李 娜，王 倩，夏 康，孫曉曦，展丙香，吳 璇，陳 晨，鄭其平△

1.安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院輸血科，安徽合肥 230022；2.江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212013

骨骼包括兩種組織，即分別由成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞形成的骨與軟骨。骨骼的發(fā)育或形成又有兩種方式：膜內(nèi)成骨及軟骨內(nèi)成骨。正常生理狀況下，機(jī)體的膜內(nèi)成骨和軟骨內(nèi)成骨合理、協(xié)調(diào)地進(jìn)行。當(dāng)膜內(nèi)成骨受損時(shí)可致多種頜面部骨骼畸變，而軟骨內(nèi)成骨異常則可致骨與軟骨發(fā)育不良或過(guò)生長(zhǎng)[1-3]。 P63作為P53抑癌基因家族的重要成員，同時(shí)發(fā)揮了抑癌基因(介導(dǎo)細(xì)胞衰老)和原癌基因(促增殖、促生長(zhǎng))的雙重作用[4-5]。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)除了嚴(yán)重的上皮缺陷，P63基因缺失型小鼠的肢體嚴(yán)重縮短或缺如并伴有頜面部異常[6-7]。此外，P63基因突變也可致人體發(fā)生明顯的骨骼改變，進(jìn)一步說(shuō)明P63基因在機(jī)體骨骼發(fā)育，尤其是軟骨內(nèi)成骨中的作用[4,8]。然而，小鼠P63有8種變異體[9-10]，這些變異體與骨骼發(fā)育的關(guān)聯(lián)目前知之甚少?；谇捌趯?duì)P63變異體的研究，筆者推測(cè)TAP63γ是控制長(zhǎng)骨發(fā)育的效應(yīng)P63變異體[2,11]。MCT 細(xì)胞是經(jīng)過(guò)SV40大T抗原轉(zhuǎn)化的軟骨細(xì)胞，這些細(xì)胞在32 ℃培養(yǎng)時(shí)可持續(xù)生長(zhǎng)，而在37 ℃培養(yǎng)時(shí)會(huì)出現(xiàn)生長(zhǎng)阻滯并高表達(dá)十型膠原蛋白基因(Col10a1基因)[1]。ATDC5細(xì)胞是由小鼠畸胎瘤衍生的細(xì)胞系，具有類(lèi)似于軟骨細(xì)胞的生長(zhǎng)特性， 長(zhǎng)期培養(yǎng)(+ITS誘導(dǎo))可向分化成熟過(guò)渡，并且也高表達(dá)Col10a1等基因[2]。TAP63γ基因在肥大型MCT細(xì)胞和經(jīng)誘導(dǎo)向成熟分化的ATDC5細(xì)胞中的水平明顯升高[10]，提示TAP63γ基因可能在軟骨細(xì)胞分化成熟時(shí)起作用。因此，本研究擬進(jìn)一步探討TAP63γ基因如何影響Col10a1基因表達(dá)及軟骨細(xì)胞的分化與成熟。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑 主要儀器：細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo Fisher Scientific)、PCR儀(GENE)、熒光定量PCR儀(BIO-RAD)。主要試劑：TRIzol 試劑盒(15596018，Invitrogen)、iScriptTMcDNA Synthesis Kit(1708890，BIO-RAD)、DreamTaq Green PCR Master Mix(2x)(K1071，Thermo Fisher Scientific)、iQTMSYBR Green Supermix(1708882，BIO-RAD)、ITS(胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-Selenium-硒)、ITS(13146，Sigma)、引物(上海生工生物工程有限公司)、茜素紅染色試劑盒(A5533，Sigma)、堿性磷酸酶染色試劑盒(南京建成生物研究所CAKP D001-2)、阿爾新藍(lán)染色試劑盒(上海生工生物工程有限公司A0298-1g)、TAP63γ基因 SiRNA(SR417746,Origene)、pCMV6-TAP63γ基因過(guò)表達(dá)載體(MR227536，Origene)、pCMV6空載體(PS100001，Origene)、LipofectamineTM2000脂質(zhì)體(11668027，Invitrogen)、G418(158782，MP Biomedicals)。

1.2方法

1.2.1引物設(shè)計(jì) 在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中查找基因的mRNA序列(NCBI，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene)。運(yùn)用Primer3軟件設(shè)計(jì)引物，并在PubMed-Blast中驗(yàn)證所設(shè)計(jì)的引物，見(jiàn)表1。

表1 qRT-PCR引物

1.2.2MCT與ATDC5細(xì)胞株的培養(yǎng) (1)MCT細(xì)胞使用含有8%FBS的DMEM培養(yǎng)基，置于8%CO2的32 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。MCT細(xì)胞培養(yǎng)至80%融合度時(shí)，把MCT細(xì)胞從32 ℃、8%CO2的培養(yǎng)箱移到37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，兩種狀態(tài)下(32 ℃/37 ℃)的MCT細(xì)胞需做3個(gè)復(fù)孔，隔1 d換1次培養(yǎng)液。(2)ATDC5細(xì)胞使用含有5%FBS的DMEM/F12(1∶1)培養(yǎng)基，置于5%CO2的37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。ATDC5細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合度時(shí)，加入含1%ITS誘導(dǎo)劑的完全培養(yǎng)基開(kāi)始誘導(dǎo)培養(yǎng)。開(kāi)始誘導(dǎo)記為0 d(無(wú)ITS)，兩組的ATDC5細(xì)胞均需做3個(gè)復(fù)孔，隔1 d換1次培養(yǎng)液。

1.2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染及瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 使用干擾片段TAP63γ基因 SiRNA，分別轉(zhuǎn)染MCT細(xì)胞(32 ℃培養(yǎng)24 h后轉(zhuǎn)入37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h)和ATDC5細(xì)胞(37 ℃培養(yǎng)24 h)，即轉(zhuǎn)染干擾片段組。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染： 分別轉(zhuǎn)染TAP63γ基因表達(dá)質(zhì)粒和pCMV空載體質(zhì)粒，利用G418篩選，生成了過(guò)表達(dá)TAP63γ基因(目的組)和含有空載體(對(duì)照組)的ATDC5穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系[6]，未進(jìn)行轉(zhuǎn)染的ATDC5細(xì)胞系設(shè)為空白組。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)參照說(shuō)明書(shū)和參考文獻(xiàn)[3,6]進(jìn)行。簡(jiǎn)要的步驟如下：待細(xì)胞長(zhǎng)至 70%～80%融合度時(shí)， MCT/ATDC5 細(xì)胞使用LipofectamineTM2000無(wú)血清轉(zhuǎn)染 6 h后，完全培養(yǎng)基再培養(yǎng) 24～48 h。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染再換含有G418的完全培養(yǎng)液，并連續(xù)培養(yǎng)兩周，隔1 d換1次培養(yǎng)液，剩下沒(méi)有被殺死的細(xì)胞繼續(xù)傳代培養(yǎng)，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4細(xì)胞RNA提取、反轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR 使用TRIzol試劑進(jìn)行RNA的提取，按說(shuō)明書(shū)的實(shí)驗(yàn)步驟依次進(jìn)行RNA提取、DNA酶處理及反轉(zhuǎn)錄。得到的cDNA 1∶10稀釋?zhuān)凑読QTMSYBR Green supermix反應(yīng)體系配比，在BIO-RAD熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增。Gapdh作為內(nèi)參和目的基因同時(shí)進(jìn)行qRT-PCR，采用相對(duì)定量2-ΔΔCT方法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5細(xì)胞染色 染色實(shí)驗(yàn)參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，簡(jiǎn)要步驟如下。阿爾新藍(lán)染色：細(xì)胞采用-20 ℃甲醇固定2 min，加入0.1%的阿爾新藍(lán)(0.1 g阿爾新藍(lán)粉末加入鹽酸溶液至100 mL，配成0.1 mol/L的鹽酸溶液)，靜置過(guò)夜，洗凈鏡檢；堿性磷酸酶染色：4%多聚甲醛固定1 min，加入新鮮配制的堿性磷酸酶染液，濕盒內(nèi)37 ℃避光孵育10 min，洗凈，蘇木精-伊紅復(fù)染3～5 min，洗凈鏡檢；茜素紅染色：95%乙醇固定10 min，洗凈后加入1%茜素紅(pH值6.4)，室溫靜置10 min，洗凈鏡檢。

1.3觀察指標(biāo) (1)分析TAP63γ基因和Col10a1基因分別在增殖/肥大狀態(tài)下小鼠MCT細(xì)胞和ATDC5細(xì)胞中的表達(dá)；(2)過(guò)表達(dá)或抑制TAP63γ基因，觀察其對(duì)Col10a1基因表達(dá)的調(diào)控作用；(3)進(jìn)行細(xì)胞染色，并比較誘導(dǎo)培養(yǎng)第4、7、14、21天的對(duì)照組與目的組的陽(yáng)性染色面積。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 目的基因在肥大型軟骨細(xì)胞內(nèi)和增殖型軟骨細(xì)胞內(nèi)的比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1Col10a1基因與TAP63γ基因在兩種肥大型軟骨細(xì)胞模型中的表達(dá) MCT細(xì)胞在37 ℃誘導(dǎo)3 d后Col10a1基因相對(duì)表達(dá)量為50.20±1.99(P<0.001)，TAP63γ基因相對(duì)表達(dá)量為4.90±0.13，與32 ℃增殖狀態(tài)下MCT細(xì)胞基因相對(duì)表達(dá)量(基因相對(duì)表達(dá)量設(shè)為1)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。ATDC5細(xì)胞在肥大狀態(tài)下(ITS誘導(dǎo)14 d)Col10a1基因相對(duì)表達(dá)量為2.60±0.79，TAP63γ基因的相對(duì)達(dá)量為2.58±0.10，與ATDC5細(xì)胞在增殖狀態(tài)下(無(wú)ITS)基因相對(duì)表達(dá)量(基因相對(duì)表達(dá)量設(shè)為1)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2ATDC5細(xì)胞中過(guò)表達(dá)TAP63γ基因?qū)ol10a1基因的影響 在誘導(dǎo)培養(yǎng)的第0、7、21天，發(fā)現(xiàn)目的組的TAP63γ基因相對(duì)表達(dá)量明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；同時(shí)在第7、14、21天，目的組的Col10a1基因相對(duì)表達(dá)量明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)?？瞻捉M與對(duì)照組TAP63γ基因、Col10a1基因相對(duì)表達(dá)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 不同誘導(dǎo)時(shí)間的TAP63γ基因、Col10a1基因相對(duì)表達(dá)量

2.3空白組和轉(zhuǎn)染干擾片段組細(xì)胞中TAP63γ基因與Col10a1基因的表達(dá) 在MCT細(xì)胞中，與空白組(基因相對(duì)表達(dá)量設(shè)為1)比較，轉(zhuǎn)染干擾片段組TAP63γ基因相對(duì)表達(dá)量(0.79±0.11)明顯降低，同時(shí)Col10a1基因相對(duì)表達(dá)量(0.68±0.03)也明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 在ATDC5細(xì)胞中，與空白組(基因相對(duì)表達(dá)量設(shè)為1)比較，轉(zhuǎn)染干擾片段組TAP63γ基因相對(duì)表達(dá)量(0.42±0.10)明顯降低，同時(shí)Col10a1基因相對(duì)表達(dá)量(0.35±0.04)也明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4染色結(jié)果 阿爾新藍(lán)染色在誘導(dǎo)培養(yǎng)的第7天顯示出最強(qiáng)的染色強(qiáng)度，但目的組與對(duì)照組間沒(méi)有顯示出明顯的差異。同時(shí)在第4、14、21天也沒(méi)有觀察到明顯的染色強(qiáng)度差異(圖1)。在誘導(dǎo)培養(yǎng)的第21天，觀察到目的組與對(duì)照組相比顯示出更強(qiáng)的堿性磷酸酶染色強(qiáng)度(圖2)。對(duì)誘導(dǎo)培養(yǎng)第21天的目的組和對(duì)照組進(jìn)行茜素紅染色，然而并沒(méi)有觀察到明顯的染色強(qiáng)度差異(圖3)。

圖1 阿爾新藍(lán)染色結(jié)果(×4)

圖3 茜素紅染色結(jié)果(×4)

3 討 論

大量的研究揭示了P63基因在腫瘤形成和發(fā)育過(guò)程中的多樣性功能[12-13]。由于啟動(dòng)子的不同和可變剪接，P63含有多種異構(gòu)體，不同異構(gòu)體之間也會(huì)產(chǎn)生相互作用[14-15]，這不僅導(dǎo)致了P63基因功能的多樣性，同時(shí)也阻礙了對(duì)其體內(nèi)功能的研究。小鼠肢體的缺陷主要?dú)w于受損的上皮發(fā)育，即頂外胚層脊缺失導(dǎo)致肢體的起始發(fā)育不能正常進(jìn)行。然而，肢體縮短和頜面部骨骼改變提示P63缺失型小鼠的軟骨內(nèi)成骨和膜內(nèi)成骨均受損[16-17]。這些結(jié)果提示P63可能在機(jī)體的軟骨內(nèi)成骨過(guò)程中發(fā)揮重要作用 。

本研究進(jìn)行了TAP63γ基因在兩種軟骨細(xì)胞模型中的表達(dá)分析。結(jié)果表明，相比增殖型細(xì)胞，肥大型MCT和ATDC5細(xì)胞中Col10a1基因的上調(diào)與增加的TAP63γ基因表達(dá)一致。為了確認(rèn)兩個(gè)基因之間的相關(guān)性，本研究在ATDC5細(xì)胞中過(guò)表達(dá)TAP63γ基因，可見(jiàn)Col10a1基因相對(duì)表達(dá)量上調(diào)；同時(shí)，在MCT和ATDC5細(xì)胞中抑制TAP63γ基因的表達(dá)活性則進(jìn)一步降低Col10a1基因的表達(dá)。這些結(jié)果證明了TAP63γ基因和Col10a1基因表達(dá)之間的直接關(guān)聯(lián)。在誘導(dǎo)培養(yǎng)的第21天，觀察到TAP63γ基因過(guò)表達(dá)(目的組)與對(duì)照組相比顯示出更強(qiáng)的堿性磷酸酶染色強(qiáng)度(圖2)。與此同時(shí)，在目的組和對(duì)照組之間，阿爾新藍(lán)染色和茜素紅染色都沒(méi)有檢測(cè)到明顯差異(圖1、3)。這些結(jié)果清楚地表明TAP63γ基因促進(jìn)和加速軟骨細(xì)胞肥大分化并可能促進(jìn)隨后的基質(zhì)礦化，而在ATDC5細(xì)胞早期的增殖和后期的成骨分化階段中可能影響甚微。

此前的研究表明TAP63γ基因型異構(gòu)體可能在胚胎骨骼發(fā)育的不同階段發(fā)揮不同功效，TAP63γ基因可能參與軟骨內(nèi)成骨過(guò)程中的軟骨成熟[10,18]。Col10a1基因是軟骨內(nèi)成骨過(guò)程中眾所周知的肥大型軟骨細(xì)胞的標(biāo)志基因。在本研究中，進(jìn)一步分析了TAP63γ基因與Col10a1基因的關(guān)系，以及TAP63γ基因?qū)浌羌?xì)胞分化成熟的影響。本研究已經(jīng)用數(shù)據(jù)表明TAP63γ基因表達(dá)對(duì)Col10a1基因的正向調(diào)控作用，還證實(shí)了Col10a1基因上調(diào)與體外軟骨內(nèi)成骨的細(xì)胞模型中增強(qiáng)的軟骨細(xì)胞肥大分化相一致。這些發(fā)現(xiàn)可能解釋和支持TAP63γ基因在骨折愈合過(guò)程中類(lèi)似于軟骨內(nèi)成骨的作用。然而，關(guān)于TAP63γ基因在骨的形成和修復(fù)中的確切機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究。