劉文穎，馮曉文，程青麗，趙曉涵，李國明，谷瑞增

（1.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，北京市蛋白功能肽工程技術研究中心，北京 100015）（2.中國農(nóng)業(yè)大學工學院，北京 100083）

小麥是我國主要的經(jīng)濟作物，其加工副產(chǎn)物小麥蛋白，即谷朊粉，主要由麥醇溶蛋白和麥谷蛋白組成，其蛋白含量高達85%左右。小麥蛋白營養(yǎng)豐富，氨基酸組成比較齊全，但由于小麥蛋白具有獨特的結構，并且氨基酸主要為疏水性氨基酸和不帶電荷的氨基酸，使得分子內(nèi)疏水作用區(qū)域較大，在水中的溶解度較低，使小麥蛋白的應用受到了一定的局限[1-2]。因此，通過生物酶解法使蛋白質(zhì)水解，能夠提高其溶解度，同時改善其功能特性。

小麥低聚肽是由小麥蛋白經(jīng)酶解、噴霧干燥等手段制得的多肽混合物[3]。與小麥蛋白相比，小麥低聚肽具有水溶性好、穩(wěn)定性高、易于消化吸收等優(yōu)點[4]。已有文獻報道小麥肽具有抗氧化、保護腸黏膜、調(diào)節(jié)免疫、降血壓、調(diào)節(jié)血液膽固醇、阿片樣活性、抗過敏、抗癌等多種生理功能[5-7]?？寡趸饔檬且环N重要的功能活性，食物來源的抗氧化肽具有天然安全的特點，能夠通過減少自由基，抑制氧化反應，降低自動氧化速率，保護細胞抵御氧化應激損傷，從而達到抗衰老的功能。此外，食源性抗氧化肽也不會像人工合成抗氧化劑那樣對機體產(chǎn)生毒副作用。近年來大豆肽、玉米肽等天然活性肽具有較強的生物活性和生物安全性已成為國內(nèi)外的研究熱點。而關于小麥低聚肽的結構表征和抗氧化方面系統(tǒng)而全面的研究相對較少。

本試驗以小麥低聚肽為研究對象，通過掃描電鏡、基礎理化成分、相對分子質(zhì)量分布、氨基酸組成、紫外光譜和圓二色光譜對其結構特征進行表征，并通過羥基自由基清除能力、DPPH 自由基清除能力、ABTS自由基清除能力和氧自由基吸收能力（ORAC）測定對其體外抗氧化活性進行研究，以期為小麥低聚肽在食品中的多元化開發(fā)提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

谷朊粉，北京中食海氏生物技術有限公司提供；分子質(zhì)量標準品、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、Trolox（水溶性維生素E）、Fluorescein（熒光指示劑）、偶氮二異丁脒鹽酸鹽（AAPH），美國Sigma 公司；堿性蛋白酶（≥400000 DU/g）、中性蛋白酶（≥1600 AU/g），杜邦丹尼斯克公司；硫酸亞鐵、水楊酸鈉，廣東汕頭市西隴化工有限公司；ABTS 自由基清除能力測定試劑盒，碧云天生物技術研究所。

SpectraMax i3x 多功能酶標儀，美國MD 公司；QSY-Ⅱ型凱式定氮儀，北京強盛分析儀器制造中心；LC-20A 高效液相色譜儀，日本SHIMADZU 公司；Phenom ProX 臺式掃描電子顯微鏡，復納科學儀器（上海）有限公司；UV-1780 紫外可見分光光度計，日本SHIMADZU 公司；Chirascan V100 圓二色譜儀，英國Applied Photophysics 公司；Spectra MR 多功能酶標儀，美國dynex 公司；A300 全自動氨基酸分析儀，德國曼默博爾公司；HH-501 型超級恒溫水浴鍋，常州國宇儀器制造有限公司；LG10-2.4A 型高速離心機，北京醫(yī)用離心機廠；FD-1 冷凍干燥機，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 小麥低聚肽的制備

將500 g 谷朊粉溶解于蒸餾水中，質(zhì)量濃度為10%（m/m），在水浴鍋中調(diào)節(jié)pH 為8.5，溫度為50 ℃，加入堿性蛋白酶4.5 g，酶解2 h。然后用0.1 mol/L 的HCl 溶液調(diào)節(jié)pH 為7.0，加入中性蛋白酶4.0 g，酶解3 h。酶解結束后，升溫至95 ℃，滅酶10 min，再利用離心機8000 r/min 離心10 min，取上清液，用截留分子質(zhì)量為2×106u 的陶瓷膜過濾，取中間清液，然后利用截留分子質(zhì)量為1000 u 的超濾膜超濾，取濾過液，最后將溶液濃縮并冷凍干燥，得到小麥低聚肽干粉。

1.2.2 掃描電鏡

將樣品涂抹在樣盤雙面膠上，然后進行氮吹處理。處理好的樣品放入掃描電鏡抽真空，施加一定的電壓，調(diào)整束斑尺寸待聚焦清晰后分別在500倍和1000倍下獲取圖像，觀察區(qū)別[8]。

1.2.3 基礎理化成分測定

參照國標方法對進行基礎理化成分測定：GB 5009.5-2016 中的方法測定蛋白質(zhì)含量；GB/T 22729-2008 中的方法測定酸溶蛋白含量；GB 5009.3-2016 中的方法測定水分含量；GB 5009.4-2016中的方法測定灰分含量[9-12]。

1.2.4 相對分子質(zhì)量分布測定

利用流動相配制樣品溶液為質(zhì)量濃度 1.0 mg/mL，經(jīng)孔徑0.2 μm 聚四氟乙烯過濾膜過濾后，使用高效液相色譜儀進行凝膠過濾，紫外檢測器進行檢測。同時配制0.1%（m/V）肽標準品溶液，過膜后進樣，制作相對分子質(zhì)量校正曲線。四種肽標準品為：乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸（分子質(zhì)量189 u）、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸（分子質(zhì)量451 u）、桿菌酶（分子質(zhì)量1450 u）、細胞色素C（分子質(zhì)量12500 u）。色譜條件為：色譜柱：TSKgel G2000 SWXL 300 mm×7.8 mm；流動相：乙腈：水：三氟乙酸，45:55:0.1（V:V:V）；流速：0.5 mL/min；檢測波長：220 nm；柱溫：30 ℃[13]。

1.2.5 氨基酸組成測定

按照GB 5009.124-2016 的測定方法，采用全自動氨基酸分析儀進行水解氨基酸和游離氨基酸組成分析[14]。

1.2.6 紫外光譜掃描

稱取樣品溶解于超純水中，配制成2.0 mg/mL 的溶液，利用紫外可見分光光度計進行紫外光譜掃描，掃描波長245～320 nm[13]。

1.2.7 圓二色光譜掃描

將樣品配制成1.0 mg/mL 的溶液，利用圓二色光譜儀測量樣品的圓二色光譜。對于波長分析，以0.2 nm的步長和2.0 nm 的帶寬掃描樣品。光譜范圍為190～250 nm，掃描速度為200 nm/min。從每個光譜中減去緩沖液的基線光譜，并使用Jasco 軟件內(nèi)置的分析函數(shù)將得到的值轉(zhuǎn)換為摩爾橢圓率（θ）[8]。

1.2.8 小麥低聚肽的體外抗氧化活性測定

1.2.8.1 羥基自由基清除率測定

依次加入100 μL 不同質(zhì)量濃度的樣品溶液，200 μL 5 mmol/L 水楊酸乙醇溶液，200 μL 5 mmol/L FeSO4溶液，實驗組以100 μL 5 mmol/L H2O2啟動反應，測得吸光值Ax；對照組以等體積蒸餾水啟動反應，測得吸光值A0。空白組以等體積蒸餾水代替樣品，測得吸光值A1。渦旋震蕩，于37 ℃水浴鍋中反應1 h 后取200 μL 反應液在510 nm 處測定吸光值[13]。

1.2.8.2 DPPH 自由基清除率測定

依次加入100 μL 0.1 mmol/L DPPH-無水乙醇溶液和100 μL 不同質(zhì)量濃度的樣品溶液于96 孔板中，混勻，室溫避光反應30 min，然后在波長517 nm 處測定吸光值Ax；將100 μL 不同濃度的樣品溶液與100 μL 無水乙醇混合，測得吸光值A0；以蒸餾水代替樣品作為空白對照，與100 μL 0.1 mmol/L DPPH-無水乙醇溶液混合，測得吸光值A1[15]。

1.2.8.3 ABTS 自由基清除率測定

將100 μL ABTS 溶液和100 μL 氧化劑溶液混勻，配置成ABTS 工作母液，避光靜置過夜，形成ABTS自由基儲備液。使用前用0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）稀釋35 倍成為ABTS 工作液。每個孔中加入200 μL ABTS 工作液。向標準曲線檢測孔中加入10 μL 不同質(zhì)量濃度的Trolox（水溶性維生素E）標準溶液，向樣品檢測孔加入樣品10 μL，輕輕混勻后室溫孵育6 min，于734 nm 處測定吸光值。最終樣品的抗氧化能力以mmol Trolox /g 表示[16]。以Trolox 標準溶液繪制的ABTS 標準曲線如圖1 所示，擬合得到方程y=-0.3957x+0.7147，R2=0.9963。

圖1 Trolox 標準曲線Fig.1 Trolox standard curve

1.2.8.4 ORAC 值測定

將25 μL 樣品溶液和100 μL 的Fluorescein（熒光指示劑，0.8 μmol/L）于96 孔板中混合，然后加入75 μL 150 mmol/L 偶氮類化合物AAPH 啟動反應，此為實驗組。分別用25 μL Trolox 標準品（6.25、12.5、25、50、250、500 μmol/L）代替樣品作為陽性對照（制作標準曲線）、25 μL 磷酸緩沖液（pH=7.4，75 mmol/L）代替樣品為空白對照，于37 ℃保溫20 min，熒光酶標儀激發(fā)波長485 nm，發(fā)射波長530 nm，每隔5 min測定一次，測定總長時間為120 min。另外做不加AAPH 的對照。測樣品的ORAC 值表示為μmol Trolox/g[17]。不同質(zhì)量濃度Trolox 的動態(tài)熒光衰減曲線見圖 2，由此繪制標準曲線如圖 3 所示，y=0.0915x+1.4558，R2=0.9976。

圖2 不同質(zhì)量濃度Trolox 的動態(tài)熒光衰減曲線Fig.2 Dynamic fluorescence attenuation curve of Trolox at different concentrations

圖3 Trolox 標準曲線Fig.3 Trolox standard curve

1.2.9 數(shù)據(jù)處理

每組數(shù)據(jù)平行測定3 次，實驗結果用平均值±標準偏差表示，使用Origin 8.5 軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 掃描電鏡

由圖4 可見，在500 倍和1000 倍放大倍數(shù)下，小麥低聚肽具有明顯的球體顆粒狀，表面有氣孔和不規(guī)則褶皺。推測可能是由于蛋白質(zhì)酶解后結構被破壞，使得粒徑變小，表面暴露出更多的疏水性基團[18]。

圖4 小麥低聚肽的掃描電鏡Fig.4 Scanning electron microscope of wheat oligopeptides

2.2 小麥低聚肽的基礎理化成分

小麥低聚肽中總蛋白質(zhì)含量高達95.86%，水分和灰分含量很低，分別為3.38%和1.59%（表1）。酸溶蛋白質(zhì)含量為86.17%，占總蛋白質(zhì)的89.88%，表明小麥低聚肽中小分子蛋白質(zhì)含量較高。游離氨基酸含量為2.43%，經(jīng)計算，肽含量為83.74%。以上成分中，除水分外，其他成分均以干基計。酶解過程中蛋白質(zhì)的溶解、不溶性非蛋白質(zhì)物質(zhì)的去除以及水解后油脂等物質(zhì)的去除，使得制備的小麥低聚肽中蛋白質(zhì)和肽含量較高。

表1 小麥低聚肽的基礎理化成分Table 1 Basic physicochemical composition of wheat oligopeptides

2.3 小麥低聚肽的相對分子質(zhì)量分布

小麥低聚肽洗脫圖譜見圖5。使用GPC 軟件處理色譜數(shù)據(jù)，如表2 所示，小麥低聚肽中大分子蛋白較少，主要為小分子肽混合物，分子質(zhì)量小于1000 u 的小肽所占比例為92.22%，重均分子質(zhì)量為439.70 u。其中，分子質(zhì)量在150～1000 u 的小肽占72.15%，而1000～2000，2000～3000，3000～5000，＞5000 u 的多肽分別為5.94%、1.28%、0.46%、0.10%。說明小麥低聚肽的主要成分為1000 u 以下的小肽。研究表明，肽的抗氧化活性與分子質(zhì)量大小有關，活性較強的抗氧化肽分子質(zhì)量均較小，氨基酸殘基的數(shù)目一般在20個以內(nèi)[19]。因此，小麥低聚肽是一種具有潛力的抗氧化性物質(zhì)。

圖5 小麥低聚肽分子質(zhì)量分布凝膠色譜圖Fig.5 Gel filter chromatogram of molecular weight distribution of wheat oligopeptides

表2 小麥低聚肽的分子質(zhì)量分布Table 2 Molecular weight distribution of wheat oligopeptides

2.4 小麥低聚肽的氨基酸組成

由表3 可知，小麥低聚肽中谷氨酸、脯氨酸含量很高，總含量為49.50 g/100 g。而色氨酸含量很低，僅為0.46±0.06 g/100 g。小麥低聚肽中含有豐富的必需氨基酸，含量為20.92 g/100 g，組成合理，具有較高的營養(yǎng)價值。有文獻報道，許多氨基酸具有抗氧化能力，能夠較好地清除自由基，如脯氨酸、亮氨酸、纈氨酸、甘氨酸、丙氨酸、精氨酸、賴氨酸、組氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、半胱氨酸等[20,21]。小麥低聚肽富含抗氧化性氨基酸，其中脯氨酸、亮氨酸、纈氨酸含量較高。此外，小麥低聚肽中疏水性氨基酸含量為32.23 g/100 g。低聚肽中高含量的疏水氨基酸能夠增加其脂溶性，從而有助于清除脂質(zhì)自由基，發(fā)揮重要的抗氧化作用[22]。

表3 小麥低聚肽的氨基酸組成Table 3 Amino acid composition of wheat oligopeptides

2.5 小麥低聚肽的紫外光譜掃描

將配制成質(zhì)量濃度2.0 mg/mL 的小麥低聚肽進行紫外光譜掃描，掃描波長245～320 nm。結果如圖6 所示。從圖中看出，小麥低聚肽在270 nm 的近紫外區(qū)有最大吸收峰，吸光度為2.0687。羰基的最大吸收波長一般為200 nm 左右，該吸收峰出現(xiàn)在270 nm，推測其主要原因是肽鍵中羰基π電子與相鄰氨基的孤對電子發(fā)生p-π共軛使電子π-π*躍遷產(chǎn)生的吸收峰發(fā)生紅移。

圖6 小麥低聚肽的紫外光譜掃描Fig.6 UV scanning analysis of wheat oligopeptides

2.6 小麥低聚肽的圓二色光譜掃描

肽的結構主要為肽鏈一級結構和二級結構，與蛋白質(zhì)的結構相比較為簡單[23]。圓二色光譜圖（圖7）的峰位和峰形顯示，小麥低聚肽的二級結構以多種構象并存，小麥低聚肽在200 nm 左右的遠紫外區(qū)有負吸收，二級結構主要為β-折疊。利用CDNN 軟件分析得到肽段各二級結構的含量，如表4 所示。小麥低聚肽的α-螺旋為5.83%，平行式β-折疊為3.14%，反平行式β-折疊為37.57%，β-轉(zhuǎn)角為20.32%，無規(guī)卷曲為33.14%。小麥低聚肽中β-折疊及無規(guī)則卷曲含量較多，緊密且沒有空腔的穩(wěn)定結構即α-螺旋結構含量較少，因此分子表面疏水性較大[24]。推測原因可能是由于蛋白質(zhì)酶解后空間結構展開，蛋白質(zhì)分子內(nèi)無序結構變多，β-折疊和無規(guī)卷曲增加，顯露出來更多的疏水性位點，從而發(fā)揮特定的功能作用[25]，這也是小麥低聚肽表現(xiàn)出一定抗氧化能力的原因之一。

圖7 小麥低聚肽的圓二色光譜掃描Fig.7 Circular dichroism spectrum of wheat oligopeptides

表4 小麥低聚肽的二級結構Table 4 Secondary structure of wheat oligopeptides

2.7 小麥低聚肽的體外抗氧化作用

2.7.1 小麥低聚肽的羥基自由基清除能力

如圖8 所示，在質(zhì)量濃度0～20 mg/mL 范圍內(nèi)，小麥低聚肽對羥基自由基的清除率呈明顯的量效關系，在質(zhì)量濃度為20 mg/mL 時，清除率達到90.53%，表現(xiàn)出很強的羥基自由基清除能力，半抑制濃度IC50值約為9.62 mg/mL。小麥蛋白被酶解成低聚肽后，使得更多的活性基團或位點暴露出來，能夠終止自由基連鎖反應，表現(xiàn)出一定的抗氧化能力[20]。陽性對照抗壞血酸對羥基自由基的清除率先迅速增加，然后趨于平緩，IC50值約為0.08 mg/mL。小麥低聚肽的羥基自由基清除能力弱于單一成分的抗壞血酸，但是作為一種天然的功能活性物質(zhì)，安全性高，無潛在毒副作用。鄭志強[5]等通過堿性蛋白酶和風味蛋白酶分步酶解方式酶解小麥蛋白，結果表明，隨著酶解物濃度的升高，DPPH 自由基清除能力也增強，與本實驗結果一致。

圖8 小麥低聚肽（a）和抗壞血酸（b）對羥基自由基清除率Fig.8 Hydroxyl free radical scavenging effects of wheat oligopeptides (a) and ascorbic acid (b)

2.7.2 小麥低聚肽的DPPH 自由基清除能力

由圖9 可知，在質(zhì)量濃度0～10 mg/mL 范圍內(nèi)，小麥低聚肽對DPPH 自由基清除率與質(zhì)量濃度呈明顯的劑量關系，質(zhì)量濃度為2 mg/mL 時，清除率達到60.27%，質(zhì)量濃度為10 mg/mL 時，清除率為81.54%，IC50值約為1.54 mg/mL。這表明小麥低聚肽具有降低DPPH 自由基濃度，阻斷脂質(zhì)過氧化鏈式反應的能力。抗壞血酸對DPPH 自由基的清除作用也呈現(xiàn)出明顯的量效關系，IC50值為4.13 μg/mL。小麥低聚肽的DPPH自由基清除能力可能是因為小麥蛋白酶解過程中釋放出可作為質(zhì)子供體的物質(zhì)，與DPPH 自由基反應使其轉(zhuǎn)變成穩(wěn)定的反磁性分子，從而呈現(xiàn)出較強的抗氧化能力[26]。代卉等[27]通過小鼠模型考察了小麥活性肽清除DPPH 自由基的能力，其結果表明高劑量肽組（按100 mg/kg 體重灌胃）小鼠血清的DPPH 自由基清除率要高于低劑量肽組（按20 mg/kg 體重灌胃），與本實驗小麥低聚肽的DPPH 自由基清除率變化規(guī)律保持一致。

圖9 小麥低聚肽（a）和抗壞血酸（b）對DPPH 自由基清除率Fig.9 DPPH free radical scavenging effects of wheat oligopeptides (a) and ascorbic acid (b)

2.7.3 小麥低聚肽的ABTS 自由基清除能力

經(jīng)計算可知，小麥低聚肽和抗壞血酸的ABTS 自由基清除率分別為3.53、29.36 mmol Trolox/g，由此可見抗壞血酸的ABTS 自由基清除能力約為小麥低聚肽的8.32 倍。小麥低聚肽的ABTS 自由基清除作用可能是由于小麥蛋白酶解后，空間構型、氨基酸組成和分子空間排列等發(fā)生變化，產(chǎn)生離子化的氨基或羧基等供氫體。此外，某些氨基酸如酪氨酸（Tyr）含有酚羥基，能提供質(zhì)子，還原具有氧化性的自由基，從而終止自由基連鎖反應，達到清除或抑制自由基的目的[18]。多項研究結果表明，小分子質(zhì)量小麥肽相較大分子質(zhì)量的小麥肽具有更強的抗氧化能力。小麥肽中小分子質(zhì)量的肽所占比例越大，表明其水解程度越高，抗氧化活性也越高[5,28-29]。

2.7.4 小麥低聚肽的ORAC 值

結果顯示，小麥低聚肽和抗壞血酸的ORAC 值分別為1035.52、1056.88 μmol Trolox/g。由此可見，小麥低聚肽與抗壞血酸的ORAC 值相當。這表明小麥低聚肽能夠通過氫轉(zhuǎn)移阻斷自由基鏈式反應過程實現(xiàn)抗氧化作用[30]。已有研究表明，高活性的抗氧化肽具有一定的分子質(zhì)量范圍，分子質(zhì)量小的肽一般具有較強的抗氧化活性[31]。吳明澤等[32]通過超濾將中華圓田螺肉酶解產(chǎn)物分離純化為分子質(zhì)量＜1、1～3、＞3 ku 的3 個組分。分子質(zhì)量＜1 ku 組分的ORAC 值均顯著高于另外兩個組分（p＜0.05），具有良好的氧自由基吸收能力。本研究中小麥低聚肽的主要成分為分子質(zhì)量＜1 ku的小肽，這可能與其具有較高的ORAC 值有一定關聯(lián)。

3 結論

以谷朊粉為原料通過酶解法制備小麥低聚肽，蛋白質(zhì)和肽含量為95.86%、83.74%，分子質(zhì)量1000 u以下的組分占92.22%，必需氨基酸和疏水性氨基酸含量分別為20.92、32.23 g/100 g，主要成分為分子質(zhì)量小于1000 u 的小肽，在270 nm 波長處有最大吸收峰。二級結構以多種構象并存，α-螺旋、平行式β-折疊、反平行式β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲含量分別為5.83%、3.14%、37.57%、20.32%和33.14%，主要為β-折疊。小麥低聚肽對羥基自由基和DPPH 自由基的IC50值分別為9.62、1.54 mg/mL，ABTS 自由基清除能力為3.53 mmol Trolox/g，ORAC 值為1035.52 μmol Trolox/g，具有較強的抗氧化能力，為其在相關營養(yǎng)健康食品的開發(fā)利用提供了一定的參考依據(jù)。