盧 杰 ,田勝明,王 勝,陳 璨,司紅起,常 成,馬傳喜
(安徽農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院/農(nóng)業(yè)部黃淮南部小麥生物學與遺傳育種重點實驗室,安徽合肥 230036)
隨著小麥產(chǎn)量的提高,其倒伏的風險也增大[1],小麥倒伏導致機械收割成本增加以及籽粒品質和商品性變差[2]。小麥生產(chǎn)中,莖稈倒伏是最常見的倒伏類型,主要發(fā)生在基部節(jié)間,與株高和莖稈強度顯著相關[3]。矮化育種使育成品種株高降低,抗倒性增強;但育種實踐表明,過分強調矮桿將會造成地上部生物量下降,最終影響產(chǎn)量,且矮化后的植株若莖稈質量較差仍會出現(xiàn)倒伏現(xiàn)象[4]。因而,育種實踐上小麥品種的抗倒伏策略應由原來的矮稈抗倒轉變?yōu)閴讯捒沟梗⒅厍o稈質量的改善與提高[1,3,5]。因此,研究小麥莖稈倒伏的遺傳機理,將有助于抗倒伏品種的培育。
確定合適的易倒測定時期及倒伏評價指標是進行小麥抗倒伏研究的關鍵。研究發(fā)現(xiàn),在乳熟期,小麥物質的生產(chǎn)和運輸比較旺盛,莖稈中大量結構物質被分解和轉移,是極易發(fā)生倒伏的時期[6]??沟狗笖?shù)[4]、莖稈斷裂力[7]、莖稈彈性[8]、田間自然倒伏[9]、莖稈強度[10]等可以用來評價小麥抗倒伏性。其中,田間自然倒伏觀察是小麥生產(chǎn)上最直接和常用的評價方法,但該方法易受環(huán)境因素制約,重復性差。采用抗倒伏指數(shù)和莖稈斷裂力兩個指標時,測量過程中需破壞莖稈。而莖稈強度評價指標具有不破壞小麥莖稈、重復性好等優(yōu)勢,且與小麥的抗倒伏性顯著正相關[10],是較理想的抗倒伏性評價指標之一。
研究發(fā)現(xiàn),除株高外,小麥莖稈基部的結構特征(節(jié)間長度、粗度和壁厚[10-12]以及維管束種類和數(shù)目[7,10,13])、木質素、纖維素和全糖含量[13-19]等均與小麥的抗倒伏性相關。國內外的研究學者對小麥抗倒伏遺傳機理進行了研究,Ma等[15-18]發(fā)現(xiàn),木質素含量與小麥抗倒伏性關系密切,并克隆了3個小麥木質素合成基因Ta-CCR1、Ta-COMT和Ta-CAD1。此外,一些與小麥莖稈抗倒伏性相關的QTL也有報道,其中,控制莖稈硬度的QTL位于3B和4D染色體上[20-21],控制基部第1節(jié)間長度的QTL位于2D和 4B染色體上[22],控制髓腔直徑的QTL位于1A和2D染色體上[23],控制莖粗的QTL位于3B染色體上[23],控制莖壁厚的QTL位于2D和3BL染色體上[23-24],控制莖稈強度的QTL位于1B、2A、3A、3B、4A、4D、5A、5B和5D染色體上[23,25-26]。上述研究表明,小麥抗倒伏相關性狀受多基因控制??梢?,進一步挖掘與小麥莖稈強度相關的基因或QTL,開發(fā)可用于育種選擇的分子標記或優(yōu)異等位變異,將有助于小麥抗倒伏性的遺傳改良。
本研究以126份小麥種質為研究材料,基于三個環(huán)境(2011-2012、2012-2013和2013-2014年度)下的乳熟期莖稈強度表型值,利用盧 杰等[27]前期篩選的242對SSR標記對其進行基因分型,應用混合線性模型(mixed linear model,MLM)檢測與小麥乳熟期莖稈強度緊密關聯(lián)的標記位點,發(fā)掘相關位點的優(yōu)異等位變異,以期為小麥莖稈強度有關基因的克隆和抗倒伏分子育種提供參考。
126份小麥種質材料為新審定或新選育的中間品系,其中,黃淮南片麥區(qū)77份,黃淮北片麥區(qū)18份,長江中下游麥區(qū)17份,西南麥區(qū)10份,國外種質4份。試驗分別于2011-2012、2012-2013和2013-2014年度種植于合肥高新技術農(nóng)業(yè)示范園(31.9′N,117.2′E)內,2行區(qū),行距0.25 m,行長2 m,2次重復,常規(guī)管理。
參照肖世和等[10]的方法,于小麥花后28 d(乳熟期),使用莖稈強度儀(YYD-1A型)測定供試材料的莖稈強度,將莖稈強度儀顯示的峰值作為供試材料的莖稈強度值,莖稈強度值是五個單莖捆扎在一起的實測值,進行3次重復。
利用242對多態(tài)性豐富且?guī)颓逦腟SR引物[27]用于后續(xù)分析。采用SDS法提取小麥基因組DNA。PCR擴增體系為10 μL,包括模板DNA(50 ng·μL-1)2.0 μL,10×Buffer(含有 2.0 mmol·L-1Mg2+)1.0 μL,dNTPs(2.5 mmol·L-1) 0.8 μL,Taq DNA polymerase(5.0 μ·μL-1) 0.11 μL,上下游引物(10 μmol·L-1)各0.4 μL,ddH2O 5.29 μL。PCR擴增程序:94 ℃預變性5 min;95 ℃變性30 s,48~62 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共35個循環(huán);72 ℃延伸10 min;4 ℃保存。利用高通量Tiling分析系統(tǒng)即毛細管電泳對PCR產(chǎn)物進行檢測。
參考Mackay等[28]的方法,對試驗材料進行遺傳結構分析。運用Structure軟件[29]混合模型來確定群體結構,K值取1~10,單獨運行6次,依據(jù)該運行結果選擇適當?shù)膩喨簲?shù)。
利用TASSLE軟件[30]中的MLM,將群體結構分析所得的Q值和親緣關系K作為協(xié)變量,進行性狀與標記位點的關聯(lián)分析,統(tǒng)計顯著關聯(lián)標記位點對表型變異的解釋率。參考文自翔等[31]的無效等位變異估算方法,計算與莖稈強度顯著關聯(lián)標記位點等位變異的表型效應,進一步挖掘其優(yōu)異等位變異及其載體材料。
從表1可以看出,2011-2012、2012-2013和2013-2014三個年度供試材料的莖稈強度變化范圍分別為0.51~3.07、0.51~3.54和 0.57~ 2.56 N,變異系數(shù)分別為34.0、27.7和26.7,說明供試材料的表型變異豐富。方差分析結果(表2)顯示,小麥莖稈強度受環(huán)境和基因型共同影響,且受環(huán)境的影響較大。進一步對三個年度的莖稈強度值進行相關分析,結果顯示,三個年度間的莖稈強度值互相均呈極顯著正相關,其中2011-2012年度與2012-2013年度間的相關系數(shù)為0.453,2011-2012年度與2013-2014年度間的相關系數(shù)為0.416,2012-2013年度與2013-2014年度間的相關系數(shù)為 0.428。綜上分析表明,小麥莖稈強度易受環(huán)境因素影響,但在不同年度間,不同試驗材料的莖稈強度表現(xiàn)出相對穩(wěn)定的趨勢。
表1 供試種質材料莖稈強度的表型變異Table 1 Phenotype variation of stem strength of the tested wheat germplasm materials
表2 供試126份種質材料莖稈強度的方差分析Table 2 ANOVA of stem strength in 126 wheat germplasm materials
利用Structure軟件對可能的K值模擬計算,利用K值與△K值作圖(圖1A),發(fā)現(xiàn)在K=2時△K值最大。由圖1B可以看出,126份種質材料被分為2個亞群,其中第1亞群(POP1)主要來自西南麥區(qū)和長江中下游麥區(qū),共44份材料;第2亞群(POP2)主要來自黃淮南片麥區(qū)和黃淮北片麥區(qū),共82份材料,說明這126份種質材料的群體結構較為簡單,可有效降低群體結構對關聯(lián)分析的影響。K=2時生成的Q矩陣被用于莖稈強度性狀與標記位點的關聯(lián)分析。
A:假定K值范圍從1到10計算超過6次的△K值;B:基于模型的126份小麥種質材料的群體結構。A:Calculated △K value over six runs with putative K ranging from 1 to 10; B:Model-based population structure for 126 wheat germplasm.圖1 126份小麥種質材料的群體結構分析Fig.1 Population structure analysis of the 126 wheat germplasm materials
利用TASSLE軟件中的MLM對126份自然群體的基因型及不同年度的莖稈強度進行關聯(lián)分析,結果(表3)表明,在2個或2個以上年度重復檢測到的顯著關聯(lián)位點共37個,分布于1A(2個)、1B(1個)、2A(1個)、2B(5個)、2D(2個)、3B(1個)、3D(3個)、4A(3個)、4B(1個)、4D(2個)、5A(4個)、5B(3個)、5D(2個)、6A(1個)、6B(3個)、7D(3個)等16條染色體上。2011-2012、2012-2013和2013-2014三個年度與莖稈強度顯著關聯(lián)的標記位點分別有28、29和25個,表型變異解釋率均大于10%的標記位點分別有6、13和9個。有8個標記位點在三個年度均能被檢測到,分別為wmc83、gwm539、wmc48、barc358、barc59、barc322、barc134和barc352,屬于穩(wěn)定 位點。
表3 與莖稈強度顯著關聯(lián)的標記位點及其表型變異解釋率Table 3 Phenotype contribution of marker loci significantly associated with stem strength %
選取分布在2B、2D、5A、5B和6B染色體上表型解釋率在8%以上的5個穩(wěn)定位點(wmc83、gwm539、barc358、barc59 和barc134 )進行等位變異分析,結果(圖2)表明,共發(fā)掘11個在三個年度莖稈強度均增加的優(yōu)異等位變異,分別為wmc83-A110、wmc83-A147、wmc83-A151、gwm539-A120、barc358-A179/161、barc358-A185/161、barc358-A185/179、barc358-A190/161、barc59-A182、barc59-A191和barc134-A194,其中barc134-A194等位變異的分布頻率最高(39.7%),wmc83-A110的增效效應最大,平均為0.80 N。此外,wmc83-Miss、wmc83-A155、gwm539-A125、gwm539-A152、barc358-A161、barc358-A179、barc358-A190/185、barc59-A167、barc134-A186、barc134-A191和barc134-A192等位變異在三個年度均降低莖稈強度,其中wmc83-A155等位變異的分布頻率最高 (34.1%),barc358-A161的減效效應最大,平均為-0.66 N。
括號內數(shù)據(jù)為攜帶該位點品種的比例,單位為%。Values in brackets represent the percentage of varieties carrying the associated locus,and the unit is %.圖2 5個與莖稈強度顯著關聯(lián)位點等位變異的表型效應Fig.2 Phenotypic effect of allelic variation of the five loci which significantly associated with stem strength
統(tǒng)計分析上述11種優(yōu)異等位變異在供試材料中的分布,結果(表4)顯示,共116份種質材料攜帶上述優(yōu)異等位變異,其中攜帶5、4、3、2和1種優(yōu)異等位變異的材料分別有2、12、21、42和39份,三個年度莖稈強度平均值分別為2.65、2.04、1.80、1.70和1.49 N;未攜帶上述優(yōu)異等位變異的材料有10份,平均莖稈強度為1.21 N。在122份國內材料中(表5和表6),黃淮南片麥區(qū)、黃淮北片麥區(qū)、長江中下游麥區(qū)和西南麥區(qū)的種質材料中攜帶2(40.3%)、1(27.8%)、1 (35.3%)和4(50.0%)種優(yōu)異等位變異的分布頻率最高;僅西南麥區(qū)發(fā)現(xiàn)有聚合5種優(yōu)異等位變異的材料(渝0926和黔079984-14)。此外,攜帶4種及以上優(yōu)異等位變異的材料中,西南麥區(qū)材料中分布頻率最高(70.0%),明顯高于其他三個麥區(qū)??偟膩碚f,來自西南麥區(qū)的重要載體材料有內麥10號、內麥8號、黔079984-14、內麥11號和渝0926,來自黃淮南片及北片麥區(qū)的重要載體材料有中麥1095、豫農(nóng)69、安農(nóng)0711和漯6099(表6),這些載體材料可作為小麥莖稈強度遺傳改良改良的種質資源。
表4 載體材料優(yōu)異等位變異分布及其莖稈強度Table 4 Distribution of elite alleles and stem strength of carrier materials
表5 不同麥區(qū)種質材料中攜帶優(yōu)異等位變異數(shù)量的分布頻率Table 5 Distribution frequency of elite alleles in experimental materials from different wheat regions
本研究共檢測到37個與小麥莖稈強度顯著相關的位點,其中在多環(huán)境下穩(wěn)定檢測到的位點有8個,表明小麥莖稈強度是多基因控制的數(shù)量性狀,易受環(huán)境因素影響,與前人的研究結果一致[23,25-26]。本研究在5A和5B染色體上檢測到兩個穩(wěn)定位點,分別為barc358和barc59,Keller等[26]在5A和5B條染色體上也檢測到與莖稈強度相關的QTL,但由于所用的遺傳標記不同,兩個研究中鑒定到的關聯(lián)位點是否相同,有待進一步分析驗證。
多年多點的表型數(shù)據(jù)是提高關聯(lián)定位準確性的重要策略,多個環(huán)境下均能檢測到的位點具有較高的可靠性[32],具有一定的分析利用價值。本研究中有5個位點(wmc83、gwm539、barc358、barc59和barc134)在多個環(huán)境條件下表現(xiàn)穩(wěn)定,表型解釋率高,共包含11種優(yōu)異等位變異,且載體材料的莖稈強度隨著攜帶優(yōu)異等位類型數(shù)目的增多而增大,表現(xiàn)出一定的聚合效應。因此,在小麥抗倒伏遺傳改良中,可通過聚合莖稈強度優(yōu)異等位變異而提高莖稈質量。
本研究發(fā)現(xiàn),不同麥區(qū)的試驗材料中優(yōu)異等位變異分布差別較大。來自西南麥區(qū)的材料聚合較多的優(yōu)異等位變異,莖稈強度較高,推測與本麥區(qū)獨特的大穗大粒品種類型有關,大部分該類品種莖稈粗壯,具有較好的莖稈質量和強度;其中重要的載體材料有內麥10號、內麥8號、黔079984-14、內麥11號和渝0926,三個年度其平均莖稈強度分別為2.68、2.64、2.63、2.43和2.09 N。本研究中增效效應最大的優(yōu)異等位變異wmc83-A110分布在內麥10號和黔079984-14材料中,這些載體材料可作為本區(qū)域小麥莖稈強度改良的重要資源。Zhang等[1,3]研究發(fā)現(xiàn),60年代以來黃淮麥區(qū)主推小麥品種的莖稈強度呈顯著增長趨勢,表明在小麥株高處于適宜范圍時,本區(qū)域小麥抗倒伏育種目標已從降低株高轉至增加莖稈強度。今后黃淮麥區(qū)小麥抗倒伏育種中仍應以改良莖稈強度為主要育種目標,聚合更多莖稈強度優(yōu)異等位變異,達到提高莖稈強度的目的。相比西南麥區(qū),黃淮南片和北片麥區(qū)試驗材料中聚合4種優(yōu)異等位變異的分布頻率偏低,但本研究亦鑒定出中麥1095、豫農(nóng)69、安農(nóng)0711和漯6099共4份重要的載體材料,三個年度的平均莖稈強度分別為2.67、2.31、2.12和2.10 N;此外,上述試驗材料除聚合較多優(yōu)異等位變異外,還具有較好的經(jīng)濟和農(nóng)藝性狀,可作為本區(qū)域小麥莖稈強度改良的種質資源。
本研究基于混合線性模型(MLM),對多環(huán)境下126份小麥種質材料的莖稈強度進行關聯(lián)分析,得到5個穩(wěn)定標記位點,發(fā)掘出11種優(yōu)異等位變異,且載體材料莖稈強度隨優(yōu)異等位變異聚合數(shù)目的增多而增大。內麥10號、內麥8號、黔079984-14、內麥11號、渝0926、中麥1095、豫農(nóng)69、安農(nóng)0711和漯6099共9份材料聚合了4種及以上優(yōu)異等位變異,且莖稈強度較高,可作為相應麥區(qū)小麥莖稈強度遺傳改良的種質資源。