王亞倩，楊 鑫，高 楊，劉 超

河北省石家莊市第三醫(yī)院檢驗(yàn)科,河北石家莊 050011

腦卒中后患者病死率和致殘率較高，80%以上的腦卒中為急性缺血性腦卒中(AIS)[1]。CT和MRI是診斷AIS患者的主要方法，也是鑒別AIS與出血性腦卒中(HS)的主要手段。CT雖可準(zhǔn)確鑒別診斷AIS和HS，但對(duì)于早期AIS，特別是6 h以內(nèi)的AIS診斷較困難；MRI對(duì)發(fā)病6 h以內(nèi)的病灶診斷最靈敏，但其價(jià)格較昂貴且MRI不應(yīng)用于急診，因此，其診斷早期腦卒中較困難[2]。AIS最有效的治療手段是重組人組織型纖溶酶原激活劑(rtPA)溶栓治療，但其治療時(shí)間窗較狹窄，從而限制其臨床應(yīng)用。因此，對(duì)于AIS的早期預(yù)測(cè)和預(yù)后評(píng)估，需要尋找有效的生物標(biāo)志物。小分子核糖核酸(miRNA)是一組由20～24個(gè)核苷酸構(gòu)成的非編碼、內(nèi)源性單鏈RNA分子，通過調(diào)節(jié)基因表達(dá)在多種生理和病理過程中扮演重要角色，主要包括細(xì)胞增殖、代謝、免疫、炎性反應(yīng)、腫瘤發(fā)生等[3]。此外，miRNA可能與神經(jīng)發(fā)育及功能有關(guān)，與靶基因共同參與炎性反應(yīng)、神經(jīng)血管再生、腦水腫形成等與AIS相關(guān)的病理、生理過程。目前，有研究表明，miRNA可以在血漿、血清、尿液和腦脊液等多種體液中檢測(cè)到，且非常穩(wěn)定，這表明其有可能作為診斷或監(jiān)測(cè)治療各種疾病的生物標(biāo)志物，包括AIS[4]，提示miRNA可能是AIS患者早期預(yù)測(cè)的分子標(biāo)志物和有效的治療靶標(biāo)。在具有差異性表達(dá)的miRNA譜中，miR-PC-5P-12969、miR-422b、miR-221-3p在發(fā)生AIS時(shí)表達(dá)最明顯[5-6]，但3項(xiàng)指標(biāo)與AIS疾病嚴(yán)重程度的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。因此，本研究旨在探討不同嚴(yán)重程度的AIS患者血清miR-PC-5P-12969、miR-422b、miR-221-3p表達(dá)水平及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2017年1月至2020年1月本院收治的141例初診為AIS的患者作為研究組，其中：男64例，女77例；年齡51～84歲，平均(69.34±6.52)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合《中國急性缺血性腦卒中診治指南2018》[7]診斷標(biāo)準(zhǔn)；急性起病(24 h內(nèi))；臨床體征有局部或全身神經(jīng)功能障礙；經(jīng)CT灌注成像 (CTP)或磁共振成像(MRI)+擴(kuò)散加權(quán)成像(DWI)檢查明確病灶。排除標(biāo)準(zhǔn)：復(fù)發(fā)性腦梗死；經(jīng)計(jì)算機(jī)體層血管成像(CTA)等檢查確定為非血管性病變；頭顱CT或MRI檢查診斷為HS；嚴(yán)重心、腎功能障礙；合并惡性腫瘤及血液系統(tǒng)疾?。换季窦膊』虼嬖谝庾R(shí)障礙不能配合完成本研究。按照美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表(NIHSS)評(píng)分，將AIS患者分為輕度組、中度組、重度組。輕度組46例，NIHSS<5分，男19例、女27例，年齡51～79歲、平均(62.28±6.52)歲；中度組51例，5分≤NIHSS≤20分，男22例、女29例，年齡55～80歲、平均(68.05±6.52)歲；重度組44例，NIHSS>20分，男23例、女21例，年齡58～84歲、平均(71.64±6.52)歲。另外收集50例同期來本院腦血管門診就診，并最終經(jīng)各種檢查確診僅為一般性心腦血管疾病，無梗死病灶，無局部或全身神經(jīng)功能障礙的普通患者作為對(duì)照組，男23例、女27例，年齡54～82歲、平均(68.61±6.52)歲。收集并記錄所有研究對(duì)象的基線資料，包括性別、年齡、空腹血糖、三酰甘油、總膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、高血壓、糖尿病、高脂血癥、體質(zhì)量指數(shù)、吸煙史、飲酒史及短暫性腦缺血發(fā)作(TIA)病史，研究組與對(duì)照組上述資料比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者家屬均簽署知情同意書。

表1 研究組與對(duì)照組基線資料比較[n/n或或n(%)]

組別n高血壓糖尿病高脂血癥體質(zhì)量指數(shù)(kg/m2)吸煙史飲酒史TIA病史研究組14182(58.16)69(48.94)27(19.15)22.65±2.3474(52.48)41(29.08)23(16.31)對(duì)照組5031(62.00)18(36.00)14(28.00)22.91±1.8625(50.00)13(26.00)8(16.00)χ2/t0.2262.491.7151.3040.0910.1720.003P0.6350.1150.190 0.2560.7630.6780.959

1.2血清miR-PC-5P-12969、miR-422b、miR-221-3p檢測(cè) 所有研究對(duì)象均于入院當(dāng)天抽取靜脈血5 mL，置于未加入抗凝劑的真空采血管中，室溫下進(jìn)行離心操作，離心后吸取上層血清并加入提取劑(TRIzol)，于-80 ℃保存以備使用。按照試劑盒(安捷倫科技有限公司，加利福尼亞州，美國)說明書提取血清中總RNA，用去除基因組反轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海西唐生物科技有限公司)將待測(cè)標(biāo)本反轉(zhuǎn)錄為cDNA。反轉(zhuǎn)錄體系為10 μL∶2 μL mix，≤5 00 ng RNA，加入無RNA酶水至反應(yīng)溶液體積10.0 mL。采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)血清miR-PC-5P-12969、miR-422b、miR-221-3p表達(dá)水平，采用miRNA熒光定量檢測(cè)試劑盒及75200熒光定量擴(kuò)增儀(北京博凌科為生物科技有限公司)檢測(cè)。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min，再進(jìn)行95 ℃變性10 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸25 s，40個(gè)循環(huán)。PCR總反應(yīng)體系為20.0 μL：以SnoR-202為內(nèi)參，特定正向引物1.0 μL，常用反向引物1.0 μL，2× SYBRVR Green PCR 10.0 μL，cDNA 1.0 μL，最后加入無RNA酶水至反應(yīng)溶液20.0 μL。引物購自北京博凌科為生物科技有限公司。采用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1各組3種血清miRNA的表達(dá)水平 輕度組、中度組、重度組AIS患者血清miR-PC-5P-12969、miR-422b、miR-221-3p表達(dá)水平均明顯低于對(duì)照組，且3項(xiàng)指標(biāo)表達(dá)水平均隨AIS疾病的嚴(yán)重程度增加呈降低趨勢(shì)，兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組3種血清miRNA的表達(dá)水平

2.2多因素Logistic回歸分析發(fā)生AIS的危險(xiǎn)因素 采用逐步后退多因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，血清miR-PC-5P-12969、miR-422b和miR-221-3p水平降低是發(fā)生AIS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)。見表3。

表3 多因素Logistic回歸分析發(fā)生AIS的危險(xiǎn)因素

2.3ROC曲線分析3種血清miRNA診斷AIS的效能 ROC曲線分析結(jié)果顯示，血清miR-PC-5P-12969、miR-422b、miR-221-3p診斷AIS的AUC分別為0.815、0.756、0.771，且具有較高的特異度和靈敏度。見表4和圖1。

表4 3種血清miRNA診斷AIS的效能

圖1 3種血清miRNA診斷AIS的ROC曲線

3 討 論

AIS是腦缺血后發(fā)生的一系列病理事件，最終可導(dǎo)致不可逆性神經(jīng)損傷，是中老年人最常見的心腦血管疾病之一。臨床癥狀主要為腦缺血壞死區(qū)域?qū)?yīng)的神經(jīng)功能缺損，診斷主要依靠詢問病史、查體和影像學(xué)檢查，部分患者早期影像學(xué)檢查未見異常表現(xiàn)，部分影像學(xué)檢查表現(xiàn)不典型，而溶栓治療時(shí)間窗在6 h以內(nèi)。血液標(biāo)本是最易獲得的檢測(cè)標(biāo)本，血清中存在穩(wěn)定的miRNA，在冠心病、腫瘤等疾病中可呈特征性表達(dá)譜[8]，目前，尚缺乏可靠的血液生物標(biāo)志物預(yù)測(cè)AIS。因此，探索血清生物標(biāo)志物miRNA用于AIS的診斷、預(yù)測(cè)病情變化的臨床價(jià)值具有重要意義。

miRNA參與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，是多種疾病的潛在生物標(biāo)志物，如腫瘤、阿爾茨海默病和AIS[9]。有研究表明，miRNA是診斷AIS或判斷預(yù)后的潛在標(biāo)志物[10]。另有研究表明，miRNA在AIS中扮演著重要角色，如參與動(dòng)脈粥樣硬化、炎性反應(yīng)、神經(jīng)血管再生、細(xì)胞凋亡、腦水腫形成等[11]。特異性miRNA的異常表達(dá)通過改變靶基因表達(dá)調(diào)節(jié)缺血后神經(jīng)的死亡[7]。有研究表明，miR-PC-5P-12969通過抑制顱內(nèi)血管miRNA的翻譯，使淀粉樣蛋白表達(dá)減少，誘發(fā)AIS；腦血管動(dòng)脈粥樣硬化的斑塊脫落、血管堵塞，發(fā)生腦卒中，導(dǎo)致腦組織中miR-PC-5P-12969表達(dá)上調(diào)，但外周血中的miR-PC-5P-12969表達(dá)降低[12]。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示，在AIS誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞中miR-PC-5P-12969表達(dá)水平升高了兩倍。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，小鼠大腦皮層的miR-PC-5P-12969水平在AIS后4 h和1 d內(nèi)明顯升高，且正常腦組織中miR-PC-5P-12969表達(dá)在觀察時(shí)間內(nèi)呈低表達(dá),且表達(dá)量沒有明顯改變[12]。VIJAYAN 等[5]的研究表明，miR-PC-5P-12969僅在缺血狀態(tài)下才表達(dá)，可作為AIS特異性生物標(biāo)志物。

miR-422b最初在HL-60白血病細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，通過調(diào)控細(xì)胞PGC1β蛋白表達(dá)調(diào)節(jié)細(xì)胞與機(jī)體的氧化代謝[12]。筆者推測(cè)在AIS患者中，因腦組織缺血缺氧，導(dǎo)致氧化代謝水平降低，從而使PGC1β蛋白表達(dá)減少，進(jìn)一步導(dǎo)致血清miR-422b表達(dá)水平降低。miR-221前體的3′端加工即為miR-221-3p。miR-221-3p在血管平滑肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞中呈高表達(dá)[13]。血管損傷、血管平滑肌細(xì)胞的增殖和新生內(nèi)膜的生長導(dǎo)致血管平滑肌細(xì)胞中miR-221-3p表達(dá)上調(diào)[14]，在動(dòng)脈粥樣硬化患者的血管內(nèi)皮細(xì)胞中miR-221-3p表達(dá)上調(diào)[15]。AIS主要表現(xiàn)為頸部和顱內(nèi)動(dòng)脈血管粥樣硬化、血管損傷，血管中miR-221-3p表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致血清中miR-221-3p表達(dá)降低。WANG等[6]研究顯示，AIS患者血清miR-221-3p和miR-382-5p水平明顯低于健康對(duì)照者。本研究結(jié)果顯示，3組AIS患者3種血清miRNA表達(dá)均明顯低于對(duì)照組，隨著神經(jīng)功能缺損的加重，AIS的3種miRNA表達(dá)呈明顯的降低趨勢(shì)(P<0.05)。表明AIS患者血清miRNA表達(dá)降低，且神經(jīng)功能缺損越嚴(yán)重的患者，血清miRNA水平越低，因此，3種血清miRNA可能是診斷AIS發(fā)生及判斷AIS病情嚴(yán)重程度的潛在指標(biāo)。

本研究多因素Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，血清miR-PC-5P-12969、miR-422b和miR-221-3p水平降低是發(fā)生AIS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。ROC曲線分析顯示，血清miR-PC-5P-12969、miR-422b和miR-221-3p水平對(duì)AIS的診斷具有較高的特異度和靈敏度，與以往研究結(jié)論一致[5-6]。

本研究存在的主要問題：樣本相對(duì)較少，只是一個(gè)研究中心的結(jié)果；沒有做3種miRNA與AIS療效、預(yù)后的相關(guān)性探討；3種miRNA定量平臺(tái)無標(biāo)準(zhǔn)化處理流程，特別是引物序列、內(nèi)參及試劑比例與操作方案的標(biāo)準(zhǔn)化，檢測(cè)結(jié)果的重復(fù)性與可靠性有待商榷。因此，未來的研究需先建立標(biāo)準(zhǔn)化的檢測(cè)方法，然后在可獲得穩(wěn)定檢測(cè)結(jié)果的情況下，調(diào)查健康人群的參考范圍，再研究指標(biāo)與疾病發(fā)生發(fā)展、治療效果和預(yù)后的關(guān)系，使檢測(cè)結(jié)果可在臨床中使用。

綜上所述，血清miR-PC-5P-12969、miR-422b和miR-221-3p在AIS患者中表達(dá)降低，其表達(dá)水平隨著AIS疾病嚴(yán)重程度增加而呈降低趨勢(shì)，3項(xiàng)指標(biāo)降低均為發(fā)生AIS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，是早期診斷AIS、判斷AIS嚴(yán)重程度的潛在血清學(xué)標(biāo)志物。