侯成杰，聶彩清，王彥茜，艾連中，夏永軍，張 匯，謝 凡，王光強(qiáng)

（上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093）

高血壓是一種引起廣泛關(guān)注的心血管疾病，是誘發(fā)腦梗死、心肌梗死、腎衰竭等疾病的危險(xiǎn)因素。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（angiotensin I-converting enzyme，ACE）可以催化血管緊張素-I轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂醒苁湛s功能的血管緊張素-II，從而引起血壓升高。因此，通過(guò)抑制ACE活性能夠有效降低血壓[1]。目前廣泛使用的卡托普利、來(lái)諾普利、依那普利等降壓藥物均是通過(guò)抑制ACE活性在臨床上實(shí)現(xiàn)降血壓的作用。但是這些化學(xué)合成類藥物也會(huì)帶來(lái)一系列副作用，如誘發(fā)咳嗽、皮疹等[2]。后來(lái)研究人員發(fā)現(xiàn)天然食物中也具有可以抑制ACE活性的物質(zhì)，特別是在蛋白質(zhì)水解得到的活性肽中發(fā)現(xiàn)了大量具有ACE抑制活性的ACE抑制肽，目前研究人員已經(jīng)在乳酪蛋白[3]、乳清蛋白[4]、雞蛋蛋白[5]、魚鱗蛋白[6]、牡蠣蛋白[7]、大豆蛋白[8]、高粱蛋白[9]、花生蛋白[10]、燕麥麩蛋白[11]等多種蛋白中水解分離得到了幾千種ACE抑制肽。與人工合成的藥物相比，食源性ACE抑制肽無(wú)副作用、更安全，并且種類多、易制備。因此，食源性多肽被認(rèn)為是治療高血壓的一種更健康、更自然的替代來(lái)源。

蛋白質(zhì)分子中的多肽序列本身并不具有生物活性，因而通常采用酶催化水解的方式將多肽水解為寡肽以便獲得生物活性肽。在ACE抑制肽的研究中，傳統(tǒng)研究方法一般是先采用單一酶或復(fù)合酶水解目標(biāo)蛋白得到酶解液，再通過(guò)超濾、分子排阻色譜、高效液相色譜等方式分離鑒定出各種ACE抑制肽[12-13]。傳統(tǒng)方法雖然是一種制備并鑒定ACE抑制肽的有效方法，但是也存在篩選盲目、耗時(shí)長(zhǎng)、分離效率低、成本高等缺點(diǎn)。隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)和生物信息學(xué)的發(fā)展，人們?cè)絹?lái)越希望建立一種利用計(jì)算機(jī)快速篩選ACE抑制肽的新方法。虛擬酶解是在已知各種酶的酶切位點(diǎn)和目標(biāo)蛋白質(zhì)氨基酸序列的基礎(chǔ)上，采用計(jì)算機(jī)輔助方式模擬蛋白酶對(duì)蛋白質(zhì)肽鍵的水解，進(jìn)而分析得到蛋白質(zhì)水解后的各種小肽等產(chǎn)物。分子對(duì)接則可以通過(guò)模擬受體與配體的對(duì)接快速篩選出具有ACE抑制作用的活性肽，并對(duì)活性肽與ACE的作用機(jī)理進(jìn)行解析。相對(duì)于傳統(tǒng)酶解后分離鑒定的方式，虛擬酶解和分子對(duì)接方法可以極大提高活性肽的篩選效率[13]。

采用酶解蛋白制備功能肽的關(guān)鍵是選擇合適的蛋白酶，不同蛋白酶具有不同的酶切位點(diǎn)，目前常用的酶有堿性蛋白酶（EC 3.4.21.62）、胰蛋白酶（EC 3.4.21.4）、木瓜蛋白酶（EC 3.4.22.2）、蛋白酶K（EC 3.4.21.64）、胰凝乳蛋白酶（EC 3.4.21.1）、胃蛋白酶（EC 3.4.23.1）等[12]。堿性蛋白酶（EC 3.4.21.62）是一種絲氨酸胞內(nèi)蛋白酶，能夠?qū)he、Leu、Trp和Tyr鏈接肽鍵的C末端進(jìn)行酶切，其酶解產(chǎn)物的C末端通常帶有疏水性氨基酸[14]，而這種結(jié)構(gòu)正是很多ACE抑制肽的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。胰蛋白酶（EC 3.4.21.4）是脊椎動(dòng)物的一種消化酶，屬于一種內(nèi)切酶，其特異性酶切位點(diǎn)主要是堿性氨基酸，可以在C端產(chǎn)生帶正電的氨基酸肽段，這些特點(diǎn)也符合ACE抑制肽的特點(diǎn)[15]。采用兩種或多種酶復(fù)合酶解的方式可以更充分地酶解肽段，得到更多更小的肽段，而相較于長(zhǎng)肽，短肽具有更高的ACE抑制活性和更好的腸道吸收特性[16]。因此，本研究采用堿性蛋白酶（EC 3.4.21.62）和胰蛋白酶（EC 3.4.21.4）同時(shí)進(jìn)行酶解的方式，以期得到更多具有ACE抑制活性的短肽。

本研究以α-乳白蛋白為目標(biāo)蛋白，通過(guò)生物信息學(xué)手段快速篩選出一種新的ACE抑制肽。首先采用虛擬酶解的方法獲得大量寡肽及其序列，再使用在線預(yù)測(cè)軟件對(duì)這些寡肽的生物活性、毒性和物理化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)，然后通過(guò)模擬分子對(duì)接的方式篩選出能與ACE結(jié)合的活性肽，最后通過(guò)固相法合成活性肽進(jìn)行體外活性驗(yàn)證，并通過(guò)全柔性分子對(duì)接模擬研究ACE抑制肽與ACE的作用機(jī)理。旨在為篩選ACE抑制肽提供一種簡(jiǎn)便、快速、高效、低成本的方法，為食源性ACE抑制肽的快速篩選提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

ACE、4-羥乙基哌嗪乙磺酸（4-hydroxyethylpiperazine ethylsulfonic acid，HEPES） 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；馬尿酰-組氨酸-亮氨酸（hippuryl-histidyl-leucine，HHL）、馬尿酸 上海源葉生物科技有限公司；乙腈、三氟乙酸（均為色譜純） 上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；鹽酸（分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氯化鈉（分析純） 上海泰坦科技股份有限公司；固相法合成三肽Pro-Glu-Trp（PEW）（純度≥98%） 上海淘普生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

e2965高效液相色譜儀 美國(guó)Waters公司；DK-8AD電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；ML204電子分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Discovery Studio 2016 R2 Client 美國(guó)Accelrys公司。

1.3 方法

1.3.1 獲得α-乳白蛋白的氨基酸序列

α-乳白蛋白的氨基酸序列來(lái)源于Universal Protein（https://www.uniprot.org/），α-乳白蛋白的編號(hào)為P00711，氨基酸數(shù)目為142。

1.3.2 虛擬酶解

通過(guò)BIOPEP-UWM（http://www.uwm.edu.pl/biochemia/index.php/pl/biopep）[17]中的“enzyme action”程序?qū)σ阎被嵝蛄械摩?乳白蛋白進(jìn)行虛擬水解，使用的蛋白酶為胰蛋白酶（EC3.4.21.4）和堿性蛋白酶（EC3.4.21.62）。

1.3.3 ACE抑制肽的篩選

將虛擬酶解α-乳白蛋白獲得的所有的肽與在線數(shù)據(jù)庫(kù)BIOPEP-UWM和AHTPDB（http://crdd.osdd.net/raghava/ahtpdb/）[18]中已被報(bào)道的ACE抑制肽進(jìn)行比對(duì)，篩選出未被報(bào)道的肽進(jìn)行下一步研究。

將所有未被報(bào)道的新型肽在PeptideRanker（http://bioware.ucd.ie/～compass/biowareweb/Server_pages/peptideranker.php）預(yù)測(cè)網(wǎng)站中進(jìn)行潛在生物活性評(píng)分，輸入每一個(gè)肽的氨基酸序列后，都會(huì)有對(duì)應(yīng)的生物活性評(píng)分，評(píng)分越高，代表肽的生物活性越大，通常生物活性評(píng)分不小于0.5，即可被認(rèn)為是活性肽。本實(shí)驗(yàn)選擇生物活性評(píng)分不小于0.5的肽作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。

1.3.4 生物活性及物理化學(xué)性質(zhì)預(yù)測(cè)

使用在線網(wǎng)站Innovagen（http://www.innovagen.com）分析肽在水中的溶解度，這是一個(gè)基于肽的等電點(diǎn)、帶電殘基數(shù)量和肽長(zhǎng)度進(jìn)行的評(píng)估，網(wǎng)站會(huì)將肽段水溶性分為“Good water solubility”和“Poor water solubility”2種，本研究通過(guò)該程序預(yù)測(cè)水溶性良好的活性肽。

使用在線網(wǎng)站ToxinPred（http://crdd.osdd.net/raghava/toxinpred/）[19]預(yù)測(cè)肽的毒性。

使用在線軟件Expasy-compute的pI/Mw tool（http://web.expasy.org/compute_pi/）[20]預(yù)測(cè)肽的分子質(zhì)量（molecular weight）和等電點(diǎn)（pI）。

使用在線網(wǎng)站Pepdraw（http://www.tulane.edu/～biochem/WW/PepDraw）預(yù)測(cè)肽的凈電荷和疏水性。

1.3.5 半柔性分子對(duì)接篩選ACE抑制肽

準(zhǔn)備受體：從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.rcsb.org）下載ACE的天然晶體結(jié)構(gòu)（PDB代碼：1O8A）。使用Discovery Studio 2016 Client軟件打開(kāi)PDB文件，刪除其3D晶體結(jié)構(gòu)中的水分子和雜原子，保留Zn2＋和Cl－，并通過(guò)Macromolecules模塊中的“Clean Protein”優(yōu)化蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，去除蛋白多構(gòu)象，為ACE補(bǔ)全氫原子和完整的氨基酸殘基。以Zn原子為活性中心，定義活性坐標(biāo)（X：38.977；Y：38.645；Z：50.183），對(duì)接半徑為10 ?。

準(zhǔn)備配體：使用Discovery Studio 2016 Client軟件構(gòu)建寡肽化合物，分別使用“Prepare Ligands”和“Full Minimization”定義寡肽為配體并進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化。

半柔性分子對(duì)接：使用Discovery Studio 2016 Client軟件中的“CDOCKER”模塊，將受體定義為剛性，配體定義為柔性，進(jìn)行半柔性分子對(duì)接，以“－CDOCKER Energey”值和“－CDOCKER Interaction Energy”值作為評(píng)分指標(biāo)。

1.3.6 三肽PEW的合成

采用9-芴甲氧羰基（9-fluorenylmethyloxycarbonyl，F(xiàn)MOC）固相合成法制備三肽PEW，以二氯樹(shù)脂為載體，將首個(gè)帶有FMOC保護(hù)氨基酸的羧基連接在樹(shù)脂上，然后用哌啶脫去FMOC保護(hù)基，再加入第2個(gè)保護(hù)氨基酸并加入縮合劑進(jìn)行縮合反應(yīng)，重復(fù)上述步驟完成三肽的合成。三肽PEW的合成委托上海淘普生物科技有限公司完成。

1.3.7 三肽PEW的ACE抑制活性測(cè)定[21]

采用高效液相色譜法測(cè)定三肽PEW的ACE抑制率：將三肽PEW溶于50 mmol/L HEPES緩沖液（含300 mmol/L氯化鈉）得到不同濃度的PEW溶液（0.25、0.5、0.75、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mmol/L），取PEW溶液50 μL與100 μL 5 mmol/L HHL混合，37 ℃水浴預(yù)熱30 min，然后加入30 μL ACE溶液（0.1 U/mL），37 ℃水浴反應(yīng)30 min，加入100 μL 1 mol/L鹽酸終止反應(yīng)，經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后測(cè)定。Waters e2695高效液相色譜儀，色譜柱：XBridge C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；色譜條件：0.05%三氟乙酸溶液和乙腈的體積比75∶25；流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL；紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)228 nm。

馬尿酸標(biāo)準(zhǔn)曲線：配制5.0 mmol/L馬尿酸溶液，并依次稀釋至0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mmol/L，色譜條件同上，以馬尿酸濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

ACE抑制率計(jì)算公式如下：

式中：A為以HEPES緩沖液為對(duì)照反應(yīng)得到馬尿酸的生成量/（mmol/L）；B為加入三肽PEW反應(yīng)所得馬尿酸的生成量/（mmol/L）。

IC50值為ACE抑制率為50%時(shí)活性肽的濃度。

1.3.8 ACE抑制模式的測(cè)定

將不同濃度的HHL（1、2、3、4、5 mmol/L）和PEW（0、2、4 mmol/L）與ACE混合，37 ℃水浴反應(yīng)30 min，按照1.3.7節(jié)方法測(cè)定馬尿酸的生成量，計(jì)算反應(yīng)速度。然后以HHL濃度和反應(yīng)速度雙倒數(shù)作Lineweaver-Burk圖分析酶抑制動(dòng)力學(xué)。

1.3.9 全柔性分子對(duì)接

受體及配體的準(zhǔn)備同1.3.5節(jié)。使用Discovery Studio 2016 Client軟件中的Flexible Docking模塊將配體對(duì)接到受體中，將ACE定義為受體，寡肽定義為配體。根據(jù)相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道以及PDB蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中ACE-賴諾普利復(fù)合物（1O86.pdb）、ACE-依那普利復(fù)合物（1UZE.pdb）和ACE-卡托普利復(fù)合物（1UZF.pdb）的X射線晶體衍射三維結(jié)構(gòu)，可以了解ACE與ACE抑制肽的結(jié)合位點(diǎn)的大致區(qū)域，明確活性口袋包括19 個(gè)氨基酸殘基（His353、Ala354、Ser355、Ala356、His383、Glu384、His387、Phe391、Pro407、His410、Glu411、Phe512、His513、Ser516、Ser517、Val518、Pro519、Arg522、Tyr523）[22]，對(duì)接半徑8 ?。具體對(duì)接參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 分子柔性對(duì)接實(shí)驗(yàn)參數(shù)Table 1 Parameters for flexible molecular docking

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用Graphpad Prism 8.0.2進(jìn)行作圖和數(shù)據(jù)分析，所有實(shí)驗(yàn)過(guò)程重復(fù)不少于3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 α-乳白蛋白的虛擬酶解及ACE抑制肽的篩選

α-乳白蛋白經(jīng)胰蛋白酶和堿性蛋白酶虛擬酶解后，共得到38 個(gè)寡肽，其中包含了2 個(gè)重復(fù)序列，no.10和no.16均為GY，水解位點(diǎn)分別為36～37和54～55。將所有的寡肽與BIOPEP-UWM和AHTPDB數(shù)據(jù)庫(kù)中已報(bào)道的活性肽序列進(jìn)行比對(duì)，共發(fā)現(xiàn)了14種已報(bào)道的活性肽，其中有8種活性肽具有ACE抑制活性，具體結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 虛擬酶解得到的肽Table 2 Peptides obtained by virtual enzymatic hydrolysis

為繼續(xù)從未報(bào)道的寡肽中篩選潛在的ACE抑制肽，通過(guò)在線分析軟件對(duì)未報(bào)道的23種寡肽生物活性進(jìn)行評(píng)分，從中選擇出生物活性評(píng)分大于0.5的短肽，對(duì)其水溶性、等電點(diǎn)、相對(duì)分子質(zhì)量、凈電荷和疏水性等一系列理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 肽的理化性質(zhì)Table 3 Physicochemical properties of the peptides

肽的理化性質(zhì)與其生理活性密切相關(guān)，通常ACE抑制肽包含2～20 個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量較小，根據(jù)構(gòu)效關(guān)系的研究表明，分子質(zhì)量較低的肽更適合與ACE進(jìn)行結(jié)合，通常具備更高的ACE抑制活性[1]。表2列出的8種已報(bào)道ACE抑制肽均為二肽，最大相對(duì)分子質(zhì)量為317.37，本研究篩選出的4 個(gè)活性肽為PEW、DQW、MMS和CS，其氨基酸個(gè)數(shù)均小于4，相對(duì)分子質(zhì)量均小于500。疏水性指的是肽從水相環(huán)境向疏水環(huán)境轉(zhuǎn)變的自由能，使用Wimley-White標(biāo)度，這是一個(gè)實(shí)驗(yàn)測(cè)定性質(zhì)的標(biāo)度，其中肽的疏水性是Wimley-White疏水性的總和[23]。丁龍[24]研究發(fā)現(xiàn)寡肽吸收率與疏水性和分子質(zhì)量均具有顯著相關(guān)性。肽的整體疏水性對(duì)其ACE抑制活性也很重要，親水性肽通常只有弱的或沒(méi)有抑制活性，這是因?yàn)锳CE的活性中心為疏水性，親水性分子難以與活性中心結(jié)合[22-25]。由表3水溶性結(jié)果可知，PEW、DQW和CS的水溶性良好，證明它們?cè)谒芤褐休^穩(wěn)定，適合在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行制備，也易于被腸道快速吸收。構(gòu)效關(guān)系研究表明，當(dāng)ACE抑制肽C末端倒數(shù)3 個(gè)氨基酸殘基中含有色氨酸（W）、酪氨酸（Y）、苯丙氨酸（F）和脯氨酸（P）時(shí)，抑制肽具有較高的ACE抑制活性[26]。綜上所述，初步推測(cè)PEW和DQW可能具有ACE抑制活性。

2.2 基于分子對(duì)接篩選ACE抑制肽

為進(jìn)一步篩選出具有ACE抑制活性的肽，使用Discovery Studio 2016 Client軟件中的CDOCKER模塊進(jìn)行ACE與上述4 個(gè)寡肽（PEW、DQW、MMS、CS）的半柔性對(duì)接，通過(guò)模擬分子對(duì)接的結(jié)果評(píng)價(jià)其與ACE的結(jié)合能力。在分子對(duì)接中，打分函數(shù)通常被用于評(píng)價(jià)受體與配體的不同構(gòu)象之間的相互結(jié)合程度和親和程度，進(jìn)而選擇最優(yōu)的構(gòu)象組合進(jìn)行更進(jìn)一步分析研究，因此打分函數(shù)對(duì)于分子對(duì)接結(jié)果好壞起關(guān)鍵性作用。目前主要有3種常用的打分函數(shù)：基于力場(chǎng)、基于經(jīng)驗(yàn)和基于知識(shí)的評(píng)價(jià)函數(shù)[27]，常見(jiàn)的有CDOCKER、Libdock、LigandFit、GOLD和ZDOCK等，不同評(píng)價(jià)函數(shù)都有其各自使用的針對(duì)性和特殊性。CDOCKER是一種精準(zhǔn)的分子對(duì)接技術(shù)，兼具有對(duì)接精度高和對(duì)接時(shí)間較短的優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于從小分子數(shù)據(jù)庫(kù)中搜尋與受體大分子具有高親和力的小分子。“－CDOCKER Interaction Energy”值是受體與配體相互作用力的評(píng)分，“－CDOCKER Energy”值是“－CDOCKER Interaction Energy”與分子內(nèi)能的和，“－CDOCKER Energy”值相對(duì)越高，表示其結(jié)合越緊密[5]。將2.1節(jié)得到的4 個(gè)寡肽和8 個(gè)已報(bào)道的ACE抑制肽分別與ACE進(jìn)行CDOCKER半柔性對(duì)接，對(duì)接結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 活性肽與ACE的半柔性對(duì)接評(píng)分Table 4 CDOCKER Energy values of the peptides

由表4可以看出，ACE-PEW復(fù)合物的“－CDOCKER Energy”和“－CDOCKER Interaction Energy”值分別為72.480 3 kcal/mol和73.491 5 kcal/mol，與其他已報(bào)道的ACE抑制肽評(píng)分相近，推測(cè)PEW與ACE具有較好的結(jié)合作用，而其他3 個(gè)肽無(wú)法與ACE實(shí)現(xiàn)半柔性對(duì)接，說(shuō)明其他3 個(gè)肽與ACE的結(jié)合效果不佳。通過(guò)與AHTPDB數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)發(fā)現(xiàn)來(lái)源于乳清蛋白的ACE抑制肽KGYGGVSLPEW（IC50=0.7 μmol/L）[28]，這個(gè)肽段包括了肽PEW。肽的氨基酸序列是其生物活性的決定因素，研究表明某些具有相同氨基酸序列的肽也會(huì)具有相似的生物活性[29]。因此初步篩選出PEW是潛在具有ACE抑制作用的活性肽，下一步將對(duì)PEW的ACE體外抑制活性進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

2.3 三肽PEW的ACE抑制活性

采用FMOC固相化學(xué)合成法合成三肽PEW，并采用高效液相色譜法對(duì)其ACE抑制率進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1。PEW抑制率方程為y=－0.013 3x2＋0.173 3x＋0.068 3，R2=0.963 6，根據(jù)抑制率方程求得IC50為3 130 μmol/L，證實(shí)了PEW具有ACE抑制活性。IC50值表示ACE抑制率達(dá)到50%時(shí)的肽濃度，IC50值越低說(shuō)明肽的抑制效果越好。表5列出了幾種已報(bào)道ACE抑制肽的IC50值，其中最小的IW為4.7 μmol/L，最大的GG為7 200 μmol/L，而PEW的IC50值（3 130 μmol/L）相對(duì)較高，說(shuō)明其ACE抑制活性要差于VF、GY、IW、VK、GL、IL 6種肽，但優(yōu)于二肽GG。構(gòu)效關(guān)系研究指出，當(dāng)C末端殘基為谷氨酸（E）時(shí)，會(huì)降低肽的ACE抑制活性[30]，這可能是PEW比其他6種二肽抑制活性低的原因。

圖1 PEW的ACE抑制活性Fig.1 ACE-inhibitory activity of PEW

表5 ACE抑制肽的IC50值Table 5 IC50 of ACE inhibitory peptides

2.4 三肽PEW對(duì)ACE的抑制模式分析

為了評(píng)估三肽PEW的活性機(jī)制，通過(guò)Lineweaver-Burk圖分析了其對(duì)ACE的抑制作用。如圖2所示，三肽PEW表現(xiàn)出競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用，隨著肽濃度的增加，Vm值固定不變，Km值增大。競(jìng)爭(zhēng)性抑制模式說(shuō)明三肽PEW與天然底物在結(jié)構(gòu)上相似，可以結(jié)合在ACE的活性位點(diǎn)，阻止ACE與底物的結(jié)合，降低了ACE與底物的親和力。

圖2 三肽PEW對(duì)ACE的抑制Lineweaver-Burk圖Fig.2 Lineweaver-Burk plot of ACE inhibition by PEW

2.5 ACE與三肽PEW的作用機(jī)理

為了進(jìn)一步闡明PEW與ACE的相互作用機(jī)制。采用Discovery Studio 2016 Client軟件模擬PEW與ACE的分子全柔性對(duì)接并進(jìn)行進(jìn)一步的分析，對(duì)接結(jié)果如圖3所示。柔性分子對(duì)接結(jié)果顯示，ACE-PEW復(fù)合物的“－CDOCKER Energy”值和“－CDOCKER Interaction Energy”值分別增加為85.811 2 kcal/mol和93.971 1 kcal/mol。說(shuō)明柔性對(duì)接情況較半柔性對(duì)接分子間的結(jié)合更緊密，更能反映分子結(jié)合的狀態(tài)。由圖3可以看出，PEW結(jié)合于ACE分子的空腔處，PEW與ACE共形成了6 個(gè)氫鍵，包括與3 個(gè)氨基酸殘基（His383、Glu384、His387）相互作用形成的3 個(gè)不同距離的碳?xì)滏I，與氨基酸殘基Ala354形成的3 個(gè)普通氫鍵。

圖3 肽PEW與ACE的分子對(duì)接相互作用Fig.3 Molecule docking simulation between peptides PEW and ACE

表6列出了ACE-PEW復(fù)合物在最佳構(gòu)象時(shí)的相互作用力，PEW與氨基酸殘基Ala354形成的3 個(gè)氫鍵中PEW的H41和Ala354的O之間形成的氫鍵最短，結(jié)合最緊密，說(shuō)明氨基酸殘基Ala354在與PEW相互結(jié)合的過(guò)程中起到了關(guān)鍵性作用。

表6 ACE-PEW復(fù)合物最佳構(gòu)象時(shí)相互作用力Table 6 Interaction forces in ACE-PEW complex with optimal conformation

PEW還與ACE的Trp357形成了Pi-Pi鍵，屬于疏水性相互作用，與ACE的Lys368、Glu384、Zn701分別產(chǎn)生了3 個(gè)靜電相互作用，此外Glu384同時(shí)與PEW存在鹽橋相互作用。Ala354、Glu384是活性口袋S1中主要的氨基酸殘基。研究顯示多種ACE抑制肽都可以與這2 個(gè)氨基酸殘基形成相互作用，如七肽SSYYPFK[37]、三肽HGR[38]均可以與Glu384形成氫鍵，三肽KDF[38]、VDF和EGF[39]則可以分別與Glu384形成靜電力、Pi鍵和鹽橋；EWL、KDF[38]、WQR、EGF、LEW[39]可以與Ala354形成氫鍵。ACE是一種Zn2＋四面體依賴型的酶，因此Zn701也是ACE的一個(gè)重要的活性位點(diǎn)，研究表明八肽GHVGAAGS[40]和三肽EWL、KDF[38]、WAR、HGR、VDF[39]均可以與Zn701形成相互作用。通過(guò)熱力學(xué)原理可得，小分子配體與大分子受體之間結(jié)合程度的強(qiáng)弱往往取決于對(duì)接過(guò)程中自由能發(fā)生的變化，所以受體蛋白和配體分子之間的相互作用力對(duì)于該復(fù)合物的親和程度和結(jié)合模式有很大影響，例如氫鍵、靜電相互作用和疏水相互作用往往是有助于復(fù)合物結(jié)合的相互作用力，因此ACE-PEW中這3種作用力都有助于結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。ACE主要含有3 個(gè)活性口袋：S1（Ala354、Glu384、Tyr523）、S2（Gln281、His353、Lys511、His513、Tyr520）和S1’（Glu162），這3 個(gè)口袋分別是ACE重要的催化活性位點(diǎn)[12]。大量研究都表明氫鍵是維持ACE與抑制肽結(jié)合的主要作用力[41]，PEW與S1口袋的Ala 354、Glu384形成了4 個(gè)氫鍵，說(shuō)明PEW能與S1口袋形成緊密的結(jié)合。Wu Qiongying等[42]發(fā)現(xiàn)配體與ACE殘基His383、His387和Glu411之間的相互作用可能導(dǎo)致四面體配位的Zn2＋的扭曲，從而造成ACE催化活性的失活。在本研究中，PEW與His354、Glu384同樣產(chǎn)生了強(qiáng)相互作用，這可能是ACE活性受到抑制的重要因素。Yu Zhipeng等[38]在研究中將用于臨床的降壓藥賴諾普利與ACE進(jìn)行了分子對(duì)接，結(jié)果顯示賴諾普利可以與Ala354、Glu384、His383、Zn701形成相互作用，這與PEW-ACE的分子模擬結(jié)果類似，說(shuō)明PEW可能與賴諾普利具有類似的抑制機(jī)制。而PEW與活性口袋S2中的His353形成了4 個(gè)不利的斥力，這表明PEW無(wú)法與S2口袋進(jìn)行結(jié)合，同時(shí)還會(huì)阻礙其與其他活性位點(diǎn)的結(jié)合，這很可能是PEW的IC50值較高的原因。

3 結(jié) 論

本研究以α-乳白蛋白為目標(biāo)蛋白，采用虛擬酶解和活性預(yù)測(cè)的方式快速篩選出具有潛在ACE抑制活性的肽，然后采用半柔性分子對(duì)接的方式將目標(biāo)肽與ACE進(jìn)行了模擬分子對(duì)接，篩選出了具有ACE抑制潛力的三肽PEW，并對(duì)PEW的體外抑制活性進(jìn)行驗(yàn)證，其IC50值為3 130 μmol/L。通過(guò)全柔性分子對(duì)接探究了PEW與ACE的作用機(jī)理，全柔性對(duì)接結(jié)果顯示，PEW與ACE的氨基酸His383、Glu384、His387和Ala354形成了6 個(gè)氫鍵，與氨基酸Trp357形成了Pi-Pi鍵，與Lys368、Glu384、Zn701形成3 個(gè)靜電引力和1 個(gè)鹽橋，氫鍵、疏水作用力、靜電力是維持PEW與ACE結(jié)合的主要作用力，PEW與活性口袋S1的相互作用可能是其具有ACE抑制活性的主要原因。而PEW的IC50值較高可能是由于其與活性口袋S2中His353存在斥力的結(jié)果。與傳統(tǒng)酶解后分離純化鑒定的方法相比，本研究可以快速高效地篩選得到具有ACE抑制活性的食品蛋白源活性肽，為活性肽的快速篩選提供了新思路。