吳克勤，許海艷，吳遠波，彭珊珊，張 鴻，張瑜娟

(1.江西省醫(yī)學(xué)科學(xué)院；2a.南昌大學(xué)研究生院醫(yī)學(xué)部2019級；2b.南昌大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫教研室，江西 南昌30063)

引言

惡性腫瘤也稱癌癥，在全球范圍內(nèi)，癌癥是引起人類死亡的三大殺手之一，如何提高癌癥的治療效果，延長患者的生存時間，改善患者的生活質(zhì)量成為癌癥治療的世界性問題。癌癥的治療主要有手術(shù)、放療和化療，其中化學(xué)藥物治療(化療)已經(jīng)成為癌癥治療的首選。然而化療靶向性差，毒副作用嚴重，而且長期使用容易產(chǎn)生耐藥性，極大地限制了其治療劑量從而阻礙了藥物的使用和療效。腫瘤靶向藥物傳遞系統(tǒng)可以改善治療效果和全身毒性問題。因此，通過設(shè)計高效的藥物靶向輸送系統(tǒng)，來改善化療對癌癥的治療效果[1-3]。

金納米棒(Gold nanorod，GNR)是尺度從幾納米到幾百納米的棒狀金顆粒。GNR具有良好的可控的表面化學(xué)性質(zhì)和可修飾性，通過表面修飾不同的靶向部分和運載各種藥物分子(如siRNA等)，可以增強腫瘤細胞的攝取從而加強對癌細胞的殺滅效果[4，5]。作為納米材料，金納米棒有獨特的光學(xué)性質(zhì)、表面多功能修飾性、化學(xué)惰性以及良好的生物相容性，已經(jīng)廣泛用于藥物載體、細胞成像、腫瘤診斷、光熱治療等研究中[6，7]。

甘露糖受體在部分腫瘤細胞表面高表達，在正常細胞中卻較少，因此癌細胞表面高表達的甘露糖受體為抗腫瘤靶向藥物提供了新靶點。將甘露糖分子修飾到藥物載體表面能夠識別癌細胞表面高表達的甘露糖受體從而實現(xiàn)靶向藥物輸送[8，9]。

1 實驗部分

1.1 試劑和儀器

實驗中所使用的藥品和溶劑均為分析純級別，無需進一步純化。十六烷基溴化銨(CTAB)，硼氫化鈉(NaBH4)，氯金酸(HAuCl4·3H2O)，聚乙烯亞胺(PEI)，巰基十一酸(MUA)和甘露糖均為國藥集團上?；瘜W(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。用四甲基硅烷(TMS)作為內(nèi)標，重水作為溶劑，使用Bruker AVANCE NEO 500 MHz FT-NMR Spectrometer(500 MHz)光譜儀來進行NMR光譜圖的記錄。馬爾文公司ZETASIZER NANO測量了修飾后金納米棒表面電位。日本電子公司JEM-210003040700測量金納米棒尺寸。安捷倫科技有限公司Cary10003040425進行紫外-可見吸收光譜圖的記錄。

1.2 合成部分

1.2.1 GNR-CTAB的制備

根據(jù)經(jīng)典的金種子溶液生長法，合成研究所需的金納米棒溶液。種子溶液的制備：取7.5 mL CTAB溶液于瓶中，向其中加入250 μLHAuCl4·3H2O(10 mM)，控制體系溫度在28 ℃左右。吸取600 μL提前制好、-20 ℃預(yù)冷的NaBH4(10 mmol/L)慢慢加入到上述HAuCl4溶液中，溶液逐漸變?yōu)椴枭?，即為種子溶液，將種子溶液放到28 ℃水浴鍋中靜置2 hrs。生長溶液的制備：取單口圓底燒瓶，加入100 mL CTAB水溶液(100 mmol/L)，置于30 ℃水浴鍋中，繼續(xù)加入4.25 mL HAuCl4·3H2O(10 mM)攪拌1 min，后加入0.625 mL AgNO3(10 mmol/L)，恒溫攪拌5 min，溶液顏色不變。向上述溶液中加入抗壞血酸0.675 mL(100 mmol/L)，無顏色變化，呈透明，恒溫攪拌5 min。取0.5 mL種子溶液慢慢加入到上述溶液中，溶液由透明漸漸加深至紫黑色，恒溫攪拌24 hrs，即得金納米棒(GNR-CTAB)溶液。

GNR-CTAB的表征：將合成的金納米棒溶液12000 rpm，10 min，離心2遍，用三蒸水重懸，用于測GNR-CTAB的TEM。

1.2.2 MUA-PEI(水溶液)的制備

稱取0.6540 g MUA于30 mL氯仿中攪拌溶解；加入0.5751 g EDC，攪拌15 min，后加入0.3450 g NHS攪拌15 min；加入5.4 g PEI攪拌24 hrs后，向其中加入30 mL三蒸水，攪拌1 hrs，靜置萃取上清液。

1.2.3 MUA-MAN(水溶液)的制備

取10 mLMUA-PEI溶液于瓶中，加入3 mL PBS緩沖液(10 mM，pH=7.4)攪拌1 min，然后加入0.1801 g甘露糖，再劇烈攬拌1 min后，該混合溶液在90 ℃下攪拌40 min。最后，通過透析袋(MWCO=1000 Da)，將合成的MUA-MAN溶液透析72 hrs后，收集透析袋內(nèi)的溶液，并在4 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 GNR-PEI和GNR-MAN的合成

取10 mg冷凍干燥后的GNR-CTAB粉末溶于10 mL水溶性PEI-MUA復(fù)合物中，在室溫下超聲攪拌24 h后，CTAB被更強的Au-S鍵取代后得到GNR-PEI；10 mg冷凍干燥后的GNR-CTAB粉末溶于10 mL水溶性MUA-MAN復(fù)合物中，在室溫下攪拌24 hrs后，CTAB被更強的Au-S鍵取代后得到GNR-MAN。將上述溶液以12，000 rpm離心15 min后去除多余的上清液，并將沉淀物用蒸餾水洗滌2次。通過冷凍干燥制備GNR-PEI和GNR-MAN粉末，稱重并溶解在非核酶水中備用。

GNR-PEI的表征檢測：采用zeta電位分析檢測GNR-PEI的電荷量。

GNR-MAN的表征檢測：采用透射電子顯微鏡檢測GNR-MAN大小和分散性；采用zeta電位分析檢測GNR-MAN的電荷量；核磁共振氫譜檢測GNR-MAN修飾的官能團。

2 結(jié)果與討論

2.1 GNR-CTAB的TEM圖

圖1是GNR-CTAB的TEM圖，從中看出，GNR-CTAB的長度約為30 nm，直徑約為10 nm，分散性較好。

圖1 GNR-CTAB的TEM圖

2.2 MUA-PEI的核磁共振氫譜

MUA-PEI的核磁共振氫譜如圖2所示。在MUA-PEI的核磁共振氫譜中，除了在2.50 ppm處出現(xiàn)PEI的特征峰，還出現(xiàn)了MUA的特征峰，說明MUA-PEI合成成功。

圖2 MUA-PEI的核磁共振氫譜

2.3 MUA-MAN的表征

2.3.1 MUA-MAN的UV/Vis吸收光譜表征

MUA-PEI，MAN和MUA-MAN在水溶液中的UV/Vis吸收光譜如圖3所示。在300 nm以上，MUA-PEI和甘露糖溶液都沒有吸收，但是MUA-MAN溶液在350 nm處有一個新的吸收峰出現(xiàn)，與文獻報道相符[10]。

圖3 在水溶液中MAN、MUA-PEI和MUA-MAN的UV/Vis吸收光譜

2.3.2 MUA-MAN的核磁共振氫譜表征

MUA-MAN的核磁氫譜如圖4所示。MUA-MAN在8.0 ppm處出現(xiàn)的新峰，這是C=N鍵的特征峰，而MUA-PEI在該位置并沒有此峰，MUA-MAN中有席夫堿的形成，與文獻報道相符[10]。

圖4 MUA-MAN的核磁共振氫譜

2.4 GNR-MAN的表征

2.4.1 GNR-MAN的TEM

GNR-MAN的TEM如圖5所示，其長度約為30 nm，直徑約為10 nm，在化學(xué)綴合甘露糖后，GNR的尺寸無明顯變化，并且仍然具有良好的分散性。

圖5 GNR-MAN的TEM圖

2.4.2 GNR-MAN的核磁共振氫譜

GNR-MAN的核磁共振氫譜如圖6所示。在8.4 ppm處出現(xiàn)了C=N鍵的特征峰，說明巰基(-SH)和金原子之間有很強的親和力，帶巰基的化合物可以與晶種生長法所合成的GNR表面的CTAB進行相對直接的置換，MUA-MAN取代了CTAB，從而達到修飾GNR的目的。

圖6 GNR-MAN的核磁共振氫譜

2.4.3 GNR-MAN的zeta電位分析

GNR-MAN的zeta電位分析如圖7所示。zeta電位分析表明，當(dāng)分別用MUA-PEI或MUA-MAN修飾GNR時，GNR的表面電荷從35.6 mV增加到42.7 mV或41.3 mV，表明GNR-MAN具有很強的結(jié)合自身帶負電荷的siRNA的能力。

圖7 GNR-MAN的zeta電位分析

3 結(jié)論

本項目建立新型的基于納米材料GNR的新型多功能納米載藥系統(tǒng)(GNR-Man)，其長度約為30 nm，直徑約為10 nm，在化學(xué)綴合甘露糖后，GNR的尺寸無明顯變化，并且仍然具有良好的分散性。GNR-MAN表面電荷為41.3 mV，具有很強的結(jié)合siRNA的能力，該系統(tǒng)能在體內(nèi)攜帶siRNA靶向腫瘤組織，從而增強抗腫瘤的治療效果，為基于金納米棒的靶向載藥提供理論和實驗依據(jù)。