徐圓程，劉 慧，王光宇，吳紅影，邱偉芬

（南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇省糧油品質(zhì)控制及深加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210023）

稻谷是食用人口最多的作物之一[1]，在中國(guó)，有65%的人口以稻米為主食[2]，因此稻谷的安全性就顯得尤為重要。在稻谷儲(chǔ)藏過(guò)程中，當(dāng)溫度、濕度條件達(dá)到適合真菌生長(zhǎng)條件時(shí)，這些真菌便會(huì)分解并利用稻谷中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，使其品質(zhì)發(fā)生劣變，這會(huì)對(duì)糧食安全與糧食品質(zhì)造成嚴(yán)重威脅[3-4]，有些真菌甚至?xí)a(chǎn)生真菌毒素[5]，進(jìn)而威脅食用者的健康[6]。因此，研究不同溫度和濕度下儲(chǔ)藏稻谷中的真菌菌群結(jié)構(gòu)有重要意義，可以更有針對(duì)性地控制儲(chǔ)藏條件，同時(shí)也為減少儲(chǔ)藏稻谷霉變發(fā)生幾率以及提高儲(chǔ)藏稻谷品質(zhì)提供理論依據(jù)。

傳統(tǒng)方法分析微生物群落多樣性及群落結(jié)構(gòu)需要先對(duì)可培養(yǎng)微生物進(jìn)行分離、鑒定，再進(jìn)行分析，而在樣品中可培養(yǎng)微生物往往只占總微生物的不到10%[7]，因此，這也就說(shuō)明了傳統(tǒng)方法不能全面評(píng)估微生物群落的組成及結(jié)構(gòu)。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的研究將這一技術(shù)運(yùn)用于食品微生物群落特征的鑒定[8]。劉金等[9]利用高通量測(cè)序技術(shù)分析了廣西百色地區(qū)儲(chǔ)藏油茶籽中霉菌的多樣性，發(fā)現(xiàn)油茶籽殼和仁中的污染霉菌主要都為曲霉屬（Aspergillus）和節(jié)擔(dān)菌屬（Wallemia）。吳進(jìn)菊等[10]通過(guò)高通量測(cè)序聚類(lèi)分析和主成分分析（principal component analysis，PCA），發(fā)現(xiàn)大頭菜在發(fā)酵前期的優(yōu)勢(shì)菌屬為明梭孢屬（Monographella），而中、后期的優(yōu)勢(shì)菌屬為德巴利氏酵母屬（Debaryomyces）和接合酵母屬（Zygosaccharomyces）。衛(wèi)春會(huì)等[11]采用高通量測(cè)序比較分析汾酒酒醅發(fā)酵過(guò)程中的真菌群落結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示酒醅發(fā)酵初期的優(yōu)勢(shì)菌都是畢赤酵母（Pichia），到發(fā)酵后期，兩種酒醅中的優(yōu)勢(shì)菌分別變?yōu)獒劸平湍福⊿accharomyces）和假絲酵母（Candida）。此外，高通量測(cè)序技術(shù)作為食品行業(yè)一項(xiàng)新興的技術(shù)，也已廣泛運(yùn)用到香腸[12]、酸菜[13]、腐乳[14]、豆豉[15]等的微生物群落分析研究中。但鮮有報(bào)道將高通量測(cè)序技術(shù)運(yùn)用到系統(tǒng)測(cè)定不同溫度、濕度條件下儲(chǔ)藏稻谷的真菌群落結(jié)構(gòu)多樣性研究中。

本研究將湖南衡陽(yáng)倉(cāng)儲(chǔ)2017年稻谷在不同溫度（10、20、25、30、40 ℃）和環(huán)境相對(duì)濕度（relative humidity，RH）（43%、75%和85%）條件下儲(chǔ)藏16 周后，采用高通量測(cè)序技術(shù)分析不同儲(chǔ)藏條件下樣品中真菌群落結(jié)構(gòu)與優(yōu)勢(shì)菌屬，旨在為調(diào)整倉(cāng)儲(chǔ)條件及對(duì)優(yōu)勢(shì)真菌的針對(duì)性防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

稻谷為湖南衡陽(yáng)2017年倉(cāng)儲(chǔ)稻谷。

碳酸鉀、氯化鈉、氯化鉀（均為分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；植物基因組DNA提取試劑盒天根生化科技有限公司；AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒美國(guó)Axygen公司；DL2000 DNA Marker、2×RapidTaqMaster Mix 南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

9700型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國(guó)ABI公司；HiSeq高通量測(cè)序平臺(tái) 美國(guó)Illumina公司；5810R離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；WH-2微型渦旋混合儀 上海滬西分析儀器廠有限公司；GNP-9160型隔水式恒溫培養(yǎng)箱 上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司；電泳儀、電泳槽、凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad公司；移液器、 NanoDrop One超微量分光光度儀美國(guó)Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品預(yù)處理

參照Wang Xihai等[16]的方法，分別配制飽和碳酸鉀溶液、飽和氯化鈉溶液和飽和氯化鉀溶液，以人工制造43% RH、75% RH和85% RH的環(huán)境。在無(wú)菌條件下，將50 g稻谷樣品分裝在150 mm無(wú)菌培養(yǎng)皿中，一共準(zhǔn)備45 份，然后分別將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)移至盛有不同飽和鹽溶液的干燥器中，接著將干燥器分別放入5種溫度（10、20、25、30、40 ℃）的人工氣候箱內(nèi)，儲(chǔ)藏16 周后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 基因組DNA提取及PCR

按照天根生物植物基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)的步驟，提取稻谷樣品中總DNA，提取的總DNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性，經(jīng)超微量分光光度計(jì)檢測(cè)濃度，檢測(cè)合格后將DNA樣品保存在－20 ℃。以樣本中微生物總DNA為模板，以通用引物ITS1/ITS2擴(kuò)增真菌的ITS基因序列[17]。PCR采用25 μL反應(yīng)體系：總DNA 1 μL，2×RapidTaqMaster Mix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，添加雙蒸水9.5 μL補(bǔ)充至25 μL。PCR條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性20 s，56 ℃退火20 s，72 ℃延伸40 s，共30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min；4 ℃保存。

1.3.3 測(cè)序過(guò)程

檢測(cè)合格的樣品構(gòu)建文庫(kù)：回收目的擴(kuò)增片段，用T4 DNA Polymerase、Klenow DNA Polymerase和T4 PNK將打斷形成的黏性末端修復(fù)成平末端，再通過(guò)3’端加堿基“A”，使得DNA片段能與3’端帶有“T”堿基的特殊接頭連接，最后，用合格的文庫(kù)進(jìn)行Cluster制備和測(cè)序。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析

對(duì)于測(cè)序結(jié)果，首先進(jìn)行數(shù)據(jù)處理過(guò)濾，獲得Clean Date后進(jìn)行拆分[18]，之后進(jìn)行序列拼接得到高變區(qū)的Tags[19]。在97%的相似度下進(jìn)行可操作分類(lèi)單元（operational taxonomic units，OTU）聚類(lèi)，得到代表序列；再將Tags與代表序列作比對(duì)，得到每個(gè)樣品在OTU的豐度分析[20]。得到OTU代表序列之后，將序列與UNITE Version7數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，在置信度閾值為0.6的條件下，對(duì)物種進(jìn)行注釋?zhuān)⑦^(guò)濾注釋結(jié)果。過(guò)濾完成后，選擇剩余的OTU進(jìn)入后續(xù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 稻谷真菌測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

經(jīng)質(zhì)控處理和OTU聚類(lèi)，原始稻谷和儲(chǔ)藏后稻谷中真菌序列統(tǒng)計(jì)如表1所示，樣品優(yōu)化序列占比都達(dá)到80%以上，原始稻谷與不同條件儲(chǔ)藏的稻谷，共計(jì)48 個(gè)樣品中共產(chǎn)生640 個(gè)OTU，其中20 ℃、43% RH條件下產(chǎn)生的OTU數(shù)量最多，30 ℃、75% RH條件下產(chǎn)生的OTU數(shù)量最少。另外還發(fā)現(xiàn)，除40 ℃，其他各儲(chǔ)藏溫度下75% RH和85% RH條件下OTU數(shù)都少于43% RH，可能是高濕度條件抑制了部分微生物的生長(zhǎng)。

表1 原始稻谷及在不同條件下儲(chǔ)藏后稻谷中真菌的序列統(tǒng)計(jì)Table 1 Amplification sequence statistics of fungi in fresh rice and rice stored under different conditions

2.2 稻谷真菌群落多樣性分析

Sobs指數(shù)、Chao指數(shù)、ACE指數(shù)、Shannon指數(shù)越大，說(shuō)明菌群豐度和多樣性越大；而Simpson指數(shù)越大，則說(shuō)明稻谷中的真菌群落多樣性越小[21]。覆蓋率可以評(píng)估樣品的樣本序列在文庫(kù)中的覆蓋程度。由表2可知，所有樣品的覆蓋率都達(dá)到0.99以上，表明樣品中序列未被測(cè)到的概率較低。在20 ℃、43% RH條件下儲(chǔ)藏后的稻谷Sobs指數(shù)、Chao指數(shù)和ACE指數(shù)均最大，表明在此儲(chǔ)藏條件下的稻谷真菌群落物種的豐富度最大，而30 ℃、75% RH條件下這些指數(shù)最低，表明其真菌群落豐富度最小。同時(shí)，經(jīng)比較得出，在10 ℃、85% RH條件下的稻谷樣品Shannon指數(shù)最大，Simpson指數(shù)最小，表明此儲(chǔ)藏條件下的稻谷真菌群落物種均勻度最高。總體來(lái)看，在20 ℃、43% RH條件下儲(chǔ)藏后的稻谷真菌群落多樣性最高，30 ℃、75% RH儲(chǔ)藏條件下稻谷真菌群落物種多樣性最低。由此可見(jiàn)，20 ℃、43% RH的條件適合更多數(shù)真菌的生存。

表2 全部稻谷樣品中的真菌群落多樣性指數(shù)統(tǒng)計(jì)Table 2 Statistics of diversity indexes of fungal community in all rice samples

2.3 稻谷真菌群落組成分析

原始稻谷及在不同條件下儲(chǔ)藏后的稻谷中，去除未分類(lèi)的真菌群落共包含5 個(gè)門(mén)，如圖1所示，分別為子囊菌門(mén)（Ascomycota）、擔(dān)子菌門(mén)（Basidiomycota）、芽枝霉門(mén)（Blastocladiomycota）、壺菌門(mén)（Chytridiomycota）和毛霉門(mén)（Mucoromycota）。其中Ascomycota為優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，相對(duì)豐度為2.53%～96.86%；其次為Basidiomycota，相對(duì)豐度為0.02%～9.39%。可以看到，原始稻谷樣品中，Ascomycota占比最高，平均占比達(dá)57.78%，其次是Basidiomycota 1.58%。當(dāng)溫度為20、25、30 ℃，相對(duì)環(huán)境濕度為75% RH和85% RH時(shí)，Ascomycota和Basidiomycota豐度處于相對(duì)低的水平。

圖1 原始稻谷及不同溫度、濕度條件儲(chǔ)藏后稻谷中真菌門(mén)水平相對(duì)豐度Fig.1 Relative abundance of fungi at the level of phylum in fresh rice and rice stored under different temperature and humidity conditions

選擇原始稻谷樣品及在不同溫度、濕度條件儲(chǔ)藏后的稻谷樣品測(cè)序結(jié)果中共有、相對(duì)豐度較大的屬水平序列和種水平序列群落，去除測(cè)序結(jié)果中的unclassified和unidentified，得到稻谷真菌屬水平和種水平的相對(duì)豐度圖。由圖2A可知，在原始稻谷樣品中，各菌屬分布較為平均，但主要菌屬是白僵菌屬（Beauveria）、Aspergillus和赤霉屬（Gibberella）。其中在10 ℃儲(chǔ)藏時(shí)，稻谷霉菌群落中主要菌屬為Beauveria、黑孢屬（Nigrospora）、Aspergillus、竹黃菌屬（Shiraia）和Wallemia。在20 ℃儲(chǔ)藏時(shí)，43% RH下儲(chǔ)藏的稻谷中主要菌屬是Nigrospora、卵球菌屬（Ophiosphaerella）和Gibberella；而75%和85% RH下稻谷主要菌屬是Aspergillus、Beauveria和Candida。在25 ℃儲(chǔ)藏時(shí)，稻谷主要菌屬是Beauveria、Aspergillus、Nigrospora、鏈格孢屬（Alternaria）和Candida。在30 ℃儲(chǔ)藏時(shí)，稻谷主要菌屬是Aspergillus、Candida、Nigrospora、Gibberella、Ophiosphaerella和Alternaria。在40 ℃儲(chǔ)藏時(shí)，43% RH下稻谷主要菌屬是Nigrospora、Beauveria和Alternaria；75%及85% RH下稻谷主要菌屬是Aspergillus、Nigrospora和Beauveria。綜上所述，無(wú)論在哪種溫度條件中，75%和85% RH下的優(yōu)勢(shì)菌屬都包含Aspergillus，且隨著溫度的升高，Aspergillus占比也相對(duì)變大，這與楊曉蓉等[22]儲(chǔ)藏溫度越高，稻谷含水量越大，越容易發(fā)生霉變的研究結(jié)果一致。

圖2 原始稻谷及不同溫度、濕度條件儲(chǔ)藏后稻谷中真菌屬水平（A）和種水平（B）的相對(duì)豐度Fig.2 Relative abundance of different fungal genera (A) and species (B)in fresh rice and rice stored under different conditions

從種水平看，在10 ℃儲(chǔ)藏時(shí)，稻谷中主要菌種是白僵菌（Beauveria bassiana）、黑孢霉（Nigrospora oryzae）、黃曲霉（Aspergillus flavus）、Ophiosphaerella agrostidis和竹黃菌（Shiraia bambusicola）。在20 ℃儲(chǔ)藏時(shí)，43% RH下儲(chǔ)藏的稻谷主要菌種是N.oryzae、O.agrostidis、錯(cuò)綜赤霉（Gibberella intricans）和A.flavus；75%和85% RH下的稻谷中主要菌種是B.bassiana和A.flavus。在25 ℃儲(chǔ)藏時(shí)，稻谷中主要菌種是B.bassiana、A.flavus、黑曲霉（Aspergillus nigers）和O.agrostidis。在30 ℃儲(chǔ)藏時(shí)，43% RH下儲(chǔ)藏的稻谷主要菌種是赭曲霉（Aspergillus ochraceus）、A.flavus和熱帶假絲酵母（Candida tropicalis）；75% RH下的稻谷中主要菌種是A.flavus、G.intricans、O.agrostidis和B.bassiana；85% RH下的主要菌種是A.flavus、鏈格孢霉（Alternaria longissima）、O.agrostidis和B.bassiana。在40 ℃儲(chǔ)藏時(shí)，稻谷中主要菌種是N.oryzae、B.bassiana、A.flavus、A.longissima和O.agrostidis。綜上所述，A.flavus在各溫度、濕度條件下都占有較大比例，且當(dāng)相對(duì)環(huán)境濕度達(dá)到85%時(shí)，在各菌種中占有最大比例，這與柳顯文[23]研究中A.flavus生長(zhǎng)最適RH為80%～90%的結(jié)果一致。A.flavus產(chǎn)生的黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）是稻谷中主要污染真菌毒素[24-25]，所以控制稻谷儲(chǔ)藏條件減少A.flavus的產(chǎn)生，才能從源頭上減少稻谷中AFB1的污染。另外A.ochraceus在30 ℃、43% RH條件下豐度明顯升高，這與劉彬[26]研究的赭曲霉菌的最佳生長(zhǎng)溫度20 ℃和濕度18%～22%的結(jié)果有所不同，推測(cè)可能的原因是低濕度條件抑制了A.flavus的生長(zhǎng)[27]，從而導(dǎo)致了A.ochraceus豐度的上升。A.ochraceus產(chǎn)生的赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）也是谷物中重要的污染真菌毒素[28-29]，OTA已被確定具有腎毒性、免疫毒性、致癌性和致畸性[30]，因此在儲(chǔ)藏過(guò)程中也應(yīng)避開(kāi)這一儲(chǔ)藏條件。

2.4 不同儲(chǔ)藏條件下稻谷中真菌群落差異分析

在97%的相似度下，得到每個(gè)稻谷樣品的OTU數(shù)，利用Venn圖可以展示處于不同儲(chǔ)藏狀態(tài)下的稻谷樣品中共有和各自特有的OTU數(shù)目，直觀展示稻谷樣品間OTU的重疊情況。Venn圖中不同顏色圖形代表不同儲(chǔ)藏條件，不同顏色之間交疊部分?jǐn)?shù)字為不同儲(chǔ)藏條件下的稻谷共有的OTU數(shù)。

由圖3可知，原始稻谷樣品和不同溫度、濕度條件儲(chǔ)藏后的稻谷樣品中真菌群落之間存在特性和共性。原始稻谷樣品與10 ℃儲(chǔ)藏條件下的稻谷相比，有41種特性O(shè)TU，與20 ℃相比，有46種特性O(shè)TU，與25 ℃相比，有75種特性O(shè)TU，與30 ℃相比，有76種特性O(shè)TU，與40 ℃相比，有44種特性O(shè)TU。可以看出25 ℃和30 ℃條件下的真菌群落差異性相較原始稻谷樣品更大。說(shuō)明這兩個(gè)溫度對(duì)稻谷儲(chǔ)藏過(guò)程中真菌群落的改變影響最大。相同溫度下，不同環(huán)境RH儲(chǔ)藏的稻谷真菌之間也存在特性和共性。在同一溫度下時(shí)，43% RH下儲(chǔ)藏的稻谷真菌特性O(shè)TU相對(duì)最多，且隨著環(huán)境RH的升高，與原始稻谷共有的OTU數(shù)量減少。這說(shuō)明相同溫度條件下，濕度越高儲(chǔ)藏稻谷中真菌群落的變化就越大。相同環(huán)境RH下，不同溫度儲(chǔ)藏的稻谷真菌群落之間也存在特性和共性。43% RH下，稻谷真菌共性O(shè)TU有88種，10、20 ℃和40 ℃時(shí)特性O(shè)TU較25 ℃和30 ℃多，說(shuō)明43% RH時(shí)，10、20 ℃和40 ℃條件下的真菌群落多樣性比25 ℃和30 ℃條件下高；75% RH和85% RH下，稻谷真菌共性O(shè)TU分別有47種和42種，且在40 ℃時(shí)特性O(shè)TU數(shù)遠(yuǎn)多于其他幾個(gè)溫度，說(shuō)明40 ℃ 75% RH和85% RH的條件下稻谷真菌群落多樣性相對(duì)較高。盡管通過(guò)高通量測(cè)序得到很多的真菌種類(lèi)，但是也只有少數(shù)真菌會(huì)在儲(chǔ)藏過(guò)程中生長(zhǎng)發(fā)育，并在一些特定的外部條件作用下才會(huì)產(chǎn)生不良的影響[31]。

圖3 原始稻谷及不同條件儲(chǔ)藏后稻谷中真菌的OTU分布比較Venn圖Fig.3 Venn diagram of OTU distribution of fungi in fresh rice and rice stored under different conditions

對(duì)稻谷中真菌群落進(jìn)行PCA，圖中不同條件儲(chǔ)藏的稻谷中真菌群落距離越近，則表示群落相似度越高。由圖4可知，原始稻谷樣品與10 ℃、43% RH儲(chǔ)藏條件下的稻谷樣品位置相對(duì)較近，說(shuō)明這兩種儲(chǔ)藏狀態(tài)下的稻谷樣品中真菌群落物種多樣性差異較?。辉嫉竟葮悠放c剩余其他儲(chǔ)藏條件下的稻谷樣品位置間均相對(duì)分散，說(shuō)明稻谷樣品之間真菌群落物種多樣性差異較大。在相同儲(chǔ)藏溫度下，10、20、25、40 ℃時(shí)，3種不同環(huán)境RH中的稻谷樣品位置相對(duì)分散，說(shuō)明這些儲(chǔ)藏條件下的稻谷樣品的真菌群落差異性較大，而30 ℃時(shí)，75% RH和85% RH中的稻谷樣品位置幾乎重疊，說(shuō)明此儲(chǔ)藏條件下的稻谷真菌群落多樣性差異較小。在相同環(huán)境RH下，可以發(fā)現(xiàn)在43% RH時(shí)，原始稻谷樣品與不同儲(chǔ)藏溫度下的稻谷樣品位置相對(duì)分散，說(shuō)明稻谷真菌群落物種多樣性差異較大；75%、85% RH下，20、25 ℃和30 ℃的稻谷樣品位置相對(duì)集中，說(shuō)明這6種儲(chǔ)藏條件下的稻谷真菌群落物種多樣性差異較小。

圖4 原始稻谷及不同條件儲(chǔ)藏后稻谷中真菌的PCA圖Fig.4 PCA plots of fungal communities in fresh rice and rice stored under different conditions

3 結(jié) 論

采用Illumina HiSeq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)原始稻谷與在不同溫度、濕度條件下儲(chǔ)藏后的稻谷中的真菌多樣性和菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，對(duì)OTU進(jìn)行物種分類(lèi)后發(fā)現(xiàn)，原始稻谷及在不同溫度、濕度條件儲(chǔ)藏后的稻谷中的真菌群落共計(jì)屬于6 個(gè)門(mén)、24 個(gè)綱、67 個(gè)目、160 個(gè)科、285 個(gè)屬、406 個(gè)種。與原始稻谷樣品相比，不同溫、濕度條件儲(chǔ)藏后的稻谷真菌群落組成與豐度均發(fā)生了變化。其中優(yōu)勢(shì)菌種為B.bassiana、A.flavus和N.oryzae，且隨著濕度的升高，A.flavus占比越來(lái)越高。因此認(rèn)為，溫度和RH會(huì)影響儲(chǔ)藏稻谷中的微生物群落，所以濕度和溫度控制是水稻貯藏的重要制約因素。較高的RH更有利于某些真菌的發(fā)育，并進(jìn)一步加速了水稻品質(zhì)劣變。其中A.flavus受濕度影響較大，在85% RH時(shí)，相對(duì)豐度在各儲(chǔ)藏溫度下都達(dá)到最大，可以認(rèn)為是影響稻谷品質(zhì)的關(guān)鍵菌屬，A.flavus產(chǎn)生的AFB1會(huì)對(duì)人體造成極大危害，所以對(duì)A.flavus的防控同時(shí)可以從源頭上降低AFB1發(fā)生的可能性。通過(guò)Venn分析與PCA，可以發(fā)現(xiàn)原始稻谷樣品與在不同溫度、濕度條件下儲(chǔ)藏后的稻谷樣品真菌群落中，既具有共有真菌菌種，也具有特有真菌菌種，原始稻谷樣品與不同條件儲(chǔ)藏后的樣品中真菌群落多樣性存在較大差異，不同溫、濕度條件中的稻谷樣品真菌群落多樣性之間也存在差異，但20、25、30 ℃下75%和85% RH儲(chǔ)藏條件下的稻谷真菌群落多樣性之間差異較小。