劉玉茜，賁婷婷，張風(fēng)姣，宋思祺，陳義倫

（山東省高校食品加工技術(shù)與質(zhì)量控制重點實驗室，山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東泰安 271018）

鐵蛋白（Ferritin，F(xiàn)RT）是一種普遍存在的鐵儲存和解毒蛋白，廣泛分布于植物、動物和細菌中[1-2]。每個鐵蛋白由24 個亞基組成，每兩個亞基反向平行形成一組，構(gòu)成4-3-2 重軸高度對稱的中空球狀分子（外徑為12～13 nm，內(nèi)徑為7～8 nm）。此外，鐵蛋白內(nèi)部空腔可儲存4500 個以無機礦物質(zhì)形式存在的Fe3+原子[3-4]（圖1a）。鐵蛋白由于外殼的保護，能夠降低它對膳食中存在的螯合劑如植酸和鞣酸等的敏感性，是一種新穎的、具有代表性的膳食鐵源[5]。此外，鐵蛋白在鐵代謝中起著關(guān)鍵作用，通過儲存與釋放鐵離子來調(diào)節(jié)體內(nèi)鐵的代謝平衡，因此，攝入鐵蛋白是減緩全球鐵缺乏癥的一種有效策略[6-7]。最近的研究表明，植物多酚可以與蛋白質(zhì)相互作用，從而改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象，如牛血清蛋白BSA[8]等。此外，研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)EGCG 誘導(dǎo)的鐵蛋白聚合能夠抑制蛋白酶對蛋白質(zhì)的降解[9-10]。因此，蛋白質(zhì)和多酚之間的相互作用為提高蛋白的穩(wěn)定性提供了可能。與廣泛分布在食品中的鐵蛋白類似，綠原酸（chlorogenic acid，CA）是咖啡中的主要多酚類物質(zhì)，而咖啡是一種世界范圍內(nèi)廣泛消費的飲料[11]。作為肉桂酸家族中最常見的一種單體化合物[12]，綠原酸也是大多數(shù)水果中具有代表性的一類酚類化合物[13-14]（圖1b）。酚酸具有很強的抗氧化性，增加酚酸的攝入量有助于降低人類患癌癥和心血管疾病的風(fēng)險，因此近年來人們對酚酸的研究熱度逐漸上升[11]。鑒于綠原酸常與植物源的鐵蛋白共存于食品體系中，并且綠原酸具有很強的抗氧化活性，因此研究這兩種物質(zhì)能否發(fā)生相互作用尤為重要，且對其相互作用機制的了解會有助于設(shè)計更加穩(wěn)定、生物利用率更高的功能性食品。

圖1 鐵蛋白的四倍軸通道結(jié)構(gòu)（a）、綠原酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)（b）、鐵蛋白rH-2 的非變性凝膠電泳圖（c）和變性電泳SDS-PAGE 圖（d）Fig.1 Crystal structure of ferritin with views down the 4-fold axes (channels) of the protein shell (a);Chemical structure of chlorogenic acid (b);Native PAGE (c) and SDS-PAGE analyses of rH-2 ferritin (d)

共價結(jié)合和非共價結(jié)合是多酚-蛋白質(zhì)相互作用的兩種基本機制[15-16]。在多酚氧化酶存在下或在堿性環(huán)境中，酚類化合物被氧化為醌時，通常會發(fā)生較為強烈的而不可逆的共價結(jié)合[17-19]，因此非常適用于開發(fā)穩(wěn)定的蛋白質(zhì)預(yù)處理組分[15]。據(jù)報道，溫度和pH值是影響蛋白質(zhì)-多酚共價作用的兩個關(guān)鍵條件[16]。相比較而言，由于反應(yīng)條件相對溫和，蛋白質(zhì)與多酚的非共價相互作用在食品中更為常見。酚類化合物與蛋白質(zhì)的非共價結(jié)合是指通過疏水相互作用、氫鍵、靜電吸引力和范德華力等發(fā)生的可逆的相互作用。在可逆相互作用中，通常氫鍵和疏水相互作用是酚-蛋白質(zhì)絡(luò)合最主要的非共價驅(qū)動力[15]，因為多酚的羥基和肽鏈的羰基很容易形成氫鍵。此外，蛋白質(zhì)氨基酸（苯環(huán)和脂肪族側(cè)鏈）的疏水區(qū)域以及多酚的芳香核在多酚-蛋白質(zhì)復(fù)合物的穩(wěn)定中發(fā)揮著重要作用[16-18]。研究表明，植物多酚與蛋白質(zhì)相互作用可引發(fā)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、熱穩(wěn)定性和消化率的變化[20]。例如，EGCG 降低了α-乳清蛋白的變性溫度并提高了其抗氧化能力[9]。Arimbor 等[21]發(fā)現(xiàn)沙棘原花青素能使蛋白質(zhì)聚合并抑制消化酶的活性從而減少蛋白質(zhì)的降解。此外，蛋白質(zhì)和多酚之間的相互作用被認為是影響多酚抗氧化活性的主要原因。雖然已有很多關(guān)于鐵蛋白-多酚相互作用的研究，但不同溫度條件下二者的相互作用方式及結(jié)合差異鮮為人知，且鮮有研究使用鐵蛋白-綠原酸作為相互作用的研究模型。

因此，本文系統(tǒng)研究了不同濃度的綠原酸（5-O-咖啡?？鼘幩幔χ亟M大豆種子H-2 亞基鐵蛋白（rH-2）理化性質(zhì)的影響，重點研究了綠原酸與鐵蛋白在不同溫度條件下的相互作用，通過方程擬合熒光光譜數(shù)據(jù)計算其結(jié)合位點和結(jié)合常數(shù)，還測定了鐵蛋白-酚酸復(fù)合物的體外抗氧化能力，以了解單體酚類化合物與鐵蛋白之間非共價相互作用的本質(zhì)和程度。本研究為控制蛋白質(zhì)與酚酸之間的相互作用，提高植物源蛋白-酚酸復(fù)合物在食品中的功能性應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

綠原酸（純度＞98%）購自Sigma-Aldrich（美國）；重組H-2 亞基鐵蛋白（rH-2）表達菌株來自實驗室保存的菌液；蛋白電泳分子量Marker、甘氨酸、福林酚、溴酚藍、SDS、Tris、考馬斯亮藍購自北京索萊寶生物科技有限公司，其他所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TGL-16A高速冷凍離心機，長沙平凡儀器；YC-2層析實驗冷柜，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實業(yè)有限公司；VE180電泳槽，天能公司；SCIENTZ-11D超聲粉碎儀，寧波新芝；磁力攪拌器，天津市歐諾儀器儀表有限公司；透射電子顯微鏡，日本Hitachi公司；熒光光譜儀，美國Agilent公司；動態(tài)光散射儀，英國Malvern公司；圓二色譜儀，法國Bio-Logic公司。

1.3 方法

1.3.1 重組大豆種子H-2 亞基鐵蛋白（rH-2）的制備

重組大豆種子H-2 亞基鐵蛋白（rH-2）的制備參照文獻報道的方法制備[10,22-23]。重組基因載體由大腸桿菌BL21 菌株（具有H-2 亞基的cDNA 序列）表達。所提取的粗蛋白通過凝膠過濾層析在聚丙烯酰胺-葡聚糖凝膠柱（Sephacryl S-300）中進一步純化，該柱用50 mmol/L Tris-HCl、0.15 mol/L NaCl 的緩沖液（pH 7.5）進行平衡。采用聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-和Native-PAGE）表征蛋白純度。采用Lowry 法測定鐵蛋白濃度[24]。

1.3.2 溶液的配置

用蒸餾水溶解綠原酸，制備終濃度為10 mmol/L的綠原酸母液，用20 mmol/L Tris-HCl 稀釋鐵蛋白樣品得到終濃度為0.5 μmol/L 的鐵蛋白溶液，將二者放置4 ℃下備用，以便后續(xù)進行鐵蛋白與綠原酸的相互作用分析。

1.3.3 圓二色譜分析

配制摩爾濃度比為40:1（FRT:CA，m/m）的鐵蛋白-綠原酸（FCAs）溶液，使用MOS-450 型圓二色譜儀，在25 ℃、遠紫外190～260 nm 波長范圍內(nèi)掃描，進行樣品的圓二色譜分析。掃描速度為60 nm/min，分辨率為寬1 nm，石英比色皿光徑為1 mm，掃描重復(fù)三次。使用網(wǎng)絡(luò)程序K2D2 計算蛋白二級結(jié)構(gòu)的比例[5]，同時以相應(yīng)濃度的鐵蛋白溶液作為空白對照。

1.3.4 熒光光譜分析

用熒光分光光度計檢測綠原酸對rH-2 熒光強度的影響。通過向1.5 mL 的鐵蛋白樣品（0.5 μmol/L，20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5）中添加0～12 μL 的綠原酸溶液（10 mmol/L），得到不同摩爾比的鐵蛋白/綠原酸混合液（0，1:20～1:160），隨后在25、37 和55 ℃下反應(yīng)10 min 測定熒光強度。激發(fā)波長為290 nm，發(fā)射波長300～500 nm。激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度分別為5 nm 和10 nm。為了獲得化學(xué)計量比和結(jié)合常數(shù)，根據(jù)先前描述的方法[25-27]，將數(shù)據(jù)擬合到方程式（1）中，以計算綠原酸與鐵蛋白的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點數(shù)。

式中：

n——結(jié)合位點數(shù)；

K——結(jié)合常數(shù)；

[P]0——蛋白質(zhì)的濃度；

[CA]0——綠原酸的濃度；

I0——結(jié)合位點完全飽和時，在沒有綠原酸的情況下蛋白質(zhì)的相對熒光強度；

I∞——結(jié)合位點完全飽和時，在存在綠原酸的情況下蛋白質(zhì)的相對熒光強度。

1.3.5 動態(tài)光散射（DLS）分析

使用動態(tài)光散射儀在25 ℃下對鐵蛋白和FCAs（1:40）進行DLS 測量。在DLS 測量之前，樣品需要靜置2 h，以確保反應(yīng)充分。采用Omnisize 2.0 軟件計算不同樣品的粒徑分布。

1.3.6 透射電子顯微鏡分析

透射電鏡制樣參照文獻報道的方法[28]。將不同樣品用50 mmol/L 的Tris-HCl（pH 7.0）緩沖液稀釋，然后放置在碳膜包被的銅網(wǎng)上，靜置10 min，并用濾紙吸去過量的溶液。待樣品干燥后，將樣品用2%乙酸鈾酰染色5 min，然后用濾紙吸掉多余的染液，待樣品晾干后，用透射電子顯微鏡在80 kV 下進行觀察。

1.3.7 抗氧化能力

使用市售的測定試劑盒（南京建城生物工程研究所）測定鐵蛋白、綠原酸以及鐵蛋白-綠原酸復(fù)合物（FCAs）不同樣品的抗氧化能力。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有圖表繪制均使用Origin 8.5 軟件，SPSS 軟件進行顯著性差異分析，結(jié)構(gòu)式由軟件Chem Draw 7.0處理。所有檢測均重復(fù)三次，結(jié)果用平均值±標準差（SD）來表示。顯著水平為p＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 鐵蛋白（rH-2）的表征

提取純化的rH-2 的電泳條帶如圖1c、1d 所示。Native-PAGE 顯示鐵蛋白為單條帶，分子量約為560 ku（圖1c），SDS-PAGE 顯示rH-2 僅包含一個分子量為28 ku 的亞基（圖1d），這與之前文獻報道的一致[24]，蛋白純度能夠滿足后續(xù)的實驗要求，表明鐵蛋白rH-2制備成功。

2.2 鐵蛋白-綠原酸復(fù)合物（FCAs）的圓二色譜分析

加入綠原酸后，rH-2 的Native-和SDS-PAGE 上的電泳條帶沒有改變（數(shù)據(jù)未顯示），表明綠原酸對rH-2 的一級結(jié)構(gòu)沒有影響。隨后，用圓二色譜儀研究了鐵蛋白rH-2 的二級結(jié)構(gòu)，遠紫外-圓二色譜的變化對應(yīng)于蛋白質(zhì)整體二級結(jié)構(gòu)的變化。如圖2 所示，rH-2在遠紫外光譜中有兩個負橢圓度，分別為208 和222 nm，這與文獻報道[3]的大豆鐵蛋白的二級結(jié)構(gòu)非常吻合，使用K2D2 程序估算的鐵蛋白α-螺旋含量為45.20%，β-折疊含量為17.00%，無規(guī)則卷曲含量為37.80%。在加入綠原酸后，蛋白質(zhì)的圓二光譜幾乎與未加綠原酸鐵蛋白樣品的光譜重疊（圖2），表明綠原酸對鐵蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響也很小。這些結(jié)果表明鐵蛋白rH-2 的二級結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定。此外，一些研究表明經(jīng)單寧酸、原花青素、沒食子酸及其衍生物或超高壓處理后，rH-2 的二級結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生變化，本文的結(jié)果與這些研究結(jié)論一致[5,6,10,14]。

圖2 有無綠原酸時rH-2 的圓二光譜圖Fig.2 CD spectra of rH-2 in the presence and absence of CAs

2.3 熒光光譜分析鐵蛋白與綠原酸的相互作用

為了進一步闡明二者的相互作用機理，使用公式（1）分析了熒光猝滅數(shù)據(jù)。計算出結(jié)合常數(shù)K 為1.7×104(mol/L)-1，結(jié)合位點數(shù)n 為156.8，表明約有156.8 個（摩爾比）綠原酸附著到鐵蛋白分子上（圖3b）。更重要的是，這些結(jié)果表明，氫鍵和范德華力等弱鍵在綠原酸與鐵蛋白的相互作用中起著重要作用[25]。除25 ℃外，上述實驗也在37 ℃（圖3c）和55 ℃（圖3e）下進行了比較分析。綠原酸與鐵蛋白相互作用后，結(jié)合常數(shù)K 分別為1.4×104(mol/L)-1（圖3d）和1.04×104(mol/L)-1（圖3f），結(jié)合位點數(shù)n 分別為132.1 和93.9。這些數(shù)據(jù)表明，隨著溫度的升高（25、37 和55 ℃），綠原酸與鐵蛋白的相互作用強度呈下降趨勢。

圖3 在25 ℃（a）、37 ℃（c）、55 ℃（e）下分別加入不同濃度綠原酸的鐵蛋白rH-2 的熒光光譜圖；根據(jù)公式（1）的熒光強度的相應(yīng)擬合曲線為（b）、（d）、（f）Fig.3 Fluorescence spectra of rH-2 treated with CAs at different concentrations,respectively at 25 ℃ (a),37℃ (c),55 ℃ (e) and the corresponding fitting curves of fluorescence intensity according to Eq.(1) were (b),(d),(f)

2.4 鐵蛋白-綠原酸復(fù)合物(FCAs)的粒徑分析

運用動態(tài)光散射儀研究了綠原酸對鐵蛋白粒徑的影響，結(jié)果如圖4 所示。在單一的鐵蛋白樣品中，粒徑分布主要為7.9 nm（圖4a），約占總體的98%，這與文獻報道的鐵蛋白rH-2 流體動力學(xué)半徑較為一致[24]。然而，在向鐵蛋白中添加綠原酸后，粒徑分布主要為7.67 nm，粒徑大小分布沒有明顯改變，表明綠原酸即使在高劑量下也不能誘導(dǎo)鐵蛋白之間的聚合（圖4b）。為了進一步證實這一結(jié)果，用透射電鏡觀察鐵蛋白的形態(tài)。在照片中可以看到大多數(shù)鐵蛋白rH-2 粒子在未加入綠原酸的情況下是單分散的，且較為均勻（圖4c）。鐵蛋白暴露于綠原酸后，大多數(shù)蛋白顆粒不會聚合在一起，分子之間有大約5～10 nm 的空間，像單獨鐵蛋白一樣分散均勻（圖4d）。這些發(fā)現(xiàn)證實了以下結(jié)論：盡管綠原酸可以結(jié)合在鐵蛋白上，但無法促進鐵蛋白之間的聚合。該結(jié)果也不同于之前報道的單寧酸在很大程度上能夠誘導(dǎo)鐵蛋白聚集[6]。一個單寧酸分子可能通過氫鍵將兩個或兩個以上的蛋白分子聚合在一起，可能因為它比綠原酸含有更多的羥基[10]。而綠原酸只能結(jié)合單個鐵蛋白分子上，但其具體原因有待進一步研究。

圖4 在未加入（a）和加入綠原酸（b）時鐵蛋白rH-2 的粒徑分布圖（rH-2/CAs，1:40）；在不存在（c）和存在（d）綠原酸的情況下鐵蛋白rH-2 的透射電子顯微照片。Fig.4 Relative scattered light intensity distribution curves for rH-2 in absence (a) and presence of CA(b) (rH-2/CAs,1:40);Transmission electron micrographs of apo rH-2 in the absence(c) and presence (d) of CA

2.5 相互作用對綠原酸抗氧化活性的影響

綠原酸是一種酚酸，具有很強的抗氧化和清除自由基的活性[11]。保留綠原酸在FCAs 中的抗氧化能力將有助于擴大其在功能性添加劑方面的應(yīng)用。為了評估鐵蛋白是否對綠原酸的抗氧化活性有影響，本研究進行了ABTS+·的清除試驗。如圖5 所示，未加入綠原酸時，鐵蛋白rH-2 的抗氧化能力0.703 mmol/L，顯著低于游離的綠原酸和FCAs。加入綠原酸后，在1:25、1:40 和1:100（鐵蛋白/綠原酸）的摩爾比時，復(fù)合物FCAs 的抗氧化能力分別為0.756、0.816 和1.01 mmol/L，隨著綠原酸濃度的增加，F(xiàn)CAs 清除自由基的能力顯著增強，高于單獨的鐵蛋白但比相同摩爾濃度的游離綠原酸要低（p＜0.05）。這與之前多酚與蛋白相互作用的研究結(jié)果一致[11]。據(jù)報道，綠原酸的抗氧化活性與其羥基密切相關(guān)[31]。據(jù)此推斷綠原酸中的一些羥基可能在與鐵蛋白結(jié)合時被掩蓋，這是導(dǎo)致FCAs 抗氧化活性降低的一個重要原因[11]。此外，綠原酸的抗氧化活性與樣品的供氫能力密切相關(guān)[20]。綠原酸與鐵蛋白結(jié)合后，綠原酸與鐵蛋白的相互作用改變了綠原酸的供氫能力，氫鍵的存在削弱了綠原酸的供氫能力，導(dǎo)致復(fù)合物的抗氧化能力較游離的綠原酸有所下降。雖然二者相互作用后其抗氧化能力有所降低，但鐵蛋白-綠原酸復(fù)合物既可以作為一種很好的補鐵功能食品，又保留了綠原酸的部分抗氧化能力，同時也為以后進一步改善復(fù)合物的功能特性提供了研究依據(jù)。

圖5 鐵蛋白、復(fù)合物FCAs 以及游離綠原酸的ABTS+·清除能力Fig 5 ABTS+· radical-scavenging ability of rH-2,FCAs,and free CA

3 結(jié)論

在本研究中，證明了綠原酸可以與鐵蛋白相互作用，并且首次研究了它們在不同溫度下相互作用的程度。這種相互作用僅對鐵蛋白的三級/四級結(jié)構(gòu)有影響，而沒有影響其一級和二級結(jié)構(gòu)。此外，綠原酸與鐵蛋白相互作用時，其抗氧化活性顯著下降。這些結(jié)果可以幫助理解復(fù)雜食品基質(zhì)中蛋白質(zhì)與酚酸之間的相互作用，并為擴大蛋白質(zhì)-酚酸非共價復(fù)合物在功能食品中的應(yīng)用和功能改善提供了理論參考。