單子鴻，李情情，王舒穎，錢亞云，周 瑞

蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院兒科，安徽蚌埠 233004

感染性腹瀉是兒童較常發(fā)生的一類腸道傳染性疾病，具有傳播速度快、發(fā)病率高、季節(jié)性強(qiáng)等特點(diǎn)。因腹瀉容易發(fā)生脫水、電解質(zhì)紊亂及酸堿平衡失調(diào)，病情嚴(yán)重時(shí)還可能累及多臟器，甚至給患兒的生命安全造成威脅[1]。感染性腹瀉的病原體主要為病毒和細(xì)菌，盡早明確感染性腹瀉的病原體類型，對(duì)于指導(dǎo)臨床選擇合理的治療方案，及時(shí)控制患兒病情具有重要作用。目前，確診細(xì)菌感染引起的腹瀉，主要依據(jù)糞便培養(yǎng)中細(xì)菌的檢測(cè)結(jié)果，而對(duì)于病毒感染引起的腹瀉，確診主要根據(jù)酶聯(lián)免疫熒光分析法或核酸擴(kuò)增技術(shù)對(duì)病毒的檢測(cè)結(jié)果。然而，這些方法都存在耗時(shí)長(zhǎng)、靈敏度低，且無法實(shí)時(shí)反映機(jī)體病情變化等缺陷。血清降鈣素原(PCT)為急性時(shí)相反應(yīng)蛋白，細(xì)菌感染可引起血清PCT水平明顯升高，其被認(rèn)為是反映機(jī)體炎性反應(yīng)情況的敏感指標(biāo)[2]。鈣衛(wèi)蛋白(CP)是一種來源于中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的炎性反應(yīng)標(biāo)志物。在目前的臨床工作中，糞便鈣衛(wèi)蛋白(FC)多用于炎癥性腸病活動(dòng)性的判斷[3]，較少有研究關(guān)注其在感染性腹瀉病原體類型鑒別診斷中的應(yīng)用價(jià)值。鑒于血清PCT、FC與腸道炎癥關(guān)系密切，本研究擬分析FC聯(lián)合血清PCT鑒別診斷細(xì)菌感染性腹瀉和病毒感染性腹瀉的價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇本院2019年12月至2020年12月接診的90例腹瀉患兒作為觀察組，根據(jù)腹瀉病原體類型的不同分為2個(gè)亞組：細(xì)菌組(45例)和病毒組(45例)。另選擇同期本院90例體檢健康兒童作為對(duì)照組。觀察組納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡6個(gè)月至6歲。(2)符合《諸福棠實(shí)用兒科學(xué)》[4]中細(xì)菌感染性腹瀉或病毒感染性腹瀉的診斷標(biāo)準(zhǔn)。細(xì)菌感染性腹瀉診斷標(biāo)準(zhǔn)為糞便常規(guī)檢測(cè)可見白細(xì)胞增多，血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果顯示白細(xì)胞計(jì)數(shù)>10×109/L，糞便培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)致病菌；病毒感染性腹瀉診斷標(biāo)準(zhǔn)為糞便病毒檢測(cè)顯示輪狀病毒抗原陽性，血常規(guī)檢查結(jié)果顯示白細(xì)胞計(jì)數(shù)正常，部分患兒淋巴細(xì)胞百分比升高。(3)檢查前2周未使用過抗菌藥物。(4)無嚴(yán)重心、肺、肝、腎疾病及精神、神經(jīng)系統(tǒng)疾病。(5)臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)營養(yǎng)不良。(2)慢性腹瀉。(3)消化道腫瘤或畸形。(4)伴有其他臟器炎癥病變。(5)長(zhǎng)期使用非甾體類抗炎藥。細(xì)菌組、病毒組及對(duì)照組在性別構(gòu)成、年齡及臨床癥狀(嘔吐、腹痛、脫水)方面比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；細(xì)菌組和病毒組的體溫明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；細(xì)菌組與病毒組在體溫方面比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。所有研究對(duì)象家屬對(duì)本研究知情同意，本研究通過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

表1 3組研究對(duì)象一般情況比較

1.2儀器與試劑 羅氏701生化分析儀；微量低溫高速離心機(jī)；Thermo Multiskan FC酶標(biāo)儀；GETEIN 100熒光免疫定量分析儀及配套PET試劑盒；Buhlmann公司生產(chǎn)的人類FC酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒；i-CHROMA Reader免疫熒光分析儀及配套試劑；法國生物梅里埃公司生產(chǎn)的API 20E腸道菌鑒定生化條；美國ABI公司生產(chǎn)的反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)擴(kuò)增試劑盒等。

1.3檢測(cè)方法

1.3.1標(biāo)本采集 觀察組和對(duì)照組兒童分別在入院時(shí)和體檢時(shí)采集大便及空腹靜脈血標(biāo)本。留存的大便標(biāo)本在室溫下解凍，取50～100 mg標(biāo)本放入聚丙烯管中。按照質(zhì)量∶容積比為1∶49的比例在聚丙烯管中加入抽提液，利用多管螺旋混合器將標(biāo)本混合均勻，取1.5 mL標(biāo)本溶液于離心管中，離心5 min后保留上清液待檢。血液標(biāo)本在采集后2 h內(nèi)進(jìn)行離心(3 000 r/min，10 min)處理，保留血清待檢。

1.3.2FC檢測(cè) 標(biāo)本在室溫下平衡解凍，以1∶50的比例稀釋后常溫孵育，采用雙抗體夾心法進(jìn)行檢測(cè)，酶標(biāo)儀設(shè)為450 nm，標(biāo)準(zhǔn)品設(shè)600、300、100、30、10 μg/g共5個(gè)質(zhì)量水平，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)。最高水平標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值為2 397、2 284，以四參數(shù)法計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線，1∶50稀釋的標(biāo)本因超過標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍未檢出，則進(jìn)一步稀釋后重測(cè)，直至可測(cè)出為止。所有操作均嚴(yán)格按照ELISA試劑盒操作說明書進(jìn)行。

1.3.3糞便細(xì)菌培養(yǎng) 使用SS瓊脂平板接種糞便標(biāo)本，恒溫箱中孵育36 h(37 ℃)，挑選細(xì)小透明菌落接種到半固體瓊脂斜面，使用腸道菌鑒定生化條予以鑒定。

1.3.4糞便病毒檢測(cè) 取糞便標(biāo)本，采用RT-PCR技術(shù)進(jìn)行輪狀病毒、諾如病毒、扎如病毒、腸道腺病毒等檢測(cè)。標(biāo)本上清液先提取病毒核酸，再采用RT-PCR擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.5血清PCT檢測(cè) 血清標(biāo)本室溫下解凍，采用酶聯(lián)免疫熒光分析法測(cè)定PCT水平。血清PCT正常參考范圍為0～0.5 μg/L，>0.5 μg/L判為陽性。高、低水平質(zhì)控品每日分別檢測(cè)，采用Westgard規(guī)則繪制Levey-Jennings質(zhì)控圖。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以M(P25，P75)表示，組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)；繪制受試者工作特征(ROC)曲線，分析各指標(biāo)對(duì)細(xì)菌感染性腹瀉和病毒感染性腹瀉的診斷效能；ROC曲線下面積(AUC)比較采用Z檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1各組研究對(duì)象FC、血清PCT水平比較 對(duì)照組、細(xì)菌組、病毒組血清PCT水平分別為0.10(0.10,0.12)、0.56(0.14,1.85)、0.15(0.12,0.23)ng/mL，F(xiàn)C水平分別為21.35(17.95,25.78)、448.20(387.75,637.30)、134.80.00(36.00,230.00)μg/g。與對(duì)照組相比，細(xì)菌組和病毒組的FC、血清PCT水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。細(xì)菌組的FC、血清PCT水平明顯高于病毒組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2FC、血清PCT單獨(dú)及聯(lián)合檢測(cè)鑒別診斷細(xì)菌感染性腹瀉和病毒感染性腹瀉的效能 血清PCT、FC、FC+血清PCT鑒別診斷細(xì)菌感染性腹瀉和病毒感染性腹瀉的AUC分別為0.761、0.901、0.929，F(xiàn)C、FC+血清PCT的AUC明顯高于血清PCT，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=2.210、2.359，P<0.05)，F(xiàn)C+血清PCT與FC的AUC比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=1.203，P>0.05)。FC、血清PCT鑒別診斷細(xì)菌感染性腹瀉和病毒感染性腹瀉的最佳截?cái)嘀捣謩e為328.90 μg/g和0.67 ng/mL。見表2。

表2 FC、血清PCT單獨(dú)及兩者聯(lián)合檢測(cè)鑒別診斷細(xì)菌感染性腹瀉和病毒感染性腹瀉的效能

3 討 論

兒童是感染性腹瀉的高發(fā)人群，雖然該疾病可防可治，但全球每年死于感染性腹瀉的兒童數(shù)量仍居高不下，5歲以下兒童每年死于感染性腹瀉的人數(shù)超過180萬例，感染性腹瀉是全球兒童死亡的主要原因之一[5]。近年來，發(fā)達(dá)國家兒童的急性腹瀉發(fā)病率、病死率得到了有效控制，但急性感染性腹瀉仍是我國兒童住院的主要病因之一。感染性腹瀉主要由細(xì)菌、病毒等病原體感染所致，對(duì)于不同病原體引起的感染性腹瀉，臨床需要采取不同的治療方案，細(xì)菌感染性腹瀉患兒推薦使用抗菌藥物，而病毒感染性腹瀉尚無特效藥物，臨床多采取對(duì)癥治療[6]。因此，準(zhǔn)確鑒別感染性腹瀉的類型對(duì)于指導(dǎo)臨床用藥，控制病情進(jìn)展具有積極意義。

本研究結(jié)果顯示，病毒感染性腹瀉和細(xì)菌感染性腹瀉患兒在性別構(gòu)成、年齡、體溫及臨床癥狀方面未見明顯差異，表明細(xì)菌感染性腹瀉和病毒感染性腹瀉均可引起發(fā)熱、腹痛、嘔吐等癥狀，僅從臨床表現(xiàn)并不能有效區(qū)分導(dǎo)致腹瀉的病原體類型是細(xì)菌還是病毒。因此，臨床有必要借助血液、糞便等標(biāo)本檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)來對(duì)腹瀉類型進(jìn)行判定。PCT由外周血白細(xì)胞分泌后在甲狀腺C細(xì)胞中合成，有研究指出細(xì)菌感染會(huì)使PCT大量分泌[7]，其水平甚至呈幾何倍數(shù)增長(zhǎng)，但PCT在炎性反應(yīng)和病毒感染中則表現(xiàn)為輕度升高，甚至為正常水平[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，與體檢健康兒童比較，感染性腹瀉兒童的血清PCT水平明顯升高，且細(xì)菌感染性腹瀉患兒的血清PCT水平明顯高于病毒感染性腹瀉患兒，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這與楊雪利等[9]的報(bào)道結(jié)論相符，表明相對(duì)于病毒感染性腹瀉，血清PCT水平與細(xì)菌感染性腹瀉的關(guān)系更為密切。血清PCT水平通常在感染發(fā)生后的2～3 h內(nèi)開始升高，而臨床常用的C反應(yīng)蛋白則是在感染發(fā)生后12～18 h才會(huì)升高，可見血清PCT對(duì)感染更為敏感，并且血清PCT在血液中的穩(wěn)定性優(yōu)于C反應(yīng)蛋白，半衰期更長(zhǎng)，體外穩(wěn)定性也比多數(shù)細(xì)胞因子更高，這也為PCT早期診斷細(xì)菌感染奠定了基礎(chǔ)[10-12]。但從本研究結(jié)果也可以看出，在由病毒感染引起的腹瀉患兒中，同樣能夠檢出血清PCT水平升高，這可能降低血清PCT對(duì)細(xì)菌感染性腹瀉的鑒別效能。本研究通過ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，血清PCT在細(xì)菌感染性腹瀉和病毒感染性腹瀉鑒別診斷上有著較高的特異度(88.9%)，但靈敏度(64.4%)并不高。由于血清PCT鑒別細(xì)菌感染性腹瀉和病毒感染性腹瀉的靈敏度偏低，因而臨床上有必要尋求可補(bǔ)充其靈敏度不足的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)。

CP是一種炎性標(biāo)志物，能很好地反映炎癥活動(dòng)性，并且其在腸腔及體外環(huán)境中的穩(wěn)定性較好。有研究指出，CP在糞便中的水平是血漿中的6倍，所以檢測(cè)FC水平對(duì)反映胃腸道炎性反應(yīng)程度的靈敏度比檢測(cè)血液中CP水平更高，且糞便標(biāo)志物檢測(cè)方便，因而FC已成為臨床較為常用的一項(xiàng)腸道炎性反應(yīng)標(biāo)志物[13-15]。本研究結(jié)果顯示，感染性腹瀉患兒的FC水平明顯高于體檢健康兒童，并且細(xì)菌感染性腹瀉患兒的FC水平明顯高于病毒感染性腹瀉患兒，以上結(jié)果說明相對(duì)于病毒感染，F(xiàn)C對(duì)細(xì)菌感染更敏感。感染性腹瀉引起FC水平升高可能是因?yàn)椴≡w在進(jìn)入腸道后會(huì)在小腸內(nèi)不斷繁殖，同時(shí)黏附在腸道黏膜上釋放出大量的毒素，促使腸道發(fā)生分泌性反應(yīng)，進(jìn)而引發(fā)腹瀉。病原體的侵襲力還會(huì)對(duì)腸道上皮細(xì)胞產(chǎn)生直接作用，引起腸道黏膜水腫、充血，造成中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、炎癥介質(zhì)滲出，中性粒細(xì)胞經(jīng)病變黏膜遷移至腸腔，CP作為嗜中性粒細(xì)胞標(biāo)志物，其會(huì)隨著中性粒細(xì)胞的腸腔遷移而隨糞便排出，從而表現(xiàn)為FC水平升高[16-18]。本研究ROC曲線分析結(jié)果顯示，以328.90 μg/g為最佳截?cái)嘀?，F(xiàn)C對(duì)細(xì)菌感染性腹瀉和病毒感染性腹瀉的鑒別診斷的靈敏度為84.4%，特異度為100.0%，可見FC對(duì)細(xì)菌感染性腹瀉和病毒感染性腹瀉鑒別診斷均有較高的靈敏度和特異度。既往有文獻(xiàn)報(bào)道，在活動(dòng)期炎癥性腸病診斷中，F(xiàn)C的靈敏度和特異度分別為84.6%和70.0%[19]，本研究結(jié)果與之有差異，這可能與本研究納入的研究對(duì)象不同相關(guān)。SKORA等[20]報(bào)道，感染性腹瀉患兒FC水平明顯高于健康兒童。CHEN等[21]報(bào)道，細(xì)菌感染性腹瀉組FC水平高于病毒感染性腹瀉組。以上研究的結(jié)論均與本研究結(jié)果相符。由此可見，檢測(cè)FC水平不但在一定程度上能幫助排除腸道炎癥性病變，而且對(duì)細(xì)菌感染性腹瀉和病毒感染性腹瀉有較好的鑒別效能。根據(jù)ROC曲線分析結(jié)果，F(xiàn)C與血清PCT聯(lián)合檢測(cè)鑒別診斷細(xì)菌感染性腹瀉和病毒感染性腹瀉的靈敏度和AUC值較FC、血清PCT單獨(dú)檢測(cè)高，表明FC與血清PCT聯(lián)合檢測(cè)能夠有效提高對(duì)細(xì)菌感染性腹瀉和病毒感染性腹瀉的鑒別診斷效能，減少誤診率。但是本研究?jī)H分析了FC與血清PCT聯(lián)合檢測(cè)對(duì)細(xì)菌感染性腹瀉和病毒感染性腹瀉的鑒別診斷效能，未分析其他指標(biāo)，故FC與血清PCT聯(lián)合檢測(cè)鑒別細(xì)菌感染性腹瀉和病毒感染性腹瀉的靈敏度、特異度是否優(yōu)于二者分別與其他指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)，還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，細(xì)菌感染性腹瀉患兒FC和血清PCT水平明顯高于病毒感染性腹瀉患兒，F(xiàn)C聯(lián)合血清PCT檢測(cè)能有效提高兒童細(xì)菌感染性腹瀉和病毒感染性腹瀉鑒別診斷效能。