盧 杰 ，田勝明，王 勝，陳 璨，司紅起，常 成，馬傳喜

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/農(nóng)業(yè)部黃淮南部小麥生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實驗室，安徽合肥 230036)

隨著小麥產(chǎn)量的提高，其倒伏的風(fēng)險也增大[1]，小麥倒伏導(dǎo)致機(jī)械收割成本增加以及籽粒品質(zhì)和商品性變差[2]。小麥生產(chǎn)中，莖稈倒伏是最常見的倒伏類型，主要發(fā)生在基部節(jié)間，與株高和莖稈強(qiáng)度顯著相關(guān)[3]。矮化育種使育成品種株高降低，抗倒性增強(qiáng)；但育種實踐表明，過分強(qiáng)調(diào)矮桿將會造成地上部生物量下降，最終影響產(chǎn)量，且矮化后的植株若莖稈質(zhì)量較差仍會出現(xiàn)倒伏現(xiàn)象[4]。因而，育種實踐上小麥品種的抗倒伏策略應(yīng)由原來的矮稈抗倒轉(zhuǎn)變?yōu)閴讯捒沟?，注重莖稈質(zhì)量的改善與提高[1,3,5]。因此，研究小麥莖稈倒伏的遺傳機(jī)理，將有助于抗倒伏品種的培育。

確定合適的易倒測定時期及倒伏評價指標(biāo)是進(jìn)行小麥抗倒伏研究的關(guān)鍵。研究發(fā)現(xiàn)，在乳熟期，小麥物質(zhì)的生產(chǎn)和運(yùn)輸比較旺盛，莖稈中大量結(jié)構(gòu)物質(zhì)被分解和轉(zhuǎn)移，是極易發(fā)生倒伏的時期[6]?？沟狗笖?shù)[4]、莖稈斷裂力[7]、莖稈彈性[8]、田間自然倒伏[9]、莖稈強(qiáng)度[10]等可以用來評價小麥抗倒伏性。其中，田間自然倒伏觀察是小麥生產(chǎn)上最直接和常用的評價方法，但該方法易受環(huán)境因素制約，重復(fù)性差。采用抗倒伏指數(shù)和莖稈斷裂力兩個指標(biāo)時，測量過程中需破壞莖稈。而莖稈強(qiáng)度評價指標(biāo)具有不破壞小麥莖稈、重復(fù)性好等優(yōu)勢，且與小麥的抗倒伏性顯著正相關(guān)[10]，是較理想的抗倒伏性評價指標(biāo)之一。

研究發(fā)現(xiàn)，除株高外，小麥莖稈基部的結(jié)構(gòu)特征(節(jié)間長度、粗度和壁厚[10-12]以及維管束種類和數(shù)目[7,10,13])、木質(zhì)素、纖維素和全糖含量[13-19]等均與小麥的抗倒伏性相關(guān)。國內(nèi)外的研究學(xué)者對小麥抗倒伏遺傳機(jī)理進(jìn)行了研究，Ma等[15-18]發(fā)現(xiàn)，木質(zhì)素含量與小麥抗倒伏性關(guān)系密切，并克隆了3個小麥木質(zhì)素合成基因Ta-CCR1、Ta-COMT和Ta-CAD1。此外，一些與小麥莖稈抗倒伏性相關(guān)的QTL也有報道，其中，控制莖稈硬度的QTL位于3B和4D染色體上[20-21]，控制基部第1節(jié)間長度的QTL位于2D和 4B染色體上[22]，控制髓腔直徑的QTL位于1A和2D染色體上[23]，控制莖粗的QTL位于3B染色體上[23]，控制莖壁厚的QTL位于2D和3BL染色體上[23-24]，控制莖稈強(qiáng)度的QTL位于1B、2A、3A、3B、4A、4D、5A、5B和5D染色體上[23,25-26]。上述研究表明，小麥抗倒伏相關(guān)性狀受多基因控制。可見，進(jìn)一步挖掘與小麥莖稈強(qiáng)度相關(guān)的基因或QTL，開發(fā)可用于育種選擇的分子標(biāo)記或優(yōu)異等位變異，將有助于小麥抗倒伏性的遺傳改良。

本研究以126份小麥種質(zhì)為研究材料，基于三個環(huán)境(2011-2012、2012-2013和2013-2014年度)下的乳熟期莖稈強(qiáng)度表型值，利用盧 杰等[27]前期篩選的242對SSR標(biāo)記對其進(jìn)行基因分型，應(yīng)用混合線性模型(mixed linear model，MLM)檢測與小麥乳熟期莖稈強(qiáng)度緊密關(guān)聯(lián)的標(biāo)記位點(diǎn)，發(fā)掘相關(guān)位點(diǎn)的優(yōu)異等位變異，以期為小麥莖稈強(qiáng)度有關(guān)基因的克隆和抗倒伏分子育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

126份小麥種質(zhì)材料為新審定或新選育的中間品系，其中，黃淮南片麥區(qū)77份，黃淮北片麥區(qū)18份，長江中下游麥區(qū)17份，西南麥區(qū)10份，國外種質(zhì)4份。試驗分別于2011-2012、2012-2013和2013-2014年度種植于合肥高新技術(shù)農(nóng)業(yè)示范園(31.9′N，117.2′E)內(nèi)，2行區(qū)，行距0.25 m，行長2 m，2次重復(fù)，常規(guī)管理。

1.2 莖稈強(qiáng)度的測定

參照肖世和等[10]的方法，于小麥花后28 d(乳熟期)，使用莖稈強(qiáng)度儀(YYD-1A型)測定供試材料的莖稈強(qiáng)度，將莖稈強(qiáng)度儀顯示的峰值作為供試材料的莖稈強(qiáng)度值，莖稈強(qiáng)度值是五個單莖捆扎在一起的實測值，進(jìn)行3次重復(fù)。

1.3 分子標(biāo)記的篩選及其擴(kuò)增條件

利用242對多態(tài)性豐富且?guī)颓逦腟SR引物[27]用于后續(xù)分析。采用SDS法提取小麥基因組DNA。PCR擴(kuò)增體系為10 μL，包括模板DNA(50 ng·μL-1)2.0 μL，10×Buffer(含有 2.0 mmol·L-1Mg2+)1.0 μL，dNTPs(2.5 mmol·L-1) 0.8 μL，Taq DNA polymerase(5.0 μ·μL-1) 0.11 μL，上下游引物(10 μmol·L-1)各0.4 μL，ddH2O 5.29 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，48～62 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。利用高通量Tiling分析系統(tǒng)即毛細(xì)管電泳對PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測。

1.4 關(guān)聯(lián)分析及優(yōu)異等位變異發(fā)掘

參考Mackay等[28]的方法，對試驗材料進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)分析。運(yùn)用Structure軟件[29]混合模型來確定群體結(jié)構(gòu)，K值取1～10，單獨(dú)運(yùn)行6次，依據(jù)該運(yùn)行結(jié)果選擇適當(dāng)?shù)膩喨簲?shù)。

利用TASSLE軟件[30]中的MLM，將群體結(jié)構(gòu)分析所得的Q值和親緣關(guān)系K作為協(xié)變量，進(jìn)行性狀與標(biāo)記位點(diǎn)的關(guān)聯(lián)分析，統(tǒng)計顯著關(guān)聯(lián)標(biāo)記位點(diǎn)對表型變異的解釋率。參考文自翔等[31]的無效等位變異估算方法，計算與莖稈強(qiáng)度顯著關(guān)聯(lián)標(biāo)記位點(diǎn)等位變異的表型效應(yīng)，進(jìn)一步挖掘其優(yōu)異等位變異及其載體材料。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試材料莖稈強(qiáng)度的表型變異

從表1可以看出，2011-2012、2012-2013和2013-2014三個年度供試材料的莖稈強(qiáng)度變化范圍分別為0.51～3.07、0.51～3.54和 0.57～ 2.56 N，變異系數(shù)分別為34.0、27.7和26.7，說明供試材料的表型變異豐富。方差分析結(jié)果(表2)顯示，小麥莖稈強(qiáng)度受環(huán)境和基因型共同影響，且受環(huán)境的影響較大。進(jìn)一步對三個年度的莖稈強(qiáng)度值進(jìn)行相關(guān)分析，結(jié)果顯示，三個年度間的莖稈強(qiáng)度值互相均呈極顯著正相關(guān)，其中2011-2012年度與2012-2013年度間的相關(guān)系數(shù)為0.453，2011-2012年度與2013-2014年度間的相關(guān)系數(shù)為0.416，2012-2013年度與2013-2014年度間的相關(guān)系數(shù)為 0.428。綜上分析表明，小麥莖稈強(qiáng)度易受環(huán)境因素影響，但在不同年度間，不同試驗材料的莖稈強(qiáng)度表現(xiàn)出相對穩(wěn)定的趨勢。

表1 供試種質(zhì)材料莖稈強(qiáng)度的表型變異Table 1 Phenotype variation of stem strength of the tested wheat germplasm materials

表2 供試126份種質(zhì)材料莖稈強(qiáng)度的方差分析Table 2 ANOVA of stem strength in 126 wheat germplasm materials

2.2 群體結(jié)構(gòu)分析結(jié)果

利用Structure軟件對可能的K值模擬計算，利用K值與△K值作圖(圖1A)，發(fā)現(xiàn)在K=2時△K值最大。由圖1B可以看出，126份種質(zhì)材料被分為2個亞群，其中第1亞群(POP1)主要來自西南麥區(qū)和長江中下游麥區(qū)，共44份材料；第2亞群(POP2)主要來自黃淮南片麥區(qū)和黃淮北片麥區(qū)，共82份材料，說明這126份種質(zhì)材料的群體結(jié)構(gòu)較為簡單，可有效降低群體結(jié)構(gòu)對關(guān)聯(lián)分析的影響。K=2時生成的Q矩陣被用于莖稈強(qiáng)度性狀與標(biāo)記位點(diǎn)的關(guān)聯(lián)分析。

A：假定K值范圍從1到10計算超過6次的△K值；B：基于模型的126份小麥種質(zhì)材料的群體結(jié)構(gòu)。A:Calculated △K value over six runs with putative K ranging from 1 to 10; B:Model-based population structure for 126 wheat germplasm.圖1 126份小麥種質(zhì)材料的群體結(jié)構(gòu)分析Fig.1 Population structure analysis of the 126 wheat germplasm materials

2.3 莖稈強(qiáng)度相關(guān)分子標(biāo)記的鑒定結(jié)果

利用TASSLE軟件中的MLM對126份自然群體的基因型及不同年度的莖稈強(qiáng)度進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果(表3)表明，在2個或2個以上年度重復(fù)檢測到的顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)共37個，分布于1A(2個)、1B(1個)、2A(1個)、2B(5個)、2D(2個)、3B(1個)、3D(3個)、4A(3個)、4B(1個)、4D(2個)、5A(4個)、5B(3個)、5D(2個)、6A(1個)、6B(3個)、7D(3個)等16條染色體上。2011-2012、2012-2013和2013-2014三個年度與莖稈強(qiáng)度顯著關(guān)聯(lián)的標(biāo)記位點(diǎn)分別有28、29和25個，表型變異解釋率均大于10%的標(biāo)記位點(diǎn)分別有6、13和9個。有8個標(biāo)記位點(diǎn)在三個年度均能被檢測到，分別為wmc83、gwm539、wmc48、barc358、barc59、barc322、barc134和barc352，屬于穩(wěn)定 位點(diǎn)。

表3 與莖稈強(qiáng)度顯著關(guān)聯(lián)的標(biāo)記位點(diǎn)及其表型變異解釋率Table 3 Phenotype contribution of marker loci significantly associated with stem strength %

2.4 優(yōu)異等位變異分析結(jié)果

選取分布在2B、2D、5A、5B和6B染色體上表型解釋率在8%以上的5個穩(wěn)定位點(diǎn)(wmc83、gwm539、barc358、barc59 和barc134 )進(jìn)行等位變異分析，結(jié)果(圖2)表明，共發(fā)掘11個在三個年度莖稈強(qiáng)度均增加的優(yōu)異等位變異，分別為wmc83-A110、wmc83-A147、wmc83-A151、gwm539-A120、barc358-A179/161、barc358-A185/161、barc358-A185/179、barc358-A190/161、barc59-A182、barc59-A191和barc134-A194，其中barc134-A194等位變異的分布頻率最高(39.7%)，wmc83-A110的增效效應(yīng)最大，平均為0.80 N。此外，wmc83-Miss、wmc83-A155、gwm539-A125、gwm539-A152、barc358-A161、barc358-A179、barc358-A190/185、barc59-A167、barc134-A186、barc134-A191和barc134-A192等位變異在三個年度均降低莖稈強(qiáng)度，其中wmc83-A155等位變異的分布頻率最高 (34.1%)，barc358-A161的減效效應(yīng)最大，平均為-0.66 N。

括號內(nèi)數(shù)據(jù)為攜帶該位點(diǎn)品種的比例，單位為%。Values in brackets represent the percentage of varieties carrying the associated locus,and the unit is %.圖2 5個與莖稈強(qiáng)度顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)等位變異的表型效應(yīng)Fig.2 Phenotypic effect of allelic variation of the five loci which significantly associated with stem strength

統(tǒng)計分析上述11種優(yōu)異等位變異在供試材料中的分布，結(jié)果(表4)顯示，共116份種質(zhì)材料攜帶上述優(yōu)異等位變異，其中攜帶5、4、3、2和1種優(yōu)異等位變異的材料分別有2、12、21、42和39份，三個年度莖稈強(qiáng)度平均值分別為2.65、2.04、1.80、1.70和1.49 N；未攜帶上述優(yōu)異等位變異的材料有10份，平均莖稈強(qiáng)度為1.21 N。在122份國內(nèi)材料中(表5和表6)，黃淮南片麥區(qū)、黃淮北片麥區(qū)、長江中下游麥區(qū)和西南麥區(qū)的種質(zhì)材料中攜帶2(40.3%)、1(27.8%)、1 (35.3%)和4(50.0%)種優(yōu)異等位變異的分布頻率最高；僅西南麥區(qū)發(fā)現(xiàn)有聚合5種優(yōu)異等位變異的材料(渝0926和黔079984-14)。此外，攜帶4種及以上優(yōu)異等位變異的材料中，西南麥區(qū)材料中分布頻率最高(70.0%)，明顯高于其他三個麥區(qū)?？偟膩碚f，來自西南麥區(qū)的重要載體材料有內(nèi)麥10號、內(nèi)麥8號、黔079984-14、內(nèi)麥11號和渝0926，來自黃淮南片及北片麥區(qū)的重要載體材料有中麥1095、豫農(nóng)69、安農(nóng)0711和漯6099(表6)，這些載體材料可作為小麥莖稈強(qiáng)度遺傳改良改良的種質(zhì)資源。

表4 載體材料優(yōu)異等位變異分布及其莖稈強(qiáng)度Table 4 Distribution of elite alleles and stem strength of carrier materials

表5 不同麥區(qū)種質(zhì)材料中攜帶優(yōu)異等位變異數(shù)量的分布頻率Table 5 Distribution frequency of elite alleles in experimental materials from different wheat regions

3 討 論

本研究共檢測到37個與小麥莖稈強(qiáng)度顯著相關(guān)的位點(diǎn)，其中在多環(huán)境下穩(wěn)定檢測到的位點(diǎn)有8個，表明小麥莖稈強(qiáng)度是多基因控制的數(shù)量性狀，易受環(huán)境因素影響，與前人的研究結(jié)果一致[23,25-26]。本研究在5A和5B染色體上檢測到兩個穩(wěn)定位點(diǎn)，分別為barc358和barc59，Keller等[26]在5A和5B條染色體上也檢測到與莖稈強(qiáng)度相關(guān)的QTL，但由于所用的遺傳標(biāo)記不同，兩個研究中鑒定到的關(guān)聯(lián)位點(diǎn)是否相同，有待進(jìn)一步分析驗證。

多年多點(diǎn)的表型數(shù)據(jù)是提高關(guān)聯(lián)定位準(zhǔn)確性的重要策略，多個環(huán)境下均能檢測到的位點(diǎn)具有較高的可靠性[32]，具有一定的分析利用價值。本研究中有5個位點(diǎn)(wmc83、gwm539、barc358、barc59和barc134)在多個環(huán)境條件下表現(xiàn)穩(wěn)定，表型解釋率高，共包含11種優(yōu)異等位變異，且載體材料的莖稈強(qiáng)度隨著攜帶優(yōu)異等位類型數(shù)目的增多而增大，表現(xiàn)出一定的聚合效應(yīng)。因此，在小麥抗倒伏遺傳改良中，可通過聚合莖稈強(qiáng)度優(yōu)異等位變異而提高莖稈質(zhì)量。

本研究發(fā)現(xiàn)，不同麥區(qū)的試驗材料中優(yōu)異等位變異分布差別較大。來自西南麥區(qū)的材料聚合較多的優(yōu)異等位變異，莖稈強(qiáng)度較高，推測與本麥區(qū)獨(dú)特的大穗大粒品種類型有關(guān)，大部分該類品種莖稈粗壯，具有較好的莖稈質(zhì)量和強(qiáng)度；其中重要的載體材料有內(nèi)麥10號、內(nèi)麥8號、黔079984-14、內(nèi)麥11號和渝0926，三個年度其平均莖稈強(qiáng)度分別為2.68、2.64、2.63、2.43和2.09 N。本研究中增效效應(yīng)最大的優(yōu)異等位變異wmc83-A110分布在內(nèi)麥10號和黔079984-14材料中，這些載體材料可作為本區(qū)域小麥莖稈強(qiáng)度改良的重要資源。Zhang等[1,3]研究發(fā)現(xiàn)，60年代以來黃淮麥區(qū)主推小麥品種的莖稈強(qiáng)度呈顯著增長趨勢，表明在小麥株高處于適宜范圍時，本區(qū)域小麥抗倒伏育種目標(biāo)已從降低株高轉(zhuǎn)至增加莖稈強(qiáng)度。今后黃淮麥區(qū)小麥抗倒伏育種中仍應(yīng)以改良莖稈強(qiáng)度為主要育種目標(biāo)，聚合更多莖稈強(qiáng)度優(yōu)異等位變異，達(dá)到提高莖稈強(qiáng)度的目的。相比西南麥區(qū)，黃淮南片和北片麥區(qū)試驗材料中聚合4種優(yōu)異等位變異的分布頻率偏低，但本研究亦鑒定出中麥1095、豫農(nóng)69、安農(nóng)0711和漯6099共4份重要的載體材料，三個年度的平均莖稈強(qiáng)度分別為2.67、2.31、2.12和2.10 N；此外，上述試驗材料除聚合較多優(yōu)異等位變異外，還具有較好的經(jīng)濟(jì)和農(nóng)藝性狀，可作為本區(qū)域小麥莖稈強(qiáng)度改良的種質(zhì)資源。

4 結(jié) 論

本研究基于混合線性模型(MLM)，對多環(huán)境下126份小麥種質(zhì)材料的莖稈強(qiáng)度進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，得到5個穩(wěn)定標(biāo)記位點(diǎn)，發(fā)掘出11種優(yōu)異等位變異，且載體材料莖稈強(qiáng)度隨優(yōu)異等位變異聚合數(shù)目的增多而增大。內(nèi)麥10號、內(nèi)麥8號、黔079984-14、內(nèi)麥11號、渝0926、中麥1095、豫農(nóng)69、安農(nóng)0711和漯6099共9份材料聚合了4種及以上優(yōu)異等位變異，且莖稈強(qiáng)度較高，可作為相應(yīng)麥區(qū)小麥莖稈強(qiáng)度遺傳改良的種質(zhì)資源。