色素等生物活性物質(zhì)，其中的酚類化合物被認(rèn)為是生物活性最高的代謝產(chǎn)物之一，主要包含兒茶素苷、槲皮素苷、楊梅素3-鼠李糖苷、花色苷和原花青素二聚體等[9-10]。目前國(guó)內(nèi)外研究多集中于紅豆皮成分以及抗氧化活性方面，對(duì)于紅豆皮多酚提取物的抑菌活性及抑菌機(jī)理鮮見報(bào)道。

綜上，本實(shí)驗(yàn)以紅豆皮為原料，采用超聲波輔助醇提法制備紅豆皮多酚提取物，分析其對(duì)李斯特菌、沙門氏菌兩種食源性致病菌的抑菌活性，并探究其抑菌機(jī)理，以期為糧食源抑菌劑的開發(fā)與應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅豆皮取自吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥和玉米深加工國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室；李斯特菌ATCC19119（ListeriainnocuaATCC19119）（G+）、沙門氏菌ATCC14028（SalmonellaATCC14028）（G－）均取自吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)。

膜電位熒光探針DiBAC4(3) 北京索萊寶科技有限公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、ATP檢測(cè)試劑盒、堿性磷酸酶檢測(cè)試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)有限公司。所有試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；液相色譜試劑均為色譜級(jí)。

1.2 儀器與設(shè)備

HZQ-F160全溫振蕩培養(yǎng)箱、DL-CL-ND超凈工作臺(tái)哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；Autoclave 4001136高壓滅菌鍋 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；FLUO star Omega全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀 德國(guó)BMG Labtech公司；Z36HK超高速冷凍離心 德國(guó)Hermle公司；FD-1B-50冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康儀器有限公司；HD-3紫外檢測(cè)器、BSZ-100自動(dòng)部分收集器、玻璃層析柱（1.8 cm×30 cm） 上海滬西分析儀器廠；GeminiSEM場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡 德國(guó)卡爾蔡司公司；1200型高效液相色譜儀 美國(guó)Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 紅豆皮多酚提取物的制備

根據(jù)Luo Jiaqiang等[11]的方法并略作修改制備紅豆皮多酚提取物。稱取紅豆皮粉末2.000 g，置于200 mL燒杯中，以料液比1∶30加入體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇溶液，攪拌均勻。然后在室溫條件下，360 W超聲處理30 min，樣液取出后立即離心20 min（4 000 r/min），取上清液，通過45 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮粗提物。利用AB-8大孔樹脂進(jìn)行純化（上樣液質(zhì)量濃度2.5 mg/mL、上樣液體積330 mL、流速1 mL/min、體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液洗脫），將純化液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮，冷凍干燥后得到粉末狀紅豆皮多酚提取物，－20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

采用Folin-Ciocalteu法測(cè)定紅豆皮多酚提取物的多酚含量，根據(jù)文獻(xiàn)[12]方法略作修改。繪制沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線：配制質(zhì)量濃度分別為0、4、8、12、16、20、24 μg/mL的沒食子酸溶液，吸取各質(zhì)量濃度溶液1 mL，加入Folin-Ciocalteu試劑2.5 mL以及質(zhì)量分?jǐn)?shù)15%的Na2CO3溶液2 mL于比色管中，加去離子水定容至10 mL，搖勻，在黑暗處?kù)o置2 h，然后在96 孔板酶標(biāo)儀中于765 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程：y=0.015 8x+0.046 6，R2=0.9988。精確吸取適量紅豆皮多酚提取物干粉配制的溶液50 μL，按上述方法處理并測(cè)定吸光度。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出溶液中多酚的質(zhì)量濃度，每組做3個(gè)平行。根據(jù)下式計(jì)算出紅豆皮提取物的多酚含量為（145.28±2.21）mg/g。

式中：ρ為紅豆皮多酚的質(zhì)量濃度/（mg/mL）；V為提取液體積/mL；N為稀釋倍數(shù)；m為紅豆皮提取物干粉的質(zhì)量/g。

1.3.2 高效液相色譜測(cè)定紅豆皮多酚組成

為了進(jìn)一步分析純化后紅豆皮多酚類物質(zhì)的組成成分，將純化后的紅豆皮多酚提取物溶于色譜級(jí)甲醇中，稀釋至1 mg/mL，通過0.45 μm有機(jī)濾膜過濾，并使用Zorbox SB-C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，3.5 μm），通過高效液相色譜儀對(duì)紅豆皮多酚提取物混合液的組成成分進(jìn)行分析。色譜參數(shù)：柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL；流動(dòng)相A：甲醇；流動(dòng)相B：體積分?jǐn)?shù)0.5%冰醋酸。洗脫條件：0～5 min，5% A；5～10 min，8% A；10～20 min，12% A；20～30 min，20% A；30～40 min，40% A；40～50 min，50% A；50～60 min，60% A；60～65 min，70% A；65～70 min，80% A。比較樣品色譜峰保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間，判定紅豆皮多酚提取物中單體酚的組成。

1.3.3 紅豆皮多酚提取物最小抑菌濃度的測(cè)定

參考Kanatt等[13]的二倍等度稀釋96 孔板法測(cè)定紅豆皮多酚提取物對(duì)李斯特菌ATCC19119和沙門氏菌ATCC14028兩種供試菌的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）。將兩種細(xì)菌分別接種于LB液體培養(yǎng)基，于37 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期（OD600nm=0.6）（培養(yǎng)條件后同），紅豆皮多酚提取物用二倍稀釋法通過LB液體培養(yǎng)基稀釋至不同質(zhì)量濃度（5 000、2 500、1 250、625、312、156 mg/mL），將50 μL對(duì)數(shù)期菌液與50 μL不同質(zhì)量濃度多酚提取物溶液于96 孔板內(nèi)混合均勻后，37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，通過酶標(biāo)儀測(cè)定菌液OD600nm，以沒有菌體生長(zhǎng)（未檢測(cè)到OD600nm）所對(duì)應(yīng)的多酚提取物終質(zhì)量濃度為MIC。以無菌水和10 μg/mL氨芐西林分別為陰性和陽性對(duì)照。

1.3.4 紅豆皮多酚提取物對(duì)食源性致病菌生長(zhǎng)曲線影響的測(cè)定

使用Taukoorah等[14]的方法，取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的兩種供試菌50 mL和不同質(zhì)量濃度的紅豆皮多酚提取物溶液，加入到100 mL新鮮LB培養(yǎng)基中，使紅豆皮多酚提取液的終質(zhì)量濃度分別為0（對(duì)照）、1 MIC、2 MIC。以終質(zhì)量濃度0.01 g/mL的氨芐西林作為陽性對(duì)照。置于37 ℃、180 r/min恒溫?fù)u床中培養(yǎng)，并從0 h開始，每小時(shí)取一次樣，測(cè)定OD600nm。以培養(yǎng)時(shí)間與OD600nm的關(guān)系繪制生長(zhǎng)曲線。

1.3.5 菌體細(xì)胞膜完整性的測(cè)定

將50 mL培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的兩種供試菌在4 ℃、5 000 r/min下離心5 min，收集菌體并用無菌生理鹽水洗滌3 次，離心后用生理鹽水重懸至107CFU/mL。將5 mL菌懸液與5 mL不同質(zhì)量濃度（2 MIC、4 MIC）多酚提取物溶液混合，并在37 ℃下孵育，以相同體積的生理鹽水作為陰性對(duì)照。分別培養(yǎng)1、2、3、4、5 h和6 h，離心（4 ℃、5 000 r/min、5 min）去除菌體，得到上清液，經(jīng)0.22 μm醋酸纖維素濾膜過濾。過膜后按照BCA試劑盒說明測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度。同時(shí)利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定上清液OD260nm，通過OD260nm來確定細(xì)胞內(nèi)核酸的泄漏情況[15-16]。

1.3.6 菌體細(xì)胞膜電位的測(cè)定

將兩種供試菌在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，取50 mL菌液離心（4 ℃、5 000×g、5 min）并將菌體沉淀用磷酸鹽緩沖液洗滌3～4 次，用磷酸鹽緩沖液調(diào)整菌液濃度至107CFU/mL。用二甲基亞砜將DiBAC4(3)溶解后加至黑色不透明96 孔板中，加入125 μL菌液和終濃度1 μmol/L的DiBAC4(3)熒光探針，在37 ℃培養(yǎng)箱中平衡30 min，之后加入125 μL紅豆皮多酚提取物溶液，使其終質(zhì)量濃度分別達(dá)到0（對(duì)照）、1 MIC、2 MIC。利用多功能酶標(biāo)儀在激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為492 nm和515 nm條件下測(cè)定相對(duì)熒光強(qiáng)度，以相對(duì)熒光強(qiáng)度表征細(xì)胞膜電位[17]。

1.3.7 菌體細(xì)胞內(nèi)ATP含量的測(cè)定

將兩種供試菌接種至LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，取50 mL菌液離心（4 ℃、5 000 r/min、5 min）收集菌體，并用無菌生理鹽水洗滌3 次，再用無菌生理鹽水重懸至107CFU/mL，取菌懸液1 mL加入1 mL紅豆皮多酚提取物溶液，使紅豆皮多酚提取物終質(zhì)量濃度分別為0（對(duì)照）、1 MIC、2 MIC，置于37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min。按照ATP檢測(cè)試劑盒說明書處理樣品，利用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定熒光相對(duì)發(fā)光值，以相對(duì)發(fā)光值表征菌體細(xì)胞內(nèi)ATP含量[18]。

1.3.8 菌體細(xì)胞外堿性磷酸酶活力的測(cè)定

將50 mL培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的兩種供試菌在4 ℃、5 000 r/min條件下離心5 min，收集菌體并用無菌生理鹽水洗滌3 次，再用無菌生理鹽水重懸至107CFU/mL。將5 mL菌懸液與5 mL不同質(zhì)量濃度的紅豆皮多酚提取物溶液混合，使其終質(zhì)量濃度分別為1 MIC、2 MIC，并在37 ℃下孵育0、3、6、9 h和12 h。將混合物以8 000 r/min離心10 min后，根據(jù)試劑盒說明測(cè)定堿性磷酸酶活力。

1.3.9 菌體形態(tài)的觀察

根據(jù)Chen Mingshun等[19]的方法加以改進(jìn)觀察菌體形態(tài)。將50 mL培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的兩種供試菌在4 ℃、5 000 r/min條件下離心5 min，收集菌體，用無菌生理鹽水洗滌3 次后，再用無菌生理鹽水重懸至107CFU/mL。向5 mL菌懸液中加入5 mL不同質(zhì)量濃度的紅豆皮多酚提取物溶液，使其終質(zhì)量濃度分別為0（對(duì)照）、1 MIC、2 MIC，培養(yǎng)12 h后4 ℃、8 000 r/min條件下離心，沉淀用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液洗滌，4 ℃、8 000 r/min離心并棄上清液，用體積分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛溶液4 ℃過夜固定。隨后用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液沖洗，依次用體積分?jǐn)?shù)20%、60%、80%、90%和100%乙醇進(jìn)行梯度脫水。脫水結(jié)束后，用乙醇-叔丁醇（1∶1，V/V）溶液置換20 min，最后用體積分?jǐn)?shù)100%叔丁醇置換兩次。置換后將樣品進(jìn)行干燥處理，干燥后的樣品進(jìn)行離子濺射儀噴鍍后，通過加速電壓為5 kV的場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡進(jìn)行微觀形貌觀察。

1.3.10 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析

采用Wang Chenjie等[20]的方法進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis， SDS-PAGE）。將50 mL培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的兩種供試菌在4 ℃、5 000 r/min條件下離心5 min，收集菌體，用無菌生理鹽水洗滌3 次后，再用無菌生理鹽水重懸至107CFU/mL。取5 mL菌懸液，加入5 mL相應(yīng)質(zhì)量濃度的紅豆皮多酚提取液，使其終質(zhì)量濃度1 MIC，以等體積無菌水和10 μg/mL氨芐西林為陰性和陽性對(duì)照，37 ℃恒溫培養(yǎng)0、2、4、6、8、10、12 h，在8 000 r/min下離心10 min，棄上清液，用無菌生理鹽水洗滌菌體兩次后重懸于無菌生理鹽水（107CFU/mL）中，取5 μL菌液加入等體積上樣緩沖液，在100 ℃水浴中加熱10 min。采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%的分離膠和質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的濃縮膠進(jìn)行電泳，利用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的考馬斯亮藍(lán)R250染色，凝膠脫色好后用凝膠成像儀進(jìn)行觀察并拍照。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

使用SPSS Statistics 24軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，利用Duncan’s多重比較進(jìn)行差異顯著性分析，以P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。使用Origin 2017軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅豆皮多酚組成分析結(jié)果

如表1所示，紅豆皮多酚中含量相對(duì)較高的多酚化合物是槲皮素與金絲桃苷。據(jù)報(bào)道，槲皮素是一種具有抗菌和抗氧化活性的黃酮類化合物[21-22]，同時(shí)在癌癥治療中具有促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡和抑制癌細(xì)胞增殖的作用[23-24]。金絲桃苷也具有多種藥用特性，如抗炎、抗病毒、抗氧化和抗腫瘤等[25]。蘆丁是一種黃酮類化合物，廣泛存在于蕓香葉、煙葉和橙皮等植物中[26]；山柰酚是一種黃酮醇類化合物，能夠有效抑制癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移[27]；表兒茶素是兒茶素類化合物，屬于黃烷醇化合物，與兒茶素互為同分異構(gòu)體，具有預(yù)防癌癥、止瀉、止血、抗真菌及以預(yù)防胃潰瘍等作用，同時(shí)表兒茶素可以通過抑制葡萄球菌生物膜的形成達(dá)到抗菌的效果[28-29]。此外，紅豆皮多酚還含有多種酚酸，包括沒食子酸、綠原酸、阿魏酸、對(duì)香豆酸和咖啡酸，這些酚酸具有如抗氧化、抗菌、抗炎等生物活性[30]。因此，從紅豆皮多酚組成分析結(jié)果可知，紅豆皮富含多酚類物質(zhì)，可作為一種天然抗氧化劑和抗菌劑的良好來源。

表1 紅豆皮多酚組分Table 1 Polyphenol composition of adzuki bean seed coat

2.2 紅豆皮多酚提取物對(duì)食源性致病菌的最小抑菌濃度

如表2所示，紅豆皮多酚提取物對(duì)李斯特菌ATCC19119和沙門氏菌ATCC14028的MIC分別為625 μg/mL和2 500 μg/mL?？梢钥闯觯t豆皮多酚提取物對(duì)革蘭氏陽性和陰性細(xì)菌的生長(zhǎng)均具有抑制作用。但是，其效果因微生物類型和紅豆皮多酚提取物濃度而異，可能主要與菌體細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的差異有關(guān)，革蘭氏陽性菌只有單層細(xì)胞壁，而革蘭氏陰性菌則具有外膜和獨(dú)特的胞質(zhì)間隙，因此，與革蘭氏陰性菌相比，多酚更容易破壞單層細(xì)胞壁，抑制菌體的核酸合成以及能量代謝等生物學(xué)功能[31]。

表2 紅豆皮多酚提取物對(duì)李斯特菌ATCC19119和沙門氏菌ATCC14028的MICTable 2 MICs of adzuki bean seed coat polyphenols against Listeria ATCC19119 and Salmonella ATCC14028

2.3 紅豆皮多酚提取物對(duì)食源性致病菌生長(zhǎng)曲線的影響

由圖1可知，與對(duì)照處理相比，1 MIC條件下兩種食源性致病菌的生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期均相對(duì)滯后，而2 MIC組OD600nm的增長(zhǎng)速率與1 MIC組OD600nm相比趨勢(shì)明顯降低，說明在2 MIC下，紅豆皮多酚提取物對(duì)供試菌的生長(zhǎng)能力有更強(qiáng)的抑制作用。陽性對(duì)照組完全抑制了菌體生長(zhǎng)，2 MIC組與其抑制效果接近。

圖1 紅豆皮多酚提取物對(duì)李斯特菌ATCC19119 和沙門氏菌ATCC14028生長(zhǎng)曲線的影響Fig. 1 Effects of adzuki bean seed coat polyphenols on the growth curves of Listeria ATCC19119 and Salmonella ATCC14028

2.4 紅豆皮多酚提取物對(duì)食源性致病菌細(xì)胞膜完整性的影響

抑菌物質(zhì)在破壞菌體細(xì)胞膜完整性的過程中，還增加了菌體細(xì)胞膜的滲透性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物流失[16]。Chen Lin等[32]發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞膜受損的李斯特菌能引起細(xì)胞內(nèi)組分大量流失。從圖2可以看出，在不同質(zhì)量濃度紅豆皮多酚提取物的作用下，李斯特菌ATCC19119和沙門氏菌ATCC14028細(xì)菌上清液中的蛋白質(zhì)和核酸水平隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸提升。結(jié)果表明，在不同質(zhì)量濃度的紅豆皮多酚提取物作用下，李斯特菌ATCC19119和沙門氏菌ATCC14028的細(xì)胞壁膜通透性增加，細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和核酸存在不同程度的泄漏，且添加高質(zhì)量濃度紅豆皮多酚提取物組的細(xì)菌核酸和蛋白質(zhì)泄漏程度更劇烈。

圖2 紅豆皮多酚提取物對(duì)李斯特菌ATCC19119和沙門氏菌ATCC14028胞外蛋白質(zhì)和核酸水平的影響Fig. 2 Effects of adzuki bean seed coat polyphenols on extracellular protein and nucleic acid contents of Listeria ATCC19119 and Salmonella ATCC14028

2.5 紅豆皮多酚提取物對(duì)食源性致病菌細(xì)胞膜電位的影響

靜息膜電位是反映細(xì)胞存活情況最重要的參數(shù)之一。DiBAC4(3)是一種測(cè)定膜極化變化的熒光膜電位染料，其本身無熒光，當(dāng)進(jìn)入細(xì)胞與細(xì)胞質(zhì)中的蛋白結(jié)合后才發(fā)出熒光，熒光強(qiáng)度增加，即膜電位增加，表明細(xì)胞發(fā)生去極化[33-34]。圖3為不同質(zhì)量濃度的紅豆皮多酚提取物對(duì)李斯特菌ATCC19119和沙門氏菌ATCC14028的細(xì)胞膜電位的影響。經(jīng)1 MIC和2 MIC紅豆皮多酚提取物處理后，李斯特菌ATCC19119的相對(duì)熒光強(qiáng)度與對(duì)照組相比分別增加了3.76 倍和6.91 倍，沙門氏菌ATCC1402的相對(duì)熒光強(qiáng)度與對(duì)照組相比分別增加了3.58 倍和5.59 倍，即細(xì)胞發(fā)生去極化。

圖3 紅豆皮多酚提取物對(duì)李斯特菌 ATCC19119（A） 和沙門氏菌ATCC14028（B）細(xì)胞膜電位的影響Fig. 3 Effects of adzuki bean seed coat polyphenols on membrane potential in Listeria ATCC19119 and Salmonella ATCC14028

2.6 紅豆皮多酚提取物對(duì)食源性致病菌細(xì)胞內(nèi)ATP含量的影響

當(dāng)細(xì)胞受損或死亡時(shí)，菌體細(xì)胞中的ATP含量會(huì)迅速下降，故ATP含量可以反映細(xì)胞的存活狀態(tài)[20]。ATP含量的降低可能是細(xì)胞質(zhì)ATP釋放量增加和質(zhì)子泵ATP酶的水解速率上升所致[35]。在正常條件下，菌體細(xì)胞中ATP的含量相對(duì)穩(wěn)定。經(jīng)抑菌劑處理后，菌體細(xì)胞膜受損，導(dǎo)致細(xì)胞膜變得不穩(wěn)定，細(xì)胞內(nèi)ATP合成速率降低，細(xì)胞內(nèi)ATP水平降低。圖4為紅豆皮多酚提取物分別對(duì)李斯特菌ATCC19119和沙門氏菌ATCC14028細(xì)胞內(nèi)ATP含量的影響。與對(duì)照組相比，經(jīng)1 MIC和2 MIC紅豆皮多酚提取物處理的李斯特菌ATCC19119細(xì)胞內(nèi)ATP的相對(duì)發(fā)光值分別降低了74.68%、89.88%；經(jīng)1 MIC和2 MIC紅豆皮多酚提取物處理的沙門氏菌ATCC14028細(xì)胞內(nèi)ATP的相對(duì)發(fā)光值分別降低了69.56%、87.12%。與對(duì)照組相比，紅豆皮多酚提取物處理后菌體細(xì)胞中的ATP含量顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），并且隨著提取物質(zhì)量濃度的增加，菌體細(xì)胞中的ATP含量降低更明顯，說明紅豆皮多酚能夠影響菌體的生命活動(dòng)，促進(jìn)或?qū)е戮w死亡。

圖4 紅豆皮多酚提取物對(duì)李斯特菌ATCC19119（A）和沙門氏菌ATCC14028（B）胞內(nèi)ATP含量的影響Fig. 4 Effects of adzuki bean seed coat polyphenols on intracellular ATP contents of Listeria ATCC19119 (A) and Salmonella ATCC14028 (B)

2.7 紅豆皮多酚提取物對(duì)食源性致病菌菌體堿性磷酸酶活力的影響

堿性磷酸酶存在于細(xì)菌的細(xì)胞膜和細(xì)胞壁之間，因此未經(jīng)處理的菌懸液中應(yīng)無堿性磷酸酶活性。因此，可通過檢測(cè)細(xì)菌懸液中堿性磷酸酶的泄漏情況來反映細(xì)胞壁的通透性[36-37]。如圖5所示，與對(duì)照相比，經(jīng)紅豆皮多酚提取物處理后李斯特菌ATCC19119和沙門氏菌ATCC14028細(xì)胞堿性磷酸酶活力明顯增加，且堿性磷酸酶活力隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)或者紅豆皮多酚提取物質(zhì)量濃度的增加而升高，表明紅豆皮多酚提取物會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞壁通透性增加，破壞菌體細(xì)胞壁完整性。

圖5 紅豆皮多酚提取物對(duì)李斯特菌ATCC19119（A）和沙門氏菌ATCC14028（B）堿性磷酸酶活力的影響Fig. 5 Effects of adzuki bean seed coat polyphenols on alkaline phosphatase activity of Listeria ATCC19119 (A) and Salmonella ATCC14028 (B)

2.8 紅豆皮多酚提取物對(duì)食源性致病菌菌體形態(tài)的影響

用掃描電子顯微鏡觀察紅豆皮多酚處理后李斯特菌ATCC19119和沙門氏菌ATCC14028細(xì)胞的細(xì)胞膜完整性和形態(tài)變化。如圖6、7所示，未經(jīng)處理的李斯特菌和沙門氏菌菌體細(xì)胞分別呈橢球狀和短桿狀，表面相對(duì)完整，沒有明顯的皺紋和裂紋。而經(jīng)紅豆皮多酚提取物處理的菌體細(xì)胞受到嚴(yán)重破壞，在菌體細(xì)胞表面上能夠觀察到明顯的褶皺和凹陷，且細(xì)胞發(fā)生黏附和聚集。這些結(jié)果表明紅豆皮多酚能夠破壞兩種菌體細(xì)胞的細(xì)胞膜，導(dǎo)致菌體的死亡和瓦解。

圖6 紅豆皮多酚提取物對(duì)李斯特菌ATCC19119形態(tài)的影響Fig. 6 Effects of adzuki bean seed coat polyphenols on cell morphology of Listeria ATCC19119

圖7 紅豆皮多酚提取物對(duì)沙門氏菌ATCC14028形態(tài)的影響Fig. 7 Effects of adzuki bean seed coat polyphenols on cell morphology of Salmonella ATCC14028

2.9 SDS-PAGE分析結(jié)果

菌體細(xì)胞膜蛋白在維持細(xì)胞膜通透性方面起著重要作用。細(xì)胞膜蛋白的損傷可能導(dǎo)致菌體細(xì)胞膜中酶系統(tǒng)完整性的破壞。Nakayama等[38]發(fā)現(xiàn)表沒食子酸阻斷了大腸桿菌細(xì)胞外膜蛋白的孔通道，抑制外膜的被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)，從而抑制大腸桿菌的生長(zhǎng)。如圖8所示，經(jīng)1 MIC紅豆皮多酚提取物處理的李斯特菌ATCC19119和沙門氏菌ATCC14028菌株的蛋白條帶灰度與陰性對(duì)照組相比降低，李斯特菌ATCC19119中48～135 kDa蛋白條帶灰度明顯降低，沙門氏菌ATCC14028中25～35 kDa和48～100 kDa蛋白條帶灰度明顯降低，且李斯特菌ATCC19119和沙門氏菌ATCC14028菌株的蛋白含量與紅豆皮多酚提取物處理時(shí)間呈負(fù)相關(guān)。

圖8 紅豆皮多酚提取物對(duì)李斯特菌ATCC19119（A）和沙門氏菌ATCC14028（B）蛋白組成的影響Fig. 8 Effects of adzuki bean seed coat polyphenols on the protein composition of cell membranes of Listeria ATCC19119 (A) and Salmonella ATCC14028 (B)

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)通過高效液相色譜法檢測(cè)出紅豆皮多酚的13 種單體酚成分。紅豆皮多酚提取物對(duì)李斯特菌ATCC19119和沙門氏菌ATCC14028菌體細(xì)胞具有有效的抑菌活性，其對(duì)李斯特菌ATCC19119的MIC為625 μg/mL，對(duì)沙門氏菌ATCC14028的MIC為2 500 μg/mL。此外，通過分析經(jīng)紅豆皮多酚提取物處理后的細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)容物蛋白質(zhì)和核酸的含量變化發(fā)現(xiàn)，二者均明顯減少，因此可以推斷紅豆皮多酚的作用機(jī)制是破壞細(xì)胞膜通透性，從而導(dǎo)致核酸和蛋白質(zhì)的損失。SDS-PAGE結(jié)果也可以證明在紅豆多酚的作用下細(xì)菌胞內(nèi)蛋白含量減少。同時(shí)，紅豆皮多酚會(huì)使細(xì)胞內(nèi)ATP含量顯著性降低，細(xì)菌細(xì)胞膜產(chǎn)生去極化現(xiàn)象。綜上，推測(cè)紅豆皮多酚的作用會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞裂解和死亡，這與細(xì)胞膜通透性的增加有關(guān)。通過掃描電子顯微鏡觀察到的菌體表面褶皺和凹陷的現(xiàn)象也能夠支持上述假設(shè)。然而，考慮到食品的安全性，在將紅豆皮多酚應(yīng)用于食品生產(chǎn)前還需進(jìn)行安全性實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化使用劑量并分析其對(duì)食品感官特性產(chǎn)生的影響。