陳薪竹，王玉波，王 丹，洪艷平，杜華英，戴 棚，鄧煒杰，熊建華，楊武英

（江西農業(yè)大學食品科學與工程學院，南昌市農產品加工與質量控制重點實驗室，江西 南昌 330045）

獸藥殘留一直是影響我國食品安全問題的主要原因之一，由于我國在獸藥使用和管理上存在漏洞，導致因非法使用獸藥造成動物性食品獸藥殘留超標事件頻頻發(fā)生，嚴重影響了人體健康及我國動物性產品的出口貿易[1]。呋喃唑酮，又名痢特靈，是一種常見的硝基呋喃類藥物，因其抗菌譜較寬且制備簡單，常用于防治由多種致病菌引起的腸道感染、潰瘍病等，也常作為畜禽類和水產動物的生長促進劑[2-3]。研究證明呋喃唑酮屬于強致癌物[4]，對人體健康會造成很大威脅，目前包括中國在內的許多國家都已明確禁止其在食品性動物中使用。但是受經濟利益驅使，我國非法使用的現(xiàn)象仍很嚴重，因此加強對動物性食品中呋喃唑酮的檢測監(jiān)控十分必要[5-6]。

呋喃唑酮的代謝物是3-氨基-2-噁唑烷酮（3-amino-2-oxazolidinone，AOZ）。研究表明，AOZ與原藥分子一樣具有“三致”作用（致癌、致畸、致突變）[7-8]。呋喃唑酮在動物體內的代謝十分迅速，但其代謝物AOZ則能在動物機體內與細胞膜蛋白穩(wěn)定結合后存留數(shù)周之久，當人類食用此類食品后，人體胃酸會使AOZ脫離蛋白質從而被人體吸收，對人類機體造成潛在危害。由于AOZ比母體原藥更能穩(wěn)定存在于動物組織中，所以藥殘監(jiān)測部門通常將AOZ作為監(jiān)測呋喃唑酮藥物殘留的靶標藥物[9-10]。

目前，國內外用于檢測AOZ的方法主要有儀器分析法[11-16]和免疫分析法[17-20]等。近年來，以抗原與抗體特異性、可逆分子識別理論為基礎的免疫分析法得到迅速發(fā)展，因其成本低、操作簡單、靈敏度高、可現(xiàn)場檢測，彌補了大型精密儀器分析確證技術的不足，在食品安全監(jiān)測中具有突出優(yōu)勢。在免疫分析方法中，抗體質量好壞直接影響檢測的靈敏度和特異性?；蚬こ炭贵w的出現(xiàn)彌補了多克隆抗體特異性低、均質性差以及單克隆抗體制備困難、造價昂貴等缺點，大大拓寬了抗體的應用范圍。其中單鏈抗體（single chain variable fragment，scFv）是一種由免疫球蛋白重鏈可變區(qū)（VH）和輕鏈可變區(qū)（VL）通過連接肽構建而成的一種小分子基因工程抗體，其大小僅為普通抗體的1/6，不僅穿透力強、抗原性低，而且可通過發(fā)酵大量生產，近年來在農獸藥殘留免疫檢測方面展示了廣闊的應用前景[21-22]，是基因工程抗體研究領域的熱點之一。以往AOZ殘留免疫檢測方法都是在傳統(tǒng)的多抗或單抗基礎上建立的[23-25]，利用基因工程scFv建立的免疫分析方法鮮見報道。本實驗首先從前期獲得的抗AOZ衍生物單克隆抗體陽性雜交瘤細胞1D2出發(fā)，采用重疊延伸聚合酶鏈式反應（splicing overlap extension-polymerase chain reaction，SOE-PCR）技術，用連接肽(G4S)3將抗體VH、VL基因連接構建完整的scFv基因，然后對其編碼的氨基酸進行生物信息學分析，再把抗AOZ衍生物scFv基因轉入到可溶性表達載體plip6/GN中和堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AP）基因進行融合表達，最后采用直接競爭酶聯(lián)免疫分析法（direct competitive enzyme-linked immunosorbent assay，dcELISA）對該抗體進行活性檢測，旨在為后續(xù)AOZ殘留檢測免疫分析方法的建立以及抗體的分子修飾、改造奠定一定的實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

包被原（AOZ-COOH-OVA）、抗AOZ衍生物單克隆抗體陽性雜交瘤細胞1D2、感受態(tài)細胞BL21（DE3）、大腸桿菌BL21（DE3）和Plip6/GN載體由本研究室制備保存；抑制藥物2-NP-AOZ 美國Sigma公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒、RNA提取試劑盒、cDNA第1鏈合成試劑盒 北京全式金生物技術有限公司；PCR引物（表1） 北京華大生物技術有限公司；DNA片段清潔試劑盒 大連寶生物公司；質粒小提試劑盒 北京天根生物技術有限公司；SfiI酶、NotI酶、T4連接酶 美國NEB公司；酶標版 美國康寧公司；其他試劑均為進口或國產分析純及色譜純。

表1 VH、VL和scFv的擴增引物Table 1 Primers for PCR amplification of VH, VL and scFv used in this study

1.2 儀器與設備

S1000型PCR擴增儀、蛋白電泳設備、凝膠成像系統(tǒng)美國Bio-Rad公司；DNA電泳設備 北京六一生物科技有限公司；核酸蛋白分析儀 美國Thermo公司；SpectraMax M2多功能酶標儀 美國Molecular Devices公司。

1.3 方法

1.3.1 總RNA提取

首先復蘇培養(yǎng)抗AOZ衍生物單克隆抗體陽性雜交瘤細胞1D2至對數(shù)生長期，棄培養(yǎng)基后，用無菌磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）漂洗；然后加入1 mLTransZol UP裂解液，吹打細胞使其脫落后轉移至離心管中，再按試劑盒說明書操作提取細胞RNA，洗脫RNA經核酸蛋白分析儀測定濃度后于－80 ℃保存。

1.3.2VH和VL基因片段的擴增

第1鏈cDNA的合成：以RNA為模板，按試劑盒說明書配制如下反應體系：取RNA（約5 μg）3 μL，Anchored Oligo(dT)18 Primer 1 μL、2×ES Reaction Mix 10 μL、gDNA Remover 1 μL、RNase-free Water 4 μL、EasyScript RT/RI Enzyme Mix 1 μL，混勻，短暫離心后42 ℃反應30 min，85 ℃滅活5 s。

VL、VH基因片段的擴增：以cDNA第1鏈反應物為模板，分別用VH（或VL）可變區(qū)上、下游引物擴增VL、VH基因片段，反應體系：cDNA第1鏈反應物1 μL、VH（或VL）（For）引物0.5 μL、VH（或VL）（Rev）引物0.5 μL、2×EasyPfuPCR SuperMix 12.5 μL、RNase-free Water 10.5 μL，混勻離心后進行擴增。設置反應程序為：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，步驟2～4進行30 個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。反應結束后取PCR產物3 μL進行1%瓊脂糖凝脂電泳。

1.3.3scFv基因構建

首先以VHForSfiI/VHRev Linker或VLFor Linker/VLRevNotI作為引物，通過PCR擴增得到帶有SfiI、NotI酶切位點和連接肽序列的VH、VL序列。反應體系：VH（VL）2 μL、VHForSfiI（或VLFor Linker）引物1 μL、VHRev Linker（或VLRevNotI）引物1 μL、2×EasyPfuPCR SuperMix 25 μL、RNase-free Water 21 μL，混勻離心后進行擴增，反應條件同上；之后再通過SOE-PCR將帶有酶切位點和連接肽序列的VH、VL片段連接起來。反應體系：帶SfiI酶切位點和連接肽的VH片段7 μL、帶NotI酶切位點和連接肽的VL片段5 μL、2×EasyPfuPCR SuperMix 20 μL、RNase-free Water 18 μL，混勻短暫離心后進行連接反應，設置反應程序為：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，步驟2～4進行8 個循環(huán)，72 ℃延伸10 min；最后，取連接產物2 μL、VHForSfiI引物1 μL、VLRevNotI引物1 μL、2×EasyPfuPCR SuperMix 25 μL，RNase-free Water 21 μL，混合均勻，短暫離心后進行擴增反應，反應條件同1.3.2節(jié)。反應完畢后取3 μL產物進行1%瓊脂糖凝脂電泳并純化回收。

1.3.4scFv基因與表達載體的連接和擴增

分別采用SfiI酶、NotI酶對scFv基因片段、Plip6/GN表達載體酶切，并將其純化回收，然后將抗AOZ衍生物scFv基因片段與表達載體Plip6/GN在T4連接酶作用下連接，轉化至感受態(tài)細胞BL21（DE3）中，涂布LB-Amp平板培養(yǎng)過夜，次日挑取克隆子，提取質粒并進行PCR鑒定和酶切鑒定，對鑒定結果正確的質粒進行測序分析。

1.3.5 抗AOZ衍生物scFv結構預測分析

1.3.5.1 基因序列分析及氨基酸序列推導及比對

利用IMGT數(shù)據庫中V-QUEST程序對抗AOZ衍生物scFv序列中VH、VL進行分析。得到測序結果后，先采用軟件SnapGene對抗AOZ衍生物scFv基因序列進行氨基酸序列推導，再將氨基酸序列導入IMGT數(shù)據庫V-QUEST程序中對scFv可變區(qū)中骨架區(qū)（framework region，F(xiàn)R）和決定簇互補區(qū)（complementarity-determining region，CDR）進行劃分；最后進入NCBI數(shù)據庫，點擊Protein BLAST選項，進行氨基酸序列同源性比對，選取同源性最高的序列并分析其差異。

1.3.5.2 編碼蛋白的理化性質分析

利用ExPASy Proteomics Tools在線工具中ProtParam子程序對抗AOZ衍生物scFv所編碼的氨基酸全序列進行理化分析，包括該抗體的氨基酸組成、相對分子質量及理論等電點（isoelectric point，pI）等物理化學參數(shù)。

1.3.5.3 編碼蛋白二級、三級結構預測

打開ExPASy Proteomics Tools在線工具，點擊SOPMA子程序，將推導得到的抗AOZ衍生物scFv氨基酸全序列導入，對抗體蛋白的二級結構進行預測；然后點擊SWISS-MODEL子程序，對抗體蛋白的三級結構進行模擬預測[26-27]。

1.3.6 抗AOZ衍生物scFv表達和活性鑒定

將Plip6/GN-scFv陽性克隆子接種至LB-Amp液體培養(yǎng)基，37 ℃、250 r/min過夜培養(yǎng)，次日按2%接種量接種至50 mL LB-Amp培養(yǎng)基，培養(yǎng)至對數(shù)期，加入蛋白誘導表達劑異丙基硫代半乳糖苷（0.6 mol/L）誘導表達7 h后離心收集菌體沉淀，然后加入50 μL雙蒸水和等體積2×十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）上樣緩沖液，煮沸10 min后進行SDSPAGE檢測，同時做空載體轉化菌對照；然后采用dcELISA對誘導表達后菌液上清中的抗體進行活性檢測，步驟如下：首先將包被抗原AMOZACOOH-OVA用碳酸鹽緩沖液（pH 9.6）稀釋至1 μg/mL，用于包被酶標版，100 μL/孔，于4 ℃放置過夜；然后用PBST洗滌3 次后每孔加入120 μL 5%脫脂奶粉37 ℃封閉1 h后烘干備用；然后取6 條封閉后的酶標板，3 列一個平行，所有列1～7孔加入不同稀釋倍數(shù)抗體，第8孔為空白對照，前3 列1～8孔分別加入50 μL PBS，后3 列1～8 孔加入50 μL標準藥物2-NP-AOZ（1 μg/mL），37 ℃孵育45 min，PBST洗滌5 次后加入底物溶液對硝基苯磷酸二鈉100 μL顯色10 min，最后加入100 μL 3 mol/L NaOH溶液終止反應，于405 nm波長下測定其吸光度。前3 列為scFv效價的測定，后3 列是對2-NP-AOZ標準品抑制作用的分析。

2 結果與分析

2.1 抗AOZ衍生物scFv基因構建

以抗AOZ衍生物單克隆抗體陽性雜交瘤細胞1D2為出發(fā)點，提取細胞總RNA后，其電泳圖條帶清晰（圖1A），兩條帶分別為28S、18S，且28S約為18S的2 倍，經核酸蛋白分析儀測定，RNA質量濃度為145.206 ng/mL，A260nm/A280nm和A260nm/A230nm比值分別為1.94、1.78，純度較高，適用于后續(xù)反轉錄PCR擴增抗體VH、VL基因。如圖1B所示，以RNA為模板，采用VHFor、VHRev或VLFor、VLRev引物進行PCR擴增，分別得到了大小約為350 bp的VH、VL片段，通過SOE-PCR擴增后，連接肽(G4S)3將VH、VL基因片段連接，得到一條大小為750 bp的條帶，符合預期判斷。

圖1 雜交瘤細胞總RNA電泳結果（A）和VH、VL及scFv PCR擴增結果（B）Fig.1 Total RNA from hybirdoma cells (A) and PCR amplification results of VH, VL and scFv (B)

2.2 抗AOZ衍生物scFv基因鑒定

采用VHForSfiI、VLRevNotI引物對重組子進行PCR鑒定，得到了750 bp左右的scFv基因片段（圖2A）。酶切鑒定所用酶為BglI，Plip6/GN空載體上有3 個BglI酶切位點，經BglI酶切后有2 條2 000 bp左右和1 條3 000 bp左右的條帶，插入目的片段后的載體經BglI酶切后有1 條2 000 bp左右和2 條3 000 bp左右的條帶，由圖2B酶切鑒定結果可知酶切結果正確，而且根據對測序結果的分析可知（圖3），抗AOZ衍生物單克隆抗體的VH和VL基因大小分別為360 bp和345 bp，抗體VH和VL基因已由大小為45 bp的Linker連接在一起，形成了正確的抗AOZ衍生物scFv基因結構。

圖2 陽性轉化子質粒PCR擴增鑒定（A）和酶切鑒定（B）Fig.2 Identification of recombinant plasmid Plip6/GN-scFv by PCR (A) and restriction enzyme digestion (B)

圖3 抗AOZ衍生物scFv基因全序列Fig.3 Gene sequence of scFv against AOZ derivative

2.3 抗AOZ衍生物scFv氨基酸序列推導

采用軟件SnapGene對抗AOZ衍生物scFv基因序列進行氨基酸序列推導，然后通過IMGT數(shù)據庫中V-QUEST程序對抗體氨基酸序列的功能區(qū)進行劃分。如圖4所示，抗AOZ衍生物scFv全長750 bp，編碼250 個氨基酸，其中VH編碼120 個氨基酸，VL編碼115 個氨基酸。推導出的氨基酸序列經V-QUEST程序分析后，VH、VL序列被劃分為4 個FR區(qū)和3 個CDR區(qū)。經NCBI數(shù)據庫比對后發(fā)現(xiàn)scFvVH與序列號為ATI97769.1的鼠源抗體重鏈可變區(qū)高度同源（83.33%），VL與序列號為BAC56972.1的鼠源抗體輕鏈可變區(qū)高度同源（90.43%）。經比對發(fā)現(xiàn)，該scFvVH、VL與2 個高度同源序列主要是在CDR1和CDR3區(qū)有較大差異，而且CDR3區(qū)的差異最大，這說明在scFv的制備中這2 個區(qū)域的氨基酸組成可能對抗原識別作用最為關鍵[28]。

圖4 抗AOZ衍生物scFv氨基酸序列Fig.4 Amino acid sequences of scFv against AOZ derivatives

2.4 抗AOZ衍生物scFv物理化學性質分析

根據Expasy Proteomics Tools中ProtParam子程序分析結果可知，抗AOZ衍生物scFv蛋白由250 個氨基酸殘基組成，根據表2可知，其中絲氨酸含量最高，占13.6%；其次分別為甘氨酸（12.8%）、蘇氨酸（9.6%）、亮氨酸（9.2%）、酪氨酸（6.8%）；半胱氨酸、蛋氨酸、組氨酸含量最低，占比分別為1.6%、1.2%、0.8%。該抗體分子式為C1192H1854N324O379S7，相對分子質量為27 012.20，理論pI值為9.13，屬于堿性氨基酸。

表2 抗AOZ衍生物scFv氨基酸組成Table 2 Amino acid composition of scFv against AOZ derivatives

2.5 抗AOZ衍生物scFv蛋白的二、三級結構分析

將上述推導的抗AOZ衍生物scFv氨基酸序列導入ExPASy Proteomics Tools在線工具的SOPMA子程序中對其二級結構進行預測，發(fā)現(xiàn)抗AOZ衍生物scFv包含α-螺旋20 處、β-轉角25 處、無規(guī)卷曲114 處，延伸帶結構則有91 處。通過SWISS-MODEL子程序進行同源模建后得到抗AOZ衍生物scFv的三維結構圖（圖5），觀察抗體模型正面俯視圖（圖5A）發(fā)現(xiàn)，抗AOZ衍生物scFv的VH、VL由連接肽相連，6 個CDR區(qū)的分布形成一個“環(huán)桶狀”結構；從圖5B抗體側面圖則可看出，與抗原結合的互補決定區(qū)為空穴似的“口袋狀”，這符合典型scFv的空間結構，與理論上抗原結合位點的空間構象相符，理論上應該具有良好的抗原結合活性[29-30]。

圖5 抗AOZ衍生物scFv三維結構模擬圖Fig.5 Simulated 3D structures of scFv against AOZ derivatives

2.6 抗AOZ衍生物scFv活性鑒定

將Plip6/GN-scFv陽性克隆子接種至LB培養(yǎng)基培養(yǎng)表達后，對其進行SDS-PAGE分析。因為插入的外源抗體基因會與Plip6/GN載體自帶的AP基因融合表達，抗AOZ衍生物scFv蛋白分子質量約為20～30 kDa，AP分子質量約為50～60 kDa，所以抗AOZ 衍生物scFv-AP融合蛋白分子質量大約為70 kDa。SDS-PAGE結果如圖6A所示，與plip6/GN/BL21（DE3）空載體對照菌相比，plip6/GN-scFv-phoA/BL21（DE3）工程菌在分子質量55～72 kDa處出現(xiàn)一條新生蛋白帶，該條帶就是抗AOZ衍生物scFv抗體蛋白。采用dcELISA對該抗體進行活性檢測，以抗體稀釋倍數(shù)為橫坐標，其對應A405nm值為縱坐標作圖，由圖6B可得，抗體稀釋倍數(shù)越大，其效價列對應的A405nm值越小，由此說明scFv抗體能夠識別包被抗原，還可以看出添加藥物的抑制作用分析對應的A405nm值均比未加藥物的效價測定對應的A405nm值小，說明藥物2-NP-AOZ對抗原抗體的特異性結合產生抑制，得到的重組scFv具有活性。在最佳包被抗原濃度和scFv稀釋倍數(shù)條件下得到基于此scFv的dcELISA檢測方法的半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）為40.23 ng/mL，與母本單克隆抗體的IC50值（31.56 ng/mL）相比，scFv的靈敏度略有下降，這可能是因為scFv大小為完整抗體的1/6，且只具有1 個抗原結合位點，而傳統(tǒng)單克隆抗體具有2 個抗原結合位點[21]。雖然與對應的單抗相比，scFv靈敏度略有下降，但是scFv能在大腸桿菌中表達，可通過微生物發(fā)酵快速大量制備，無需細胞培養(yǎng)，可大大節(jié)約生產成本及時間，而親和力則可通過后續(xù)基因的修飾、突變進行改進。因此，在食品安全免疫檢測中，基因工程scFv仍然具有很大的研究價值和應用前景。

圖6 重組scFv蛋白的SDS-PAGE鑒定（A）和抗AOZ衍生物scFv效價測定及抑制作用分析結果（B）Fig.6 Identification of the recombinant protein by SDS-PAGE (A) and titer and inhibition of scFv antibody against AOZ derivatives (B)

3 結 論

本研究從分泌產生抗AOZ衍生物單克隆抗體雜交瘤細胞中成功克隆獲得了抗AOZ衍生物抗體的VH、VL基因，并通過SOE-PCR用連接肽(G4S)3將VH、VL基因按VH-Linker-VL形式連接，成功構建了抗AOZ衍生物scFv基因。通過分析scFv基因測序結果并對其氨基酸序列進行推導可知，scFv基因全長750 bp，其中，VH長360 bp，編碼120 個氨基酸，VL長345 bp，編碼115 個氨基酸，連接肽(G4S)3大小為45 bp。該抗體相對分子質量為27 012.20，理論pI值為9.13，屬于堿性氨基酸。抗體二級、三級結構的預測結果表明該抗體符合典型scFv的空間結構，并且dcELISA結果也再次確認該抗體能與抗原穩(wěn)定結合和特異性識別包被抗原。本研究抗AOZ衍生物scFv基因的成功構建和抗體蛋白結構預測為后續(xù)抗體蛋白純化和動物性食品中AOZ殘留檢測免疫分析方法的建立奠定了一定的實驗基礎，也為在分子水平上對該抗體進行改造提供了一定的依據。