李鈺芳，施婭楠，魏光強，李祥，黃艾祥*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明 650201）（2.云南東恒經(jīng)貿(mào)集團有限公司，云南曲靖 655000）

大河烏豬是由云南富源大河豬與“杜洛克”公豬雜交育成的國家級新品種，肌肉間脂肪含量高達(dá)5%，以肉質(zhì)優(yōu)良、營養(yǎng)豐富、風(fēng)味獨特而著稱[1]，是生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)火腿的理想材料?；鹜蕊L(fēng)味是消費者判斷其質(zhì)量和可接受度的重要屬性之一[2-3]，而發(fā)酵是火腿風(fēng)味形成的關(guān)鍵階段[4]，作為傳統(tǒng)腌臘肉制品杰出代表的火腿，對其揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)已經(jīng)展開了大量研究。章建浩等[5]在傳統(tǒng)工藝金華火腿中共檢出78 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，加工過程中醛和酮的相對含量逐漸降低，羧酸、酯、吡嗪和含硫化合物的相對含量逐漸增加；王嬡嫡等[6]發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)工藝制作的宣威火腿隨著發(fā)酵成熟時間的延長火腿的特征性風(fēng)味物質(zhì)含量增加，風(fēng)味趨好；Giovanelli 等[7]比較了帕爾馬、圣丹尼和托斯卡諾火腿發(fā)酵過程中理化、形態(tài)和芳香特征的演變，發(fā)現(xiàn)隨著加工時間延長，火腿風(fēng)味物質(zhì)更加豐富，香氣進(jìn)化明顯；施婭楠等人[8]發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)工藝條件下大河烏豬火腿隨著發(fā)酵期的延長，風(fēng)味成分的含量逐漸增加。

我國傳統(tǒng)干腌火腿屬于自然發(fā)酵肉制品，生產(chǎn)工藝復(fù)雜且標(biāo)準(zhǔn)化程度較低，其生產(chǎn)過程均在自然條件下進(jìn)行，通常是按季節(jié)、氣候控制生產(chǎn)時間，對環(huán)境溫度、濕度、用鹽量、腌制時間等因素的控制并不精準(zhǔn)且生產(chǎn)者技術(shù)經(jīng)驗也存在較大差異，很大程度上限制了火腿的品質(zhì)和統(tǒng)一性，這也是造成國內(nèi)干腌火腿與國際干腌火腿存在差距的最重要原因之一[9]。西式火腿大多采用標(biāo)準(zhǔn)化工藝對火腿進(jìn)行加工，通過控溫、控濕等功能，保證火腿在加工過程中始終處于最佳環(huán)境中，減少火腿變質(zhì)情況，縮短發(fā)酵時間[10]，能夠保證火腿的品質(zhì)。

標(biāo)準(zhǔn)化工藝條件即在低溫高濕（3±1 ℃、RH=85%～90%）條件下對火腿進(jìn)行冷涼后熟、修割整形、上鹽腌制等加工，并在中溫高濕（6±1 ℃、RH=70%～75%）脫水平衡，最后高溫高濕（23±1 ℃、RH=65%）下發(fā)酵產(chǎn)香得到成熟火腿。本研究以標(biāo)準(zhǔn)化工藝條件生產(chǎn)的大河烏豬火腿為研究對象，研究發(fā)酵時間（90 d、150 d、210 d、270 d、450 d、630 d）對火腿揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響，以期為大河烏豬火腿的標(biāo)準(zhǔn)化、科學(xué)化生產(chǎn)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大河烏豬火腿10±1 kg，云南東恒經(jīng)貿(mào)集團有限公司提供。

1.2 儀器與設(shè)備

火腿標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)車間，云南東恒經(jīng)貿(mào)集團有限公司；固相微萃取裝置及SPME 萃取頭（50/30 μm DVB/CAR/PDMS），美國supelco 公司；7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國agilent 公司；JJ-2BS 組織搗碎機，常州崢嶸儀器有限公司；超低溫冰箱，艾本德（上海）國際貿(mào)易有限公司；20 mL 透明頂空萃取瓶，上海安譜科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 大河烏豬火腿的標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)工藝

172 只新鮮后腿→冷涼后熟18 h（3±1 ℃、RH=85～90%）→修割整形→上鹽腌制24 d（腌制方法：采用上鹽堆碼干腌制，按每只鮮腿重的5.5%稱取食鹽，再按食鹽總重50%、30%、20%比例，分別在第1、3、5 d 搓揉上鹽并翻堆后堆碼腌制；腌制條件：3±1 ℃、RH=85～90%）→中溫脫水平衡60 d（6±1 ℃、RH=70%～75%）→高溫發(fā)酵產(chǎn)香90 d～630 d（23±1 ℃、RH=65%）→ 成熟火腿

1.3.2 火腿采樣

從發(fā)酵時間為（90 d、150 d、210 d、270 d、450 d、630 d）的6 個組中分別隨機抽取4 只火腿，共計24只火腿，將半膜肌和股二頭肌按1:1 的比例混合，組織搗碎機攪碎后真空包裝并保存在-20 ℃?zhèn)溆?，每個發(fā)酵周期結(jié)束后立即對樣品進(jìn)行測定。

1.3.3 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)萃取及GC-MS 條件

頂空固相微萃取條件：參照Huan 等[11]的方法，稱取肉樣5.00 g 于20 mL 頂空瓶中；將老化后的50/30μm 萃取頭插入頂空瓶上部，于50 ℃吸附40 min，吸附后的萃取頭取出后插入GC 進(jìn)樣口，于210 ℃解析5 min，同時啟動儀器采集數(shù)據(jù)。

GC-MS 參數(shù)參考郇延軍等[12]和Petri?evi?a 等[3]的方法并稍作修改。GC 條件：色譜柱：DB-5 MS 毛細(xì)色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：40 ℃保持5 min，以5 ℃/min升至90 ℃，再以12 ℃/min升至250 ℃并保持7 min；載氣He（純度≥99.999%）；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度250 ℃；進(jìn)樣量0.5 μL；分流比1:30。

MS 條件：傳輸線溫度280 ℃，離子源EI，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，電子能量70 eV，質(zhì)量掃描范圍50～450m/z。

1.3.4 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的鑒定

參照王勇勤等[13]和高韶婷等[14]的方法對揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析。

揮發(fā)性物質(zhì)的定性：將測得各揮發(fā)物的譜圖與NIST 2008 和Wiley 9 譜庫中標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的譜圖進(jìn)行比對，僅報道正反匹配度均大于800（最大值為1000）的結(jié)果；同時計算各揮發(fā)物的保留指數(shù)（retention index，RI）并與文獻(xiàn)中的RI 進(jìn)行比對，RI 的計算公式如下式：

式中：

Rt(x)——待測揮發(fā)性成分的保留時間，min；

Rt(n)——含n個碳原子正構(gòu)烷烴的保留時間，min；

Rt(n+1)——n+1 個碳原子正構(gòu)烷烴的保留時間，min。

揮發(fā)性物質(zhì)的定量：采用峰面積歸一化法。

1.3.5 關(guān)鍵揮發(fā)性物質(zhì)評定方法[15]

采用相對香氣活度值法（relative odor activity value，ROAV），

式中：

ROAVi——某揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的相對氣味活度值；

Ci——某揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的相對含量；

Tstan——氣味貢獻(xiàn)最大揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的閾值；

Cstan——氣味貢獻(xiàn)最大揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的相對含量；

Ti——某揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的閾值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2010 以峰面積歸一化法，計算各揮發(fā)性化合物的相對含量，結(jié)果輸出形式以x±s計。SIMCA 14.1 進(jìn)行偏最小二乘-判別分析（PLS-DA）分析。

2 結(jié)果分析

2.1 大河烏豬火腿發(fā)酵過程中揮發(fā)性化合物的變化

大河烏豬火腿在發(fā)酵過程中揮發(fā)性風(fēng)味成分變化見表1 和表2，發(fā)酵過程中共鑒定到137 種揮發(fā)性化合物，發(fā)酵的6 個時期（90 d、150 d、210 d、270 d、450 d 和630 d）揮發(fā)性風(fēng)味成分種類分別為45、31、62、54、72、68 種，主要以醛類（51.63%～68.17%）、醇類（12.73%～23.64%）和烴類（1.50%～15.50%）為主，它們的變化初步反映了火腿風(fēng)味的形成過程。

表1 發(fā)酵過程中火腿揮發(fā)性風(fēng)味成分Table 1 Volatile flavor components of ham in the process of ham fermentation

續(xù)表1

續(xù)表1

續(xù)表1

表2 火腿發(fā)酵過程中揮發(fā)性風(fēng)味成分的種類及相對含量Table 2 Variety and relative content of volatile flavor components during ham fermentation

火腿中已鑒定出的醛類包括直鏈醛、二醛、烯醛、支鏈醛和芳香醛5 種類型，不論豬肉或羊肉火腿，醛類物質(zhì)是被分離鑒定出的含量最豐富、種類最多的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)[16-17]。醛類是大河烏豬火腿每個發(fā)酵階段都占優(yōu)勢的1 種揮發(fā)性風(fēng)味成分，6 個發(fā)酵期醛類物質(zhì)含量都超過揮發(fā)性風(fēng)味成分總量的一半以上，Sabio 等[18]研究發(fā)現(xiàn)，Bayonne、Corsican、Iberian、Parma 和Serrna 火腿中的醛類物質(zhì)在揮發(fā)性風(fēng)味成分中占比最多，其含量達(dá)50%以上，要萍等[19]研究發(fā)現(xiàn)以傳統(tǒng)方法加工的宣威火腿中最豐富的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)為醛類物質(zhì)，與本研究結(jié)果類似。在大河烏豬火腿6 個發(fā)酵期中醛類含量最豐富的是己醛（13.01%～40.15%），其次是壬醛（1.01%～15.17%），壬醛是油酸的氧化產(chǎn)物[20]，能夠帶來高度愉快的甜味或果香風(fēng)味特征，己醛是亞油酸的氧化產(chǎn)物[21]，呈現(xiàn)清香的青草氣味，此研究結(jié)果與伊斯特拉火腿和宣威火腿的風(fēng)味物質(zhì)相似[22-23]。發(fā)酵至210 d 時，火腿中的醛類物質(zhì)有18 種，在6 個發(fā)酵期中種類最豐富，比發(fā)酵90 d時新增7 種醛類物質(zhì)，該結(jié)果與磽磧火腿[24]的發(fā)酵過程相似，磽磧火腿發(fā)酵至225 d 時比發(fā)酵初期新增加7種醛類物質(zhì)，說明發(fā)酵時間對醛類物質(zhì)的產(chǎn)生有一定的影響。

醇類物質(zhì)大多數(shù)來源于脂質(zhì)氧化分解，因為原料肉中醇含量不高[25]，在火腿的整個發(fā)酵過程中，發(fā)酵至210 d 時醇類物質(zhì)的相對含量最豐富，其相對含量達(dá)到23.64%，從發(fā)酵90 d 至450 d，醇類物質(zhì)種類增加8 種但相對含量減少2.58%，該結(jié)果與李誠[24]研究的蹺磧火腿發(fā)酵過程中醇類物質(zhì)相對含量從10.0%下降到2.45%的結(jié)果類似，這可能是由于腌制時用鹽量過多造成[26]，在大河烏豬火腿發(fā)酵210 d、270 d、450 d、630 d 四個時期含量最豐富是1-辛烯-3-醇，1-辛烯-3-醇閾值很低且能賦予食品蘑菇的香氣，是金華火腿中最重要的風(fēng)味成分之一，對火腿風(fēng)味有非常重要的作用[27]。

大河烏豬火腿不同發(fā)酵期共鑒定得到30 種烴類物質(zhì)，相對含量在1.50%～15.50%間波動，發(fā)酵至150 d 時，能檢測到的烴類物質(zhì)只有2,4-二甲基庚烷，發(fā)酵至630 d 時烴類物質(zhì)種類最豐富，共檢測出20 種烴類物質(zhì)，其相對含量為14.66%。鄭璞等[28]在傳統(tǒng)工藝

加工的盤縣火腿中共檢測出2 種烴類物質(zhì)，含量在0.61 μg/kg 至5.73 μg/kg 之間變化；高韶婷等[14]在金華火腿中共檢測到6 種烴類物質(zhì)，相對含量在0.01%～0.02%之間；與盤縣火腿和金華火腿相比，大河烏豬火腿中的烴類物質(zhì)較多，但由于烴類物質(zhì)的閾值較大，一般認(rèn)為對腌臘制品的風(fēng)味貢獻(xiàn)不大[29-30]。

酯類由游離脂肪酸和肌肉組織內(nèi)脂類氧化產(chǎn)生的醇反應(yīng)生成，代表成熟肉制品的風(fēng)味，對火腿風(fēng)味特征有較大貢獻(xiàn)。大河烏豬火腿中共檢測出13 種酯類物質(zhì)，發(fā)酵至210 d 酯類物質(zhì)種類最多，喬發(fā)東等[31]研究發(fā)現(xiàn)隨著宣威火腿加工時間的延長，酯類物質(zhì)種類增加，與本研究結(jié)果類似，發(fā)酵時間可能對酯類物質(zhì)的形成有一定的影響。其次，內(nèi)酯類物質(zhì)對火腿的風(fēng)味具有非常重要的作用，趙冰等[32]檢測出γ-己內(nèi)酯、γ-丁內(nèi)酯為特級金華火腿中的特征風(fēng)味物質(zhì)，在大河烏豬火腿中共檢測出4 種內(nèi)酯類物質(zhì)（γ-丁內(nèi)酯、γ-己內(nèi)酯、γ-十二內(nèi)酯、γ-壬內(nèi)酯），且都是發(fā)酵至210 d 才開始被檢出，推測內(nèi)酯類物質(zhì)可能受發(fā)酵時間影響較大。

酮類物質(zhì)具有青香氣味或奶油味、果香味，其中不飽和酮是動物特征味和植物油脂味的來源，是干腌火腿風(fēng)味的重要組成部分[33]。大河烏豬火腿發(fā)酵的6個階段，酮類物質(zhì)相對含量和種類不斷變化，發(fā)酵至210 d 時酮類物質(zhì)相對含量和種類最豐富，共檢測到6種酮類物質(zhì)，相對含量為14.06%。酮類物質(zhì)作為一種羰基化合物，它的相對含量比醛類少，閾值也比同分異構(gòu)體的醛類物質(zhì)高[30]，因此對干腌火腿風(fēng)味的貢獻(xiàn)小于醛類，但有增強風(fēng)味的作用。

酸類化合物主要可能來自于火腿中磷脂和總?cè)ヵ８视偷慕到?，其閾值較高，對食品風(fēng)味沒有直接的影響[34]，大河烏豬火腿發(fā)酵成熟的六個時期酸類物質(zhì)一直存在，相對含量在1.36%～5.01%間變化，種類呈先上升后下降的趨勢，要萍等人[19]在宣威火腿中只有檢測到一種酸類物質(zhì)；章建浩等人[5]的研究發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)工藝金華火腿中酸類物質(zhì)隨著發(fā)酵的進(jìn)行，酸類物質(zhì)種類和相對含量都增加，與本研究結(jié)果不同，可能是由于工藝和豬肉品種引起的差異。

大河烏豬火腿中共檢測到6 種芳香族化合物，苯類物質(zhì)同烷烴類一樣具有較高的閾值，對火腿風(fēng)味貢獻(xiàn)較小[29]。其他類共檢測出17 種，包括呋喃、吡嗪和一些雜環(huán)化合物，且這些物質(zhì)種類和含量都是隨著發(fā)酵期的延長逐漸增加，吡嗪類化合物共檢測到4 種，主要來自于美拉德反應(yīng)，是干腌火腿中重要的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，通常賦予肉品堅果及烘烤香味[14]。

2.2 PLS-DA 分析發(fā)酵時間對大河烏豬火腿揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響

PLS-DA 結(jié)果（見圖1），累計R2X＝0.866，R2Y=0.948，Q2＝0.807，Hotelling 圖顯示（見圖2）所有樣品均處于95% Hotelling T2置信區(qū)間內(nèi)，沒有發(fā)現(xiàn)“離群樣本點”，說明該模型有較好的預(yù)測能力。從樣本的聚集、離散程度看來，發(fā)酵至210 d、270 d、450 d、630 d 的樣本聚集在一起，說明這四個時期揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的組成相似，主體風(fēng)味成分在發(fā)酵至210 d 就已基本形成，傳統(tǒng)工藝發(fā)酵的大河烏豬火腿在發(fā)酵至210 d時主體風(fēng)味成分已基本形成，與本實驗結(jié)果類似[8]。PLS-DA 是基于降維的多維向量分析方法，與PCA 不同的是，PLS-DA 為有監(jiān)督的分析，可以預(yù)設(shè)分類，彌補了PCA 方法的不足，強化組間的差異，同時可以量化特征化合物造成組分差異的程度[35-36]。

圖1 發(fā)酵過程中揮發(fā)性風(fēng)味成分PLS-DA 得分圖Fig.1 PLS-DA score map of volatile flavor components during fermentation

圖2 發(fā)酵過程中揮發(fā)性風(fēng)味成分Hotelling T2分布圖Fig.2 Distribution of Hotelling T2 of volatile flavor component during fermentation

2.3 ROAV 分析發(fā)酵時間對大河烏豬火腿關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)的影響

如表3 所示，大河烏豬火腿的關(guān)鍵風(fēng)味化合物（ROAV≥1）有16 種：1-庚醇、3-甲基-1-丁醇、3-甲基丁醛、桉樹醇、2,3-辛二酮、2,4-癸二烯醛、苯乙醛、己醛、辛醛、壬醛、(E)-2-壬烯醛、1-辛烯-3-醇、2-辛烯醛、芳樟醇、庚醛、2-戊基呋喃，與金華火腿和伊比利亞火腿的關(guān)鍵風(fēng)味化合物類似[37-38]，與唐靜等人[9]研究的強化高溫火腿中的11 種特征關(guān)鍵風(fēng)味化合物相似。在發(fā)酵的六個時期火腿的關(guān)鍵風(fēng)味化合物（ROAV≥1）種類分別為：11 種、9 種、13 種、9 種、12 種、11 種，其中，1-庚醇、2,3-辛二酮、庚醛、己醛、辛醛、壬醛、2-辛烯醛存在于大河烏豬火腿發(fā)酵的六個時期，除了未查到閾值的化合物，在大河烏豬火腿成熟的六個發(fā)酵時期中，ROAV 值最大的均為醛類，已有研究證明，醛具有較低的氣味閾值，存在于較高的數(shù)量，對干腌火腿的整體風(fēng)味起著重要的作用[39-40]。

由表3 可知，發(fā)酵至90 d，火腿中ROAV 值較大的是壬醛、辛醛和芳樟醇，分別為316.76、293.25、248.29；發(fā)酵至150 d，火腿中ROAV 值較大的是3-甲基丁醛、己醛和庚醛，分別為689.76、100、22.26；發(fā)酵210 d，火腿中ROAV 值較大的是壬醛、辛醛、己醛，分別為184.26、145.76、100.00；發(fā)酵270 d、450 d、630 d，火腿中ROAV 值較大物質(zhì)均為3-甲基丁醛、辛醛和壬醛，是大河烏豬火腿的特征性風(fēng)味物質(zhì)，3-甲基丁醛幾乎是所以干腌火腿中的關(guān)鍵風(fēng)味化合物，而辛醛和壬醛是金華火腿的主體風(fēng)味成分，己醛則是如皋火腿的主體風(fēng)味物質(zhì)[41]，說明大河烏豬火腿的主體風(fēng)味物質(zhì)與金華火腿和如皋火腿有相似之處。

表3 火腿發(fā)酵過程中揮發(fā)性成分氣味貢獻(xiàn)表Table 3 Odor contribution of volatile components during ham fermentation

3 結(jié)論

標(biāo)準(zhǔn)化工藝條件下的大河烏豬火腿在發(fā)酵過程中共鑒定到137 種揮發(fā)性風(fēng)味成分，包括醛、醇、酸、烴、酮、酯、芳香族類及其他類化合物。發(fā)酵210 d、270 d、450 d、630 d 的大河烏豬火腿中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)組成相似，說明210 d 的發(fā)酵期火腿的主體風(fēng)味物質(zhì)已基本形成，大河烏豬火腿的加工期可定為10～12個月；發(fā)酵過程中關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)有1-庚醇、3-甲基-1-丁醇、3-甲基丁醛、桉樹醇、2,3-辛二酮、2,4-癸二烯醛、苯乙醛、己醛、辛醛、壬醛、壬醛、(E)-2-壬烯醛、1-辛烯-3-醇、2-辛烯醛、芳樟醇、庚醛、2-戊基呋喃等16 種，其中對風(fēng)味貢獻(xiàn)較大的三種物質(zhì)為3-甲基丁醛、辛醛和壬醛，是大河烏豬火腿的特征性風(fēng)味物質(zhì)。研究為大河烏豬火腿標(biāo)準(zhǔn)化加工技術(shù)提供理論依據(jù)。