李良平 馮 剛 歐陽理權(quán) 周雪華 姜 燦 張勝初

(三峽大學(xué) 第一臨床醫(yī)學(xué)院[宜昌市中心人民醫(yī)院] 甲乳外科， 湖北 宜昌 443003)

國際癌癥研究機(jī)構(gòu)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，2020年乳腺癌成為全球發(fā)病第一的腫瘤，約占所有腫瘤總數(shù)的11.8%，其根本原因之一是乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)因素不斷變化[1-2]。乳腺癌的治療理念是個(gè)性化治療以及基于腫瘤生物學(xué)和早期治療反應(yīng)的降級(jí)和升級(jí)治療[3]。在分子水平上乳腺癌是一種異質(zhì)性疾病，治療策略因分子亞型而異，其發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜。因此，對(duì)乳腺癌發(fā)病機(jī)制的分子生物學(xué)研究有可能為乳腺癌的治療及預(yù)后評(píng)估提供新的方向。

RNA結(jié)合蛋白8A(RBM8A，Y14)是RNA結(jié)合蛋白家族的一員，包含一個(gè)RNA結(jié)合基因序列，與Magoh形成緊密的異二聚體，是外顯子連接復(fù)合體(exon-junction complex，EJC) RNA監(jiān)視機(jī)制的核心結(jié)構(gòu)[4-5]。RBM8A在mRNA代謝過程中如剪接、mRNA輸出和無義介導(dǎo)mRNA降解中起重要作用。RBM8A與RNA轉(zhuǎn)錄、翻譯、細(xì)胞周期調(diào)控和凋亡調(diào)控、DNA損傷修復(fù)密切相關(guān)[5-9]。研究表明RBM8A在各種漸進(jìn)性神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮作用，RBM8A的低表達(dá)與自噬中關(guān)鍵復(fù)合物組件的減少可能在阿爾茨海默氏癥(alzheimer's disease，AD)病理生理變化中起到重要作用[10-11]。在遺傳性疾病血小板減少伴橈骨缺失綜合征中也觀察到RBM8A基因的突變及異常表達(dá)[9,12-13]。同時(shí)，RBM8A在多種惡性腫瘤中也有異常表達(dá)。研究表明RBM8A在肝癌、胃癌、膠質(zhì)細(xì)胞瘤中均促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖及侵襲[14-17]，但在乳腺癌中相關(guān)研究未見報(bào)道。

在本研究中，我們通過腫瘤基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas，TCGA)和各種公共數(shù)據(jù)庫研究了乳腺癌患者RBM8A的表達(dá)、突變以及與臨床病理特征的關(guān)系，多維度分析乳腺癌中與RBM8A相關(guān)的基因改變、功能網(wǎng)絡(luò)及相關(guān)作用機(jī)制，以期為乳腺癌的診斷和治療提供新的靶點(diǎn)和策略。

1 材料和方法

1.1 RBM8A基因表達(dá)分析

RBM8A在泛癌中轉(zhuǎn)錄組水平表達(dá)通過TIMER數(shù)據(jù)庫(https：//cistrome.shinyapps.io/timer/)、GEPIA數(shù)據(jù)庫(http://gepia.cancer-pku.cn/index.html)聯(lián)合分析。通過UALCAN(http://ualcan.path.uab.edu)分析TCGA數(shù)據(jù)(https://portal.gdc.cancer.gov/)，探索RBM8A在乳腺癌組織和正常組織中的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)水平及與臨床特征之間關(guān)系，RBM8A在乳腺癌組織中蛋白表達(dá)通過HPA數(shù)據(jù)庫(http://www.proteinatlas.org)分析。

1.2 生存分析

Kaplan-Meier數(shù)據(jù)庫(http://kmplot.com/analysis/)分析RBM8A在乳腺癌中生存曲線，通過PrognoScan數(shù)據(jù)庫予以驗(yàn)證(http://dna00.bio.kyutech.ac.jp/PrognoScan/)。

1.3 RBM8A相關(guān)基因分析

本研究中使用LinkedOmics數(shù)據(jù)庫(http://www.linkedomics)、cBioPortal、GEPIA綜合分析RBM8A共表達(dá)基因，Pearson's相關(guān)系數(shù)對(duì)RBM8A共表達(dá)基因進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.4 GO、KEGG分析

使用Metascape數(shù)據(jù)庫(http://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)對(duì)RBM8A及共表達(dá)基因本體生物學(xué)過程(gene ontology，GO)、基因信號(hào)通路(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)進(jìn)行富集分析及蛋白網(wǎng)絡(luò)分析，通過Cytoscape 3.8.2軟件分析和鑒定互作蛋白中核心模塊。

1.5 腫瘤免疫浸潤相關(guān)性分析

TISIDB是評(píng)估腫瘤免疫系統(tǒng)相互作用的在線數(shù)據(jù)庫(http://cis.hku.hk/TISIDB)。采用TISIDB來分析RBM8A和腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(tumor-infiltrating lymphocytes，TILs)在乳腺癌中的表達(dá)相關(guān)性。在基因表達(dá)譜的基礎(chǔ)上，利用基因集變異分析來推斷TILs的相對(duì)豐度。Spearman分析RBM8A與TILs之間的相關(guān)性。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

RBM8A表達(dá)水平不同組間差異采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或多組間兩兩比較的Dunnett-t檢驗(yàn)，P<0.05表明有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。乳腺癌患者總生存期(overall survival，OS)和無復(fù)發(fā)生存期(relapse free survival，RFS)以RBM8A基因的中位表達(dá)水平分組，Kaplan-Meier曲線和Log-Rank用于比較生存時(shí)間差異。生存分析采用R包Survival和Survminer軟件包進(jìn)行。功能網(wǎng)絡(luò)核心基因分析采用Cytoscape軟件中MCODE模塊分析。

2 結(jié)果

2.1 RBM8A在泛癌中的表達(dá)

通過TIMER及GEPIA數(shù)據(jù)庫研究RBM8A在各類惡性腫瘤中轉(zhuǎn)錄組表達(dá)水平，結(jié)果顯示RBM8A在膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管癌、結(jié)腸癌、食管癌、頭頸鱗狀細(xì)胞癌、腎癌、肝細(xì)胞肝癌、肺癌、胃癌、甲狀腺癌、皮膚黑色素瘤、子宮內(nèi)膜癌中升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，在前列腺癌、直腸癌中無差異表達(dá)，其中在腎嫌色細(xì)胞癌、甲狀腺癌中RBM8A表達(dá)量下降(P<0.001)，其它惡性腫瘤組織中均表現(xiàn)為高表達(dá)，在乳腺癌各亞型腫瘤中均提示高表達(dá)(P<0.001)，表明RBM8A在多種惡性腫瘤組織中可能存在促進(jìn)腫瘤發(fā)展的作用，見圖1。

注：A：RBM8A在泛癌中的表達(dá)量(TIMER數(shù)據(jù)庫)； B：RBM8A在泛癌中的表達(dá)量(GEPIA數(shù)據(jù)庫)圖1 RBM8A在泛癌中的表達(dá)量

2.2 RBM8A表達(dá)與乳腺癌的臨床病理特征關(guān)系

UALCAN數(shù)據(jù)庫分析RBM8A在乳腺癌中的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)水平，并分析其表達(dá)與乳腺癌亞型、腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床特征的相關(guān)性，見圖2。結(jié)果顯示，與正常乳腺組織相比，RBM8A在乳腺癌組織中高表達(dá)；且RBM8A在Luminal型、HER-2陽性、三陰性乳腺癌中，在不同腫瘤分期中，在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移不同階段中，其表達(dá)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P<0.05)(圖2A～2D)。HPA在線數(shù)據(jù)庫分析RBM8A在乳腺癌及乳腺正常組織中的蛋白表達(dá)情況顯示，RBM8A蛋白在乳腺正常組織中為中等陽性染色，而在乳腺癌組織中為強(qiáng)陽性染色(圖2E和2F)。表明乳腺癌腫瘤組織中RBM8A在轉(zhuǎn)錄組水平、蛋白水平均為高表達(dá)，且與腫瘤亞型、分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床特征因素具有相關(guān)性。

注：A：RBM8A在乳腺癌與正常組織中的表達(dá)量；B：RBM8A與乳腺癌分型相關(guān)性；C：RBM8A與乳腺癌分期相關(guān)性；D：RBM8A與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)性；E：RBM8A在乳腺癌組織中蛋白表達(dá)(50×)；F：RBM8A在乳腺正常組織中蛋白表達(dá)(50×)；與Normal組相比，***P<0.05圖2 RBM8A表達(dá)與乳腺癌臨床病理特征相關(guān)性

2.3 RBM8A表達(dá)與乳腺癌預(yù)后關(guān)系

通過PrognoScan、Kaplan-Meier plotter分析RBM8A在乳腺癌患者中的臨床預(yù)后意義，其中PrognoScan網(wǎng)站分析數(shù)據(jù)來源于GEO數(shù)據(jù)庫，Kaplan-Meier plotter網(wǎng)站分析數(shù)據(jù)來源于TCGA數(shù)據(jù)庫，見圖3。結(jié)果顯示，在GSE1227數(shù)據(jù)集中RBM8A高表達(dá)組乳腺癌患者RFS顯著低于低表達(dá)組患者(HR=2.01，P=0.000 138)(圖3A)，在GSE9893數(shù)據(jù)集中RBM8A高表達(dá)組OS顯著低于低表達(dá)組(HR=1.36，P=0.001 342)(圖3B)。通過Kaplan-Meier plotter分析，我們得到同樣的結(jié)果，RBM8A高表達(dá)組RFS(HR=1.45，P=6.4×10-13)、OS(HR=1.39，P=0.000 56))(圖3C和3D)均顯著低于低表達(dá)組患者。

注：A：Kaplan-Meier曲線分析GSE1227數(shù)據(jù)集中RBM8A與乳腺癌患者無復(fù)發(fā)生存期(RFS)的關(guān)系； B：Kaplan-Meier曲線分析GSE9893數(shù)據(jù)集中RBM8A與乳腺癌患者總生存期(OS)的關(guān)系；C：Kaplan-Meier曲線分析TCGA數(shù)據(jù)RBM8A與乳腺癌患者無復(fù)發(fā)生存期(RFS)的關(guān)系；D：Kaplan-Meier曲線分析TCGA數(shù)據(jù)RBM8A與乳腺癌患者總生存期(OS)的關(guān)系圖3 RBM8A在乳腺癌患者中的生存曲線

2.4 RBM8A及共表達(dá)基因功能富集及蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析

通過LinkedOmics、cBioPortal、GEPIA數(shù)據(jù)庫分析，分別得到與RBM8A在乳腺癌中共表達(dá)基因，3個(gè)數(shù)據(jù)庫取交集共得到180個(gè)共表達(dá)基因(圖4A)。Metascape數(shù)據(jù)庫對(duì)RBM8A共表達(dá)基因行功能富集分析及基因網(wǎng)絡(luò)分析。功能富集GO分析發(fā)現(xiàn)，RBM8A及其共表達(dá)基因參與了細(xì)胞有絲分裂周期的相變、DNA復(fù)制、蛋白-DNA復(fù)合體亞基組織、DNA代謝調(diào)節(jié)、染色質(zhì)重塑、有絲分裂胞質(zhì)分裂、DNA修復(fù)、著絲粒組織、細(xì)胞器正性調(diào)控、細(xì)胞周期正性調(diào)控、端粒的穩(wěn)定等生物學(xué)功能(圖4B)。功能富集KEGG分析發(fā)現(xiàn)RBM8A參與了細(xì)胞周期、FOXM1信號(hào)通路、RNA代謝、MYC信號(hào)通路、PLK1信號(hào)通路、驅(qū)動(dòng)蛋白等信號(hào)通路的調(diào)控(圖4B)。通過對(duì)RBM8A上游驅(qū)動(dòng)因子分析發(fā)現(xiàn)，RBM8A及共表達(dá)基因可能受TP53、E2F1、MYC、MYCN、E2F4、EP300等轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控(圖4C)。Metascape通過計(jì)算富集通路之間的相似度，通路之間相似度>0.3就會(huì)給這2個(gè)通路1條邊，用網(wǎng)絡(luò)圖的形式展示富集通路之間的關(guān)系(圖4D)。蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction networks，PPI)展示了蛋白的互作情況，并同時(shí)通過MCODE算法對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行聚類，識(shí)別其中緊密聯(lián)系的子網(wǎng)絡(luò)，我們發(fā)現(xiàn)RBM8A、SNRPG、MAGOH、DHX9、HNRNPA3、LSM2、SNRPE、SF3B4、ELAVL1、SNRPD1、PRCC處于同一個(gè)子網(wǎng)絡(luò)中(圖4E和4F)。

2.5 RBM8A與乳腺癌腫瘤免疫浸潤細(xì)胞相關(guān)性分析

我們通過TISIDB數(shù)據(jù)庫評(píng)估了RBM8A在乳腺癌中表達(dá)與28種腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞TILs的相關(guān)性。泛癌組織中RBM8A表達(dá)與28種TILs之間的相關(guān)性熱圖見圖5A。RBM8A表達(dá)與激活CD4+T細(xì)胞(r=0.14，P=3.4×10-6)正相關(guān)，與中性粒細(xì)胞(r=-0.262，P=1.44×10-18)、Th1細(xì)胞(r=-0.288，P=1.99×10-22)、巨噬細(xì)胞(r=-0.311，P<2.2×10-16)、自然殺傷細(xì)胞(r=-0.294，P=1.56×10-23)和Treg細(xì)胞(r=-0.249，P=6.1×10-17)顯著負(fù)相關(guān)，與激活CD8+T細(xì)胞無明顯相關(guān)(見圖5B～5H)。

注：A：RBM8A在LinkedOmics、cBioPortal、GEPIA數(shù)據(jù)庫中共表達(dá)基因交集； B：RBM8A及共表達(dá)基因GO、KEGG分析；C：RBM8A及共表達(dá)基因與轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)性分析；D：RBM8A及共表達(dá)基因富集分析網(wǎng)絡(luò)圖；E：RBM8A及共表達(dá)基因PPI網(wǎng)絡(luò)；F：RBM8A及共表達(dá)基因核心基因網(wǎng)絡(luò)圖4 RBM8A及共表達(dá)基因GO、KEGG及蛋白網(wǎng)絡(luò)分析

注：A：RBM8A在泛癌中與TILs表達(dá)相關(guān)性熱圖； B：RBM8A在乳腺癌中與激活CD4+T細(xì)胞相關(guān)性；C：RBM8A在乳腺癌中與中性粒細(xì)胞相關(guān)性；D：RBM8A在乳腺癌中與Th1細(xì)胞相關(guān)性；E：RBM8A在乳腺癌中與激活CD8+T細(xì)胞相關(guān)性；F：RBM8A在乳腺癌中與巨噬細(xì)胞相關(guān)性；G：RBM8A在乳腺癌中與NK細(xì)胞相關(guān)性；H：RBM8A在乳腺癌中與Treg細(xì)胞相關(guān)性圖5 RBM8A在乳腺癌中與TILs的相關(guān)性

3 討論

RBM8A在mRNA代謝中起重要作用，RBM8A基因突變或異常表達(dá)會(huì)導(dǎo)致生理異常，并可能導(dǎo)致惡性腫瘤發(fā)生[7]。研究發(fā)現(xiàn)，RBM8A下調(diào)可導(dǎo)致細(xì)胞G2/M期停滯、DNA損傷和細(xì)胞凋亡[18]。目前越來越多的研究證明RBM8A在多種惡性腫瘤中異常表達(dá)，并可能成為潛在預(yù)后標(biāo)志物。在肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)中RBM8A異常過度表達(dá)并參與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，并通過組蛋白去乙酰化酶9介導(dǎo)HCC中奧沙利鉑耐藥性的調(diào)節(jié)，RBM8A及其相關(guān)調(diào)控途徑可成為HCC中RBM8A耐藥性和治療的潛在靶點(diǎn)[19]。研究發(fā)現(xiàn)RBM8A mRNA和蛋白與結(jié)腸癌腫瘤大小、浸潤深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，RBM8A表達(dá)增加或淋巴結(jié)陽性的患者總體生存率較低，說明RBM8A在結(jié)腸腺癌的生存預(yù)測(cè)和治療中可能是一個(gè)有前景的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)[16]。RBM8A可通過激活膠質(zhì)母細(xì)胞中的Notch/STAT3信號(hào)通路來促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞的增殖和遷移，表明RBM8A可作為治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的潛在治療靶點(diǎn)[17]。然而，RBM8A在乳腺癌中的預(yù)后價(jià)值仍未見相關(guān)報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常乳腺組織相比，RBM8A mRNA及蛋白在乳腺癌組織中的表達(dá)水平顯著升高，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期呈正相關(guān)，這提示RBM8A參與了乳腺癌的發(fā)生發(fā)展。PrognoScan、Kaplan-Meier plotter分析發(fā)現(xiàn)，RBM8A高表達(dá)乳腺癌患者的RFS、OS較低表達(dá)組均明顯減低?；谝陨涎芯繑?shù)據(jù)，我們認(rèn)為RBM8A可能成為乳腺癌預(yù)后預(yù)測(cè)的生物標(biāo)志物。

功能富集及蛋白網(wǎng)絡(luò)分析有助于我們研究RBM8A在乳腺癌中的蛋白、轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)而預(yù)測(cè)其作用機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)RBM8A參與了細(xì)胞有絲分裂周期的相變、DNA復(fù)制、DNA代謝調(diào)節(jié)、染色質(zhì)重塑、胞質(zhì)分裂、DNA修復(fù)、細(xì)胞周期正性調(diào)控、端粒的穩(wěn)定等生物學(xué)功能。KEGG分析發(fā)現(xiàn)其參與了細(xì)胞周期、FOXM1信號(hào)通路、RNA代謝、MYC信號(hào)通路等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。在上游作用機(jī)制分析中，我們發(fā)現(xiàn)RBM8A可能與TP53、E2F1、MYC等轉(zhuǎn)錄因子相互作用。

MYC蛋白是一個(gè)具有螺旋-環(huán)-螺旋/亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，是細(xì)胞增殖、代謝、分化和凋亡的關(guān)鍵調(diào)控因子，參與了多種惡性腫瘤的發(fā)生[20]。MYC是許多基因激活和抑制的靶點(diǎn)，其表達(dá)與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子的激活有關(guān)，MYC通過抑制p27Kip1的轉(zhuǎn)錄促進(jìn)細(xì)胞增殖。此外，MYC通過激活cyclin D1、Cdk4、E2F1和E2F2促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程[21-22]。乳腺癌中MYC的失調(diào)涉及多種機(jī)制，包括基因擴(kuò)增、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、mRNA和蛋白質(zhì)穩(wěn)定，這與腫瘤抑制因子的缺失和致癌途徑的激活相關(guān)。本研究中，通過信號(hào)通路及轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)分析，我們推測(cè)RBM8A可能與MYC轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，激活下游通路從而促進(jìn)乳腺癌腫瘤細(xì)胞增殖。

腫瘤免疫微環(huán)境(tumor immune microenvironment，TIME)在腫瘤發(fā)展過程中起重要作用，在腫瘤免疫治療中起核心作用，TILs是TIME中非常有價(jià)值的指標(biāo)，它在腫瘤發(fā)展中呈動(dòng)態(tài)變化[23]。TILs已被證明在三陰性和HER-2過表達(dá)的乳腺癌中具有潛在的預(yù)后預(yù)測(cè)價(jià)值[24-26]。本研究發(fā)現(xiàn)RBM8A在乳腺癌中與CD4+T細(xì)胞正相關(guān)，與中性粒細(xì)胞、Th1細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和Treg細(xì)胞負(fù)相關(guān)，說明RBM8A與腫瘤免疫細(xì)胞浸潤密切相關(guān)，也是乳腺癌發(fā)病機(jī)制之一。

本項(xiàng)研究仍有一定局限性。首先，RBM8A表達(dá)對(duì)乳腺癌預(yù)后的影響以及相關(guān)機(jī)制研究均基于在線公共數(shù)據(jù)庫，需要進(jìn)一步驗(yàn)證這些結(jié)論。第二，本研究未探討RBM8A影響乳腺癌免疫微環(huán)境的詳細(xì)機(jī)制，需要體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探索。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)RBM8A可以作為乳腺癌臨床預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)記物，并且與乳腺癌免疫細(xì)胞浸潤有關(guān)，可能是潛在的免疫治療靶點(diǎn)。