黃嬌麗，劉嘉欣，易有金*，劉汝寬，朱樹清，鄧后勤

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410000）（2.百色學(xué)院農(nóng)業(yè)與食品工程學(xué)院，廣西百色 533000）（3.湖南省林業(yè)科學(xué)院省部共建木本油料資源利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長(zhǎng)沙 410000）（4.汝城縣繁華食品有限公司，湖南郴州 424100）

柑橘為蕓香科柑橘亞科柑橘屬植物[1]，柑橘是世界上最重要的農(nóng)作物之一，全球產(chǎn)量超過1.4×109t。我國(guó)是柑橘主產(chǎn)國(guó)，柑橘產(chǎn)地主要集中在南方亞熱帶地區(qū)，柑橘的栽培面積與年產(chǎn)量均居世界首位[2]。柑橘屬非呼吸躍變型果實(shí)，成熟后采收，采摘期集中，在貯運(yùn)中易受真菌浸染而腐爛，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，阻礙柑橘產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。柑橘青霉病是柑橘果實(shí)采后危害最大的病害[3-4]。目前，柑橘采后保鮮多以化學(xué)防腐保鮮劑處理為主[5-6]。其中，抑霉唑、咪鮮胺等化學(xué)防腐保鮮劑雖能適當(dāng)抑制柑橘青霉病的擴(kuò)散，但易使柑橘青霉菌產(chǎn)生抗藥性，且化學(xué)試劑多有毒性和化學(xué)殘留，對(duì)消費(fèi)者健康帶來安全隱患[7]。因此，選擇低毒低污染、非化學(xué)的、抗藥性程度低的植物源活性保鮮劑已成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)[8]。

植物提取物主要來源為藥用植物或香料植物，已有研究其對(duì)柑橘采后保鮮效果良好[9-10]。不同植物水提取物或有機(jī)溶劑提取物因其含有次生代謝產(chǎn)物，可以抑制柑橘的腐爛，其有效活性成分主要包括酚、醌、醛、生物堿與萜類等[11-12]。植物源保鮮劑較化學(xué)防腐保鮮劑更安全，但單一的提取物抑菌范圍窄，效果一般，植物提取物之間復(fù)配或與多糖、淀粉等復(fù)配成可食性涂膜應(yīng)用于果蔬保鮮，更有利于果實(shí)品質(zhì)的保持。

以可食性涂膜劑為成膜基質(zhì)，植物提取物為抑菌劑，實(shí)現(xiàn)優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)制備植物提取物復(fù)合涂膜劑已成為果蔬保鮮領(lǐng)域研究熱點(diǎn)。本文主要以魚腥草、廣藿香、丁香、厚樸、蛇床子5 種中草藥作為試驗(yàn)材料，通過平板抑菌試驗(yàn)初步篩選出對(duì)柑橘青霉菌抑菌效果較好的中草藥，并測(cè)定其最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC），研究魚腥草丁香普魯蘭多糖復(fù)配保鮮劑對(duì)柑橘的保鮮效果，旨在為尋找安全、高效的植物源柑橘保鮮劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

魚腥草、廣藿香、丁香、厚樸、蛇床子，購(gòu)于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)千金大藥房；柑橘，于長(zhǎng)沙當(dāng)?shù)毓麍@采摘；咪鮮胺，江蘇劍牌農(nóng)化股份有限公司。

柑橘青霉菌（Penicillium italicum），由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 儀器與設(shè)備

智能人工氣候箱（GZ-400-GSII），韶關(guān)市廣智科技設(shè)備有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 柑橘青霉菌致病性檢測(cè)

菌種活化：將湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供的柑橘青霉菌接種至PDA 培養(yǎng)基中，置于28±1 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，經(jīng)活化后備用。

柑橘青霉菌孢子懸浮液的制備：將柑橘青霉菌菌絲接種于PDA 培養(yǎng)基上，28±1 ℃培養(yǎng)7 d，加入10 mL帶有玻璃珠PDB 培養(yǎng)液，洗下柑橘青霉菌孢子到無菌錐形瓶中，搖勻，使孢子懸浮液終濃度為1×106CFU/mL，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

挑選無病害無創(chuàng)傷的柑橘果實(shí)為試材，用無菌針頭在柑橘赤道部位刺兩個(gè)2 mm 深，2 mm 寬的傷口，每個(gè)傷口接種10 μL 終濃度1×106CFU/mL 的孢子懸浮液，將柑橘置于保鮮袋內(nèi)，28±1 ℃條件下貯藏。處理30 個(gè)果實(shí)，逐日觀察發(fā)病狀態(tài)。

1.3.2 不同中草藥水提液抑菌率測(cè)定

中草藥水提液制備[13]：分別將丁香、厚樸、魚腥草、廣藿香、蛇床子5 種中草藥進(jìn)行粉碎，過40 目篩，稱取120 g 于1000 mL 燒杯中，加入500 mL 無菌水，先100 ℃煮沸10 min，再90 ℃熬制15 min，后75 ℃水浴120 min，無菌紗布過濾取濾液，10000 r/min、4 ℃離心10 min，取上清液，將上清液濃縮至80 mL，定容至100 mL。即得濃度為1.20 g/mL（中草藥粉末質(zhì)量與水提液定容體積比）的中草藥水提液，4 ℃密封保存?zhèn)溆?。按照植物源活性成分與培養(yǎng)基1:9（0.84 mL 1.3.2 水提液+15 mL 培養(yǎng)基）的比例，將配制好的5種中草藥水提液分別加入PDA 培養(yǎng)基中配成帶藥培養(yǎng)基（濃度為0.60 mg/mL），混勻，倒入培養(yǎng)皿，靜置凝固。將分離純化的柑橘青霉菌進(jìn)行活化。采用菌絲生長(zhǎng)速率法[14]，從柑橘青霉菌菌落邊緣上取直徑5 mm 的菌塊置于平板中央，帶菌絲的一面向下，以無菌水為空白對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3 次，28±1 ℃下培養(yǎng)7 d。用十字交叉法測(cè)各組菌落直徑并計(jì)算抑菌直徑、抑菌率[15]。

1.3.3 不同中草藥水提液MIC 測(cè)定

采用二倍稀釋法[16]，根據(jù)1.3.2 中5 種中草藥水提液對(duì)柑橘青霉菌抑菌效果，篩選出抑菌效果較好的中草藥水提液進(jìn)行梯度稀釋（1.20、0.60、0.30、0.15 g/mL），并按1.3.2 方法制成帶藥培養(yǎng)基，將柑橘青霉菌接種于各帶藥培養(yǎng)基中心，28±1 ℃培養(yǎng)48 h，以無菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)皿的含藥濃度為MIC。每個(gè)處理重復(fù)3 次。

1.3.4 不同中草藥水提液對(duì)柑橘青霉菌孢子萌發(fā)的影響

根據(jù)1.3.2 試驗(yàn)結(jié)果篩選出的抑菌效果較佳的中草藥水提液，采用二倍稀釋法將中草藥水提液分別稀釋成五個(gè)濃度（1.20、0.60、0.30、0.15、0.075 mg/mL）。取50 μL 終濃度1×106CFU/mL 孢子懸浮液與50 μL上述不同濃度中草藥水提液分別混勻于凹玻片上（魚腥草丁香復(fù)合體積比例為1:1，總中藥水提液體積為50 μL），28±1 ℃保濕培養(yǎng)24 h。無菌水為空白對(duì)照組，每個(gè)處理重復(fù)3 次。觀察孢子萌發(fā)，計(jì)算孢子萌發(fā)抑制率[17]，將孢子萌發(fā)抑制率換算成機(jī)率值（y），將中草藥水提液濃度換算成對(duì)數(shù)值（x），根據(jù)機(jī)率值和對(duì)數(shù)值用回歸法得到毒力回歸方程（y=ax+b），最終求得EC50和EC90。孢子萌發(fā)抑制率計(jì)算方法如下：

1.3.5 魚腥草丁香普魯蘭多糖復(fù)配保鮮劑制備

稱取7.5 g 普魯蘭多糖粉末于1000 mL 燒杯中，加450 mL 無菌水，65 ℃水浴1 h，充分?jǐn)嚢枞芙狻４渫耆芙夂?，分別加入1.00 mL魚腥草水提液和0.50 mL 丁香水提液，攪拌均勻后定容至500 mL 備用，即得魚腥草丁香普魯蘭多糖復(fù)配保鮮劑（1.20 mg/mL 魚腥草+0.60 mg/mL 丁香+1.5%普魯蘭多糖）。

1.3.6 復(fù)配保鮮劑對(duì)柑橘采后青霉菌抑制作用研究

柑橘果實(shí)用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇擦洗后，無菌水沖洗，待果實(shí)表面水分自然風(fēng)干后，用直徑2 mm 無菌針頭在各組柑橘赤道表面刺兩個(gè)2 mm 深、2 mm 寬傷口，以先于無菌水中浸泡1 min 后于傷口接種10 μL青霉孢子懸浮液為陰性對(duì)照組CK，以先于0.225 g/L咪鮮胺溶液中浸泡1 min 后于傷口接種10 μL 青霉孢子懸浮液為陽性對(duì)照組，以先于魚腥草丁香普魯蘭多糖復(fù)配保鮮劑中浸泡1 min 后于傷口接種10 μL 青霉孢子懸浮液為保鮮劑組，接種后置于28±1 ℃、相對(duì)濕度75%條件下貯藏，每隔3 d 測(cè)定果肉各項(xiàng)指標(biāo)，每組15 個(gè)果實(shí)，3 組平行。

1.3.7 果實(shí)生理相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定

發(fā)病率測(cè)定方法：采用計(jì)數(shù)法，按照公式（4）計(jì)算果實(shí)發(fā)病率。

失重率測(cè)定方法：采用稱重法，按照公式（5）計(jì)算果實(shí)的失重率。

參照曹建康[18]的方法，采用靜置法測(cè)定呼吸強(qiáng)度，手持折光儀測(cè)定可溶性固形物，2,6-二氯酚靛酚法測(cè)定抗壞血酸含量，氫氧化鈉溶液滴定法測(cè)定可滴定酸含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Origin 2019 軟件作圖，數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用Duncan 多重比較進(jìn)行顯著性分析，p＜0.05 表示組間差異顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 柑橘青霉菌致病力檢測(cè)

柑橘貯藏2 d，開始有發(fā)病跡象，柑橘創(chuàng)傷口表現(xiàn)水浸漬狀，出現(xiàn)白色霉層，不整齊圓形生長(zhǎng)，粉末狀；貯藏3 d 柑橘創(chuàng)傷口處中央開始出現(xiàn)青色的霉層，呈不規(guī)則圓形擴(kuò)展，發(fā)病到全果腐爛需要12 d，有濃重青霉味。

2.2 不同中草藥水提液的抑菌活性篩選結(jié)果

2.2.1 不同中草藥水提液抑菌作用

5 種中草藥水提液對(duì)柑橘青霉菌有不同程度的抑菌活性（如表1）。其中丁香和魚腥草對(duì)柑橘青霉菌的抑菌效果最佳，平均抑菌圈直徑分別達(dá)24.52 mm 和16.28 mm；抑菌率分別為73.45%和49.85%。其次是厚樸，抑菌圈直徑為6.34 mm，抑菌率為19.38%。而廣藿香和蛇床子水提液處理對(duì)柑橘青霉菌的抑菌效果不佳。因此初步篩選出丁香和魚腥草作為試驗(yàn)材料進(jìn)行MIC 測(cè)定。

表1 不同中草藥水提液對(duì)柑橘青霉菌的抑制作用(濃度0.60 mg/mL)Table 1 Inhibition effect of Penicillium italicum in different herbal extracts (0.60 mg/mL)

2.2.2 魚腥草和丁香水提液MIC 測(cè)定

試驗(yàn)結(jié)果顯示，丁香水提液濃度大于或等于0.60 mg/mL 時(shí)，完全抑制柑橘青霉菌生長(zhǎng)；魚腥草水提液濃度為1.20 mg/mL 時(shí)，幾乎完全抑制柑橘青霉菌生長(zhǎng)。因此丁香、魚腥草水提液MIC 分別為0.60 mg/mL和1.20 mg/mL。

2.3 魚腥草和丁香水提液對(duì)柑橘青霉菌孢子萌發(fā)影響

魚腥草和丁香水提液對(duì)柑橘青霉菌孢子萌發(fā)的抑制作用見表2 所示。在相同處理時(shí)間內(nèi)，柑橘青霉菌孢子對(duì)兩種中草藥提取液的敏感度不同。柑橘青霉菌孢子對(duì)丁香水提液的敏感性較魚腥草水提液強(qiáng)，丁香和魚腥草兩者水提液復(fù)合使用對(duì)青霉菌孢子萌發(fā)抑制效果最佳。丁香水提液主要成分可能是丁香酚，丁香酚具有較強(qiáng)的抗真菌活性，通過破壞菌體細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，改變細(xì)胞膜完整性和通透性，干擾菌體生長(zhǎng)代謝起抑菌的效果[19]。天然化合物之間存在協(xié)同效應(yīng)，不同植物提取物復(fù)配比單一使用效果更佳[20-21]。這種協(xié)同作用的機(jī)理可能是通過增強(qiáng)菌體細(xì)胞膜透性，促進(jìn)其他活性物質(zhì)滲透入菌體，增加有效濃度累積，造成細(xì)胞膜的破裂，導(dǎo)致菌體死亡[22]。綜上所述，丁香和魚腥草水及其復(fù)合水提液在一定范圍內(nèi)能有效抑制柑橘青霉菌的孢子萌發(fā)。

表2 丁香和魚腥草水提液對(duì)柑橘青霉菌孢子萌發(fā)的抑制作用Table 2 Inhibitory effect of Syzygium aromaticum and Houttuynia cordata extract on spore germination of Penicillium italicum

2.4 魚腥草丁香普魯蘭多糖復(fù)配保鮮劑對(duì)柑橘采后青霉菌抑制效果的影響

2.4.1 復(fù)配保鮮劑對(duì)柑橘失重率和發(fā)病率的影響

由圖1a 所示，當(dāng)柑橘損傷接種青霉菌時(shí)，在整個(gè)貯藏過程中，所有處理組柑橘失重率隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，保鮮劑組與對(duì)照組CK 的失重率無顯著差異（p＞0.05），陽性對(duì)照組在整個(gè)貯藏過程中失重率最低，且與其他處理組差異顯著（p＜0.05）。果蔬在采收后由于蒸騰和呼吸過程往往會(huì)失水減重[23]，而保鮮劑組處理的柑橘對(duì)阻止柑橘貯藏過程中的失重效果不明顯，該結(jié)果與Hadar 等[24]的研究結(jié)果類似，可能是由于以多糖為基礎(chǔ)的可食性涂層不能形成有效的水蒸氣屏障[25]。可見，保鮮劑組處理的柑橘不能有效降低柑橘貯藏過程中的失重率。

圖1 復(fù)配保鮮劑對(duì)柑橘失重率(a)和發(fā)病率(b)的影響Fig.1 Effect of composite coating on weight loss rate (a) and incidence rate (b) in Citrus reticulata

由圖1b 所示，貯藏至第3 d，對(duì)照組（CK）發(fā)病率分別達(dá)58.34%和55.56%，而陽性對(duì)照組和保鮮劑組均未發(fā)病；當(dāng)貯藏至第6 d 時(shí)，對(duì)照組發(fā)病率達(dá)100%，保鮮劑組和陽性對(duì)照組發(fā)病率無顯著差異（p＞0.05），分別為25.00%和33.33%；當(dāng)貯藏至第9 d時(shí)，保鮮劑組雖發(fā)病率為83.33%，但與CK 相比，發(fā)病率降低了16.67%。與CK 相比（柑橘的發(fā)病率在貯藏第3 d 出現(xiàn)），保鮮劑組處理的柑橘果實(shí)發(fā)病率延遲到第6 d。魚腥草丁香普魯蘭多糖復(fù)合涂膜保鮮劑組能提高果實(shí)采后的抗病性，控制青霉病的發(fā)病率。

綜上所述，保鮮劑處理組不能有效降低柑橘貯藏過程中的失重率，但可有效抑制柑橘的發(fā)病率。

2.4.2 復(fù)配保鮮劑對(duì)柑橘營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的影響

由圖2a 所示，總體上各處理組柑橘在整個(gè)貯藏過程中，可溶性固形物含量呈上升趨勢(shì)，而保鮮劑組柑橘的可溶性固形物含量在各組中最低，貯藏至第6 d，保鮮劑組可溶性固形物均顯著低于其它各處理組（p＜0.05）?？赡苁怯捎诟腥靖涕偾嗝咕墓麑?shí)開始腐爛，果實(shí)細(xì)胞壁中的原果膠轉(zhuǎn)化為可溶性糖[26]。同時(shí)，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，果實(shí)中的水分逐漸散失，導(dǎo)致可溶性固形物含量增加。保鮮劑組處理推遲了貯藏期間可溶性固形物含量的增加，可能是由于延遲了果實(shí)成熟和衰老過程。

由圖2b 所示，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，各組柑橘果實(shí)的可滴定酸含量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，陽性對(duì)照組柑橘果實(shí)的可滴定酸含量始終最低。貯藏至第6 和第9 d，保鮮劑組的可滴定酸含量顯著低于CK 組（p＜0.05）。可滴定酸主要是果實(shí)中的有機(jī)酸，一般果實(shí)在發(fā)育完成時(shí)可滴定酸含量最高，隨著果實(shí)的成熟與衰老，其含量逐漸下降。而本實(shí)驗(yàn)中，可滴定酸含量隨著貯藏時(shí)間增加而上升，原因可能是由于果實(shí)的呼吸作用和柑橘青霉菌分解作用而產(chǎn)酸導(dǎo)致[27]。

由圖2c 所示，在貯藏過程中，CK 組的Vc 含量一直呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，而保鮮劑組和陽性對(duì)照組的Vc含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，陽性對(duì)照組和保鮮劑組Vc 含量在整個(gè)貯藏過程中的變化相對(duì)于CK 組較小。Vc 是柑橘果實(shí)中重要的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)之一。在本實(shí)驗(yàn)中，柑橘經(jīng)損傷接種青霉菌后貯藏，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)Vc 含量逐漸上升，原因可能是接種青霉菌后的柑橘，在貯藏過程中，果實(shí)發(fā)病腐爛，破壞細(xì)胞壁的完整性，從而導(dǎo)致細(xì)胞壁釋放D-半乳糖醛酸[28]，促進(jìn)Vc 的合成，從而呈現(xiàn)Vc 含量上升的現(xiàn)象，而保鮮劑處理組可以在柑橘貯藏過程中保持果實(shí)細(xì)胞壁的完整性，從而影響Vc 的合成。該結(jié)果與Gao[29]研究結(jié)果一致。因此可以推測(cè)魚腥草丁香復(fù)配保鮮劑可抑制沙糖橘因青霉病引起的腐爛，延緩其衰老，延長(zhǎng)果實(shí)保鮮期。

圖2 復(fù)配保鮮劑對(duì)柑橘營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的影響Fig.2 Effect of composite coating on nutritional quality of Citrus reticulata

2.4.3 復(fù)配保鮮劑對(duì)柑橘呼吸強(qiáng)度的影響

由圖3 可知，柑橘在貯藏6 d 過程中，各組果實(shí)的呼吸強(qiáng)度一直上升，陽性對(duì)照組柑橘果實(shí)呼吸強(qiáng)度在整個(gè)貯藏過程中始終最低，其次是保鮮劑組。貯藏至第3 d 和第6 d，保鮮劑組柑橘果實(shí)呼吸強(qiáng)度顯著低于CK 組（p＜0.05），貯藏至第6 d 時(shí)，保鮮劑柑橘果實(shí)的呼吸強(qiáng)度比CK 組低46.54%。結(jié)果表明，保鮮劑組較CK 組可有效延緩果實(shí)呼吸強(qiáng)度的升高。柑橘果實(shí)在貯藏過程中呼吸強(qiáng)度上升，原因可能是柑橘果實(shí)在損傷接種青霉菌后，為抑制青霉菌的感染，其果實(shí)組織通過加強(qiáng)呼吸來抵御傷害，呼吸強(qiáng)度越高，說明果實(shí)感染青霉菌的程度越深，該結(jié)果與Aghdam[30]研究結(jié)果基本相符。

圖3 復(fù)配保鮮劑對(duì)柑橘呼吸強(qiáng)度的影響Fig.3 Effect of composite coating on respiration intensity in Citrus reticulata

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)研究了丁香、厚樸、魚腥草、廣藿香、蛇床子5 種中草藥水提液對(duì)柑橘青霉的抑菌活性。初步結(jié)果表明，丁香和魚腥草水提液對(duì)柑橘青霉菌菌絲生長(zhǎng)表現(xiàn)較強(qiáng)的抑制活性，同時(shí)可有效抑制柑橘青霉菌孢子的萌發(fā)。魚腥草丁香普魯蘭多糖復(fù)合涂膜保鮮劑（1.20 mg/mL 魚腥草+0.60 mg/mL 丁香+1.50%普魯蘭多糖）處理柑橘能提高果實(shí)采后的抗病性，控制青霉病的發(fā)病率，保持果實(shí)的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)，延長(zhǎng)果實(shí)保鮮期。