劉文凱，田 玲，喬自林，王家敏，王明明，李 鈾*

（1.西北民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究中心 甘肅省動(dòng)物細(xì)胞技術(shù)創(chuàng)新中心，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究中心 生物工程與技術(shù)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730030；3.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730100）

體外培養(yǎng)的細(xì)胞增殖能力十分有限，細(xì)胞的每次分裂都會(huì)造成端?？s短，最終達(dá)到“Hayflick界限”，在大約60個(gè)PDs（群體倍增次數(shù)）后停止生長(zhǎng)，當(dāng)端粒太短而不能正常封頂時(shí)，復(fù)制性衰老（M1期，細(xì)胞生長(zhǎng)停滯）就會(huì)發(fā)生[1]。細(xì)胞永生化可在M1期利用hTERT、病毒、放射性因素等阻止衰老，使細(xì)胞繼續(xù)增殖[2]。細(xì)胞在經(jīng)過(guò)20～30次的PDs后，進(jìn)入危機(jī)期（M2期），端粒酶被激活并反轉(zhuǎn)錄DNA來(lái)延長(zhǎng)端粒，使細(xì)胞越過(guò)M2期并無(wú)限增殖，從而變?yōu)橛郎?xì)胞[3]。

細(xì)胞衰老打開(kāi)DNA損傷反應(yīng)通路，腫瘤抑制因子p53被激活，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯。SV40屬于猿猴病毒40，由結(jié)構(gòu)蛋白（VP1，VP2，VP3）以及兩種抗原（LT，st）構(gòu)成[4]，是建立永生化細(xì)胞系最直接的基因。SV40的表達(dá)可使LT與p53結(jié)合，從而致使p53失活，使其蛋白降解，最終有效促進(jìn)細(xì)胞增殖并永生化。

1958年Madin和Darby從犬的腎臟中獲得上皮細(xì)胞產(chǎn)生了MDCK細(xì)胞系[5]，經(jīng)檢測(cè)MDCK細(xì)胞產(chǎn)毒效力較高，可適用于生產(chǎn)甲型及乙型流感病毒[6]。但MDCK細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方式不夠敏感，所以要利用SV40病毒介導(dǎo)的感染方式使其具有較高的轉(zhuǎn)化率[7]。

本試驗(yàn)利用慢病毒將SV40-LT基因?qū)隡DCK細(xì)胞，通過(guò)篩選檢測(cè)到SV40-LT基因的表達(dá)，不僅探究了建立成熟永生化實(shí)驗(yàn)體系的過(guò)程，為后續(xù)原代永生化細(xì)胞系提供技術(shù)依據(jù)，而且提高了MDCK細(xì)胞的增殖能力，可為疫苗生產(chǎn)提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)儀器

所用儀器包括生物顯微鏡、液氮罐、高壓滅菌器、恒溫水浴箱、冰箱、3 ml塑料細(xì)管、載玻片、蓋玻片、10 ml移液管、CO2培養(yǎng)箱、共聚焦顯微鏡、基礎(chǔ)電泳儀電源、小型轉(zhuǎn)印槽、垂直電泳儀、細(xì)胞凍存盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、總RNA提取試劑盒、DMEM/F12培養(yǎng)基、新生牛血清、0.25%胰蛋白酶、嘌呤霉素、SV40-LT病毒液，其余試劑均為實(shí)驗(yàn)室常規(guī)試劑。

1.2 細(xì)胞傳代

按照細(xì)胞長(zhǎng)勢(shì)情況，加入5 ml新鮮培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至85%以上時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)，觀察并拍照，記錄細(xì)胞的生長(zhǎng)形態(tài)與速度。重點(diǎn)記下F3、F10、F15代細(xì)胞的形態(tài)，并做生物學(xué)研究[8]。為了提高細(xì)胞的貼壁能力，可以先利用0.5 ml新生牛血清浸濕T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶的底部，將培養(yǎng)瓶倒置放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)0.5 h。

傳代時(shí)先對(duì)細(xì)胞瓶口消毒，倒去陳舊培養(yǎng)基，PBS溶液清洗3次后棄去，再向瓶?jī)?nèi)加入2 ml 0.25%胰蛋白酶，以覆滿瓶底為限，置恒溫培養(yǎng)箱中1～3 min。當(dāng)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞變圓、間隙變大后，棄去胰酶，用10 ml移液管緩緩吹打細(xì)胞底部把細(xì)胞吹下，形成細(xì)胞懸液[9]。按照1∶3的比例把細(xì)胞懸液分為3份加入細(xì)胞瓶中，并放在培養(yǎng)箱（37℃，5%CO2）中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞凍存與復(fù)蘇

凍存前24 h更換新鮮培養(yǎng)液，對(duì)數(shù)期細(xì)胞達(dá)到85%以上時(shí)進(jìn)行細(xì)胞凍存，棄去培養(yǎng)基，加入PBS溶液清洗3次，加入胰酶消化1.5 min后，以800 r/min的速度離心10 min，棄上清液，加入2 ml凍存液，按照4℃ 0.5 h、-20℃ 1 h，-80℃過(guò)夜保存的順序依次凍存，最終保存在液氮罐中[10]。

將凍存管放入37℃水浴箱中快速搖動(dòng)，盡量在90 s內(nèi)使細(xì)胞解凍，加入到2 ml無(wú)菌離心管中，以800 r/min的速度離心10 min，吸干上清液，加入1 ml新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液使細(xì)胞懸浮，轉(zhuǎn)移至T25細(xì)胞瓶中培養(yǎng)，再加入4 ml新鮮培養(yǎng)基，24 h后更換培養(yǎng)液去除漂浮的死亡細(xì)胞。

1.4 MDCK細(xì)胞嘌呤霉素篩選

選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好的F3代細(xì)胞，以1×104/孔的細(xì)胞密度接種在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。待細(xì)胞長(zhǎng)至50%～60%時(shí)，棄去培養(yǎng)液，PBS溶液清洗3次，加入含有不同篩選濃度的培養(yǎng)基（含有嘌呤霉素和10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液）[11]，培養(yǎng)液中嘌呤霉素濃度為1～10 μg/ml。1 μg/ml為1個(gè)梯度，用培養(yǎng)液配置成不同的篩選濃度，每個(gè)濃度值設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔、3個(gè)對(duì)照孔[12]。每2 d更換1次篩選培養(yǎng)基，在顯微鏡下觀察并記錄細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，第4～7 d細(xì)胞全部死亡的最低濃度即為最小嘌呤霉素篩選濃度。

1.5 MDCK細(xì)胞感染SV40-LT病毒液

將復(fù)蘇后的F3代MDCK細(xì)胞按照1×104/孔的細(xì)胞密度接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞匯合度為50%時(shí)，進(jìn)行病毒感染。按照吉?jiǎng)P基因公司說(shuō)明書以及MDCK細(xì)胞的moi值進(jìn)行操作。設(shè)定moi值為100，根據(jù)細(xì)胞的moi數(shù)值和病毒滴度，加入SV40-LT病毒液，16 h后更換完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至細(xì)胞瓶中培養(yǎng)[13]。

1.6 陽(yáng)性細(xì)胞篩選

感染SV40-LT病毒液的細(xì)胞加入4 μg/ml的嘌呤霉素篩選培養(yǎng)基，未感染的MDCK細(xì)胞也加入相同濃度作為對(duì)照[14]。每2 d更換1次篩選培養(yǎng)液，出現(xiàn)大量漂浮以及死亡細(xì)胞時(shí)，變?yōu)槊咳崭鼡Q。4～7 d未感染的MDCK細(xì)胞死亡后，剩余感染SV40-LT病毒液的細(xì)胞即為陽(yáng)性細(xì)胞。在篩選過(guò)程中首次長(zhǎng)滿T25細(xì)胞瓶時(shí)命名為F1代。感染SV40-LT基因篩選獲得的細(xì)胞系命名為MDCK-SV40。

1.7 MDCK-SV40細(xì)胞中SV40-LT基因檢測(cè)

將MDCK-SV40細(xì)胞F3代的總RNA進(jìn)行抽提，按照RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，對(duì)抽提后檢測(cè)合格的cDNA進(jìn)行qPCR檢測(cè)SV40-LT基因表達(dá)情況[15]。相應(yīng)引物序列見(jiàn)表1。采用Real-time-qPCR檢測(cè)SV40-LT的表達(dá)。引物序列應(yīng)用Primer Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)，由北京擎科生物科技有限公司合成，內(nèi)參為ACTB（肌動(dòng)蛋白）。

表1 qPCR引物

1.8 細(xì)胞免疫熒光鑒定MDCK-SV40中的SV40-LT基因表達(dá)

將未感染的F3代MDCK細(xì)胞、F3代MDCK-SV40細(xì)胞分別以1×104個(gè)/孔接種于12孔板中，培養(yǎng)2 d進(jìn)行免疫熒光試驗(yàn)。細(xì)胞長(zhǎng)至70%時(shí)，PBST洗滌3次[16]。4%多聚甲醛固定爬片15 min。PBST洗滌3次，加入0.1%TritonX-100室溫通透20 min。PBST洗滌3次，滴加山羊血清，37℃封閉30 min。棄去封閉液，滴加一抗并放入濕盒，4℃孵育過(guò)夜。PBST洗滌3次，加熒光二抗，37℃孵育2 h。PBST洗滌3次，滴加DAPI避光孵育5 min，吸干爬片上的液體，將爬片放置在滴有適量抗熒光淬滅劑的載玻片上，激光共聚焦拍攝。

2 結(jié)果

2.1 MDCK細(xì)胞傳代培養(yǎng)的形態(tài)

觀察細(xì)胞狀態(tài)，消化后的細(xì)胞團(tuán)塊貼壁后進(jìn)行生長(zhǎng)，并逐漸鋪滿瓶底，呈鋪路石狀單層排布，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期呈火焰狀生長(zhǎng)，是典型的上皮樣細(xì)胞（圖1）。

圖1 F3代MDCK細(xì)胞（×40）

2.2 細(xì)胞凍存與復(fù)蘇

取3支凍存的MDCK細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞活率測(cè)定，并計(jì)算其平均值，MDCK細(xì)胞凍存前平均活力為96.75%，凍存1個(gè)月后復(fù)蘇，測(cè)得平均活力為93.28%，細(xì)胞活率有所下降，但對(duì)后續(xù)試驗(yàn)無(wú)實(shí)質(zhì)性影響。

2.3 MDCK細(xì)胞嘌呤霉素篩選

F3代MDCK細(xì)胞經(jīng)篩選培養(yǎng)后，第7 d細(xì)胞死亡的最低濃度為4 μg/ml（圖2）。

圖2 F3代MDCK細(xì)胞嘌呤霉素篩選（×40）

2.4 MDCK細(xì)胞感染SV40-LT病毒液及陽(yáng)性細(xì)胞篩選

由圖3可知，感染的細(xì)胞在經(jīng)過(guò)72 h后于熒光顯微鏡下觀察，感染率為50%～60%。篩選獲得的MDCK-SV40細(xì)胞系已傳至F15代。細(xì)胞均呈鋪路石狀排列，并單層生長(zhǎng)，生長(zhǎng)速度較快，按1∶3傳代后2 d就可長(zhǎng)滿瓶底，未出現(xiàn)生長(zhǎng)緩慢或漂浮死亡細(xì)胞，且未出現(xiàn)細(xì)胞衰老現(xiàn)象。

圖3 MDCK-SV40細(xì)胞感染及陽(yáng)性細(xì)胞篩選

2.5 MDCK-SV40細(xì)胞中SV40-LT基因檢測(cè)情況

本試驗(yàn)通過(guò)qPCR法分析了F3代MDCKSV40細(xì)胞的表達(dá)情況，利用未感染F3代MDCK細(xì)胞作對(duì)照，結(jié)果顯示MDCK-SV40相較于MDCK細(xì)胞中SV40-LT的基因表達(dá)差異顯著（P＞0.05，圖4），表明SV40-LT基因在MDCK細(xì)胞中經(jīng)慢病毒感染后成功表達(dá)，且傳代后表達(dá)穩(wěn)定。

圖4 MDCK-SV40中SV40-LT的表達(dá)情況

2.6 MDCK-SV40細(xì)胞中SV40-LT的基因表達(dá)情況

通過(guò)免疫熒光染色法鑒定SV40-LT在MDCK-SV40細(xì)胞蛋白中的表達(dá)。結(jié)果表明，在F15代中，SV40-LT主要表達(dá)于MDCK-SV40細(xì)胞的胞質(zhì)和細(xì)胞核周圍，SV40-LT在MDCK和MDCK-SV40細(xì)胞核中的表達(dá)強(qiáng)弱不同。未感染的MDCK細(xì)胞表達(dá)為陰性，表明SV40-LT基因成功轉(zhuǎn)入MDCK-SV40細(xì)胞中，并通過(guò)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄翻譯后穩(wěn)定表達(dá)。

圖5 細(xì)胞免疫熒光鑒定MDCK-SV40細(xì)胞中SV40-LT的表達(dá)（×40）

3 結(jié)語(yǔ)

季節(jié)性流感越發(fā)頻繁，為適用于相同數(shù)量的預(yù)備疫苗，需要更快、產(chǎn)量更高的細(xì)胞以應(yīng)對(duì)目前困境。流感病毒的生長(zhǎng)環(huán)境依賴于合適的表面受體，在MDCK細(xì)胞中病毒復(fù)制優(yōu)于其他受體。與雞胚培養(yǎng)相比，MDCK細(xì)胞的病毒產(chǎn)量較高且具有更快的生產(chǎn)過(guò)程，是疫苗生產(chǎn)的優(yōu)選宿主。

端粒酶是一種永生基因，其復(fù)合物可保持端粒長(zhǎng)度，這是細(xì)胞增殖所必需的。p53是一種促進(jìn)細(xì)胞周期阻滯、DNA修復(fù)、細(xì)胞衰老凋亡的轉(zhuǎn)錄因子，也是一種高度保守的抑癌基因。抑制p53通路即可誘導(dǎo)細(xì)胞無(wú)限增殖。SV40-LT可直接作用于p53使細(xì)胞永生化。

穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染系統(tǒng)需借助病毒載體來(lái)敲低或過(guò)表達(dá)基因，嘌呤霉素可用于選擇在這些系統(tǒng)中表達(dá)pac基因的感染細(xì)胞。本試驗(yàn)中通過(guò)不同梯度地篩選，確定MDCK的最小嘌呤霉素濃度為4 μg/ml，后續(xù)的陽(yáng)性細(xì)胞篩選中也通過(guò)對(duì)照確定了經(jīng)篩選后的細(xì)胞團(tuán)。未挑取單克隆細(xì)胞，是考慮到細(xì)胞感染后狀態(tài)較差，且單個(gè)細(xì)胞難以在短時(shí)間內(nèi)大量增殖，從而影響后續(xù)鑒定。

MDCK細(xì)胞接種后1～6 h開(kāi)始貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞倍增時(shí)間約為30 h。相較之下，MDCK-SV40倍增時(shí)間明顯縮短，生長(zhǎng)速率加快，貼壁能力增強(qiáng)，表明SV40-LT對(duì)細(xì)胞有顯著的增殖作用，且篩選后的F15代細(xì)胞仍呈鋪路石狀對(duì)數(shù)生長(zhǎng)，增殖速度穩(wěn)定，未出現(xiàn)生長(zhǎng)緩慢或大量漂浮死亡的現(xiàn)象，現(xiàn)已傳30多代。這些結(jié)果表明MDCK-SV40細(xì)胞系已成功構(gòu)建。

本研究在MDCK-SV40細(xì)胞建系過(guò)程中，只采用了SV40-LT基因?qū)氲姆椒?，選擇了2個(gè)形態(tài)、生長(zhǎng)良好的克隆株進(jìn)行連續(xù)傳代培養(yǎng)，表明SV40-LT單基因?qū)隡DCK細(xì)胞的方法是可行的。試驗(yàn)通過(guò)MDCK細(xì)胞感染SV40-LT基因，提高了細(xì)胞生長(zhǎng)速度，為永生化細(xì)胞建系研究提供了技術(shù)依據(jù)。