張 妍，王子豪，李凱月，王俊平

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)植物醫(yī)學(xué)學(xué)院，山東青島 266000)

球孢白僵菌是一種廣泛用于農(nóng)林害蟲(chóng)生物防治的昆蟲(chóng)病原真菌，同時(shí)球孢白僵菌對(duì)植物的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用，并且能提高植物的抗病性(隋麗等, 2018)。在煙草上接種球孢白僵菌后，煙蚜的死亡率在第4～5天達(dá)到死亡高峰，對(duì)煙草植株上的煙蚜具有較強(qiáng)的致病侵染力(徐繼偉等, 2019)。在研究中還發(fā)現(xiàn)球孢白僵菌處理植物可提高植物的防御能力，降低害蟲(chóng)對(duì)其危害程度，球孢白僵菌處理玉米和高粱后，發(fā)現(xiàn)兩種植物中棉鈴蟲(chóng)Helicoverpaarmigera蛀食減少，并且未在植株上觀察到白僵菌引起的傷害(Cherryetal., 1999; Reddyetal., 2009)；隨后發(fā)現(xiàn)用球孢白僵菌接種的番茄和棉花飼喂棉鈴蟲(chóng)，棉鈴蟲(chóng)死亡率高于對(duì)照組(Powelletal., 2009; Lopez and Gregory, 2015)，并且球孢白僵菌可促進(jìn)植物的生長(zhǎng)(Lopez and Gregory, 2015)。球孢白僵菌處理罌粟和香蕉后可減少鉆蛀性害蟲(chóng)罌粟抗莖癭蜂和香蕉莖象甲Cosmopolitessordidus的危害(Akelloetal., 2008; Quesadaetal., 2009)。除球孢白僵菌處理植物就有抗蟲(chóng)能力以外，其他真菌也有相似的功能，頂孢霉Acremoniumhansfordii接種蠶豆后飼喂棉鈴蟲(chóng)其死亡率高于對(duì)照組，發(fā)現(xiàn)了還可延長(zhǎng)棉鈴蟲(chóng)的生長(zhǎng)周期(Jaberetal., 2010)。

本課題組在研究中發(fā)現(xiàn)球孢白僵菌灌根處理黃瓜后，西花薊馬對(duì)葉片危害面積顯著低于對(duì)照組，但是未見(jiàn)針對(duì)這一問(wèn)題的相關(guān)研究。為了探討該現(xiàn)象出現(xiàn)的原因，采用球孢白僵菌對(duì)黃瓜進(jìn)行灌根，以確定處理過(guò)的黃瓜植株體內(nèi)幾種防御酶、次生代謝物、可溶性蛋白的含量變化；并利用EPG技術(shù)分析西花薊馬在黃瓜上的取食行為，以期為進(jìn)一步利用球孢白僵菌防控西花薊馬提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

西花薊馬種群在室內(nèi)以蕓豆為食物連續(xù)飼養(yǎng)120代以上，飼養(yǎng)條件為溫度27℃±1℃，相對(duì)濕度75%±5%，光周期L ∶D=16 ∶8；從僵蠶上分離純化獲得球孢白僵菌菌株Bb33A (KU517852)，保存于青島農(nóng)業(yè)大學(xué)昆蟲(chóng)生理生態(tài)研究室；黃瓜種子(津研四號(hào))，基質(zhì)(草炭土 ∶蛭石 ∶珍珠巖=1 ∶1 ∶1)，購(gòu)于青島德地得農(nóng)化服務(wù)有限公司；直流刺吸電位儀(Direct current electrical penetration graph, DC-EPG)。

1.2 球孢白僵菌的培養(yǎng)和分生孢子液的制備

1.2.1球孢白僵菌的培養(yǎng)

參考張志建等(2017)方法將球孢白僵菌在SDAY培養(yǎng)基上于25℃，光照L ∶D=10 ∶14的條件下培養(yǎng)7 d，無(wú)菌棒刮取分生孢子粉于1.5 mL Eppendorf管中(張志建等, 2017)。

1.2.2球孢白僵菌分生孢子液的制備

將球孢白僵菌溶于0.05% Tween-80中，并以0.05% Tween-80、無(wú)菌水作為對(duì)照。在渦旋震蕩器上震蕩10 min，使白僵菌孢子充分分散。梯度稀釋至適宜濃度，用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下統(tǒng)計(jì)溶液中的孢子數(shù)量，每株菌株觀察5個(gè)視野。重復(fù) 3次，分生孢子終濃度為1×108和1×109spores/mL。

1.3 球孢白僵菌灌根處理黃瓜

大小均勻飽滿(mǎn)的黃瓜種子浸于水中6 h，將其栽種到花盆中。栽培7 d后將50 mL無(wú)菌水、0.05% Tween-80溶液和球孢白僵菌分生孢子溶液(濃度分別為1×108spores/mL和1×109spores/mL)，分別倒入生長(zhǎng)一致的黃瓜幼苗中，于25℃，光照L ∶D=16 h ∶8 h下培養(yǎng)7 d。

1.4 西花薊馬對(duì)黃瓜為害

將15頭西花薊馬初孵雌成蟲(chóng)接于栽培7 d后的黃瓜苗上，24 h后移除西花薊馬，處理后第4，5，6，7天記錄西花薊馬成蟲(chóng)和幼蟲(chóng)數(shù)量，17 d后進(jìn)行為害葉片拍照，每處理重復(fù)5次，利用使用Image J軟件對(duì)葉片危害面積進(jìn)行分析。

1.5 球孢白僵菌處理的黃瓜葉片物質(zhì)測(cè)定

1.5.1丙二醛MDA、可溶性蛋白含量、CAT、POD和SOD活性測(cè)定

丙二醛MDA、可溶性蛋白含量、CAT、POD和SOD活性測(cè)定分別用蘇州科銘生物技術(shù)有限公司的MDA-1-Y丙二醛(MDA)試劑盒、KMSP-1-W考馬斯亮藍(lán)法蛋白含量測(cè)試盒、CAT-1-Y過(guò)氧化氫酶(CAT)試劑盒(紫外吸收法)、POD-1-Y過(guò)氧化物酶(POD)試劑盒和SOD-1-Y超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)試盒(NBT法)進(jìn)行測(cè)定。取處理后第7天和第14天的黃瓜葉片，嚴(yán)格按照試劑盒中方法提取待測(cè)物質(zhì)，然后進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)測(cè)定，每處理均重復(fù)3次。

1.5.2次生代謝物質(zhì)類(lèi)黃酮和單寧含量測(cè)定

類(lèi)黃酮和單寧的含量分別用LHT-1-G植物類(lèi)黃酮測(cè)試盒和DN-1-Y單寧含量試劑盒(蘇州科銘生物技術(shù)有限公司生產(chǎn))進(jìn)行測(cè)定。取處理后第7、9、11、13和15天取黃瓜葉片，按照相關(guān)說(shuō)明書(shū)要求提取待測(cè)物質(zhì)后進(jìn)行含量測(cè)定，每處理均重復(fù)3次。

1.6 刺吸電位波形EPG分析

對(duì)經(jīng)球孢白僵菌(1×108spores/mL)處理后7 d的黃瓜幼苗進(jìn)行EPG分析，采用具有八通道EPG刺吸電位儀(DC-EPG型)進(jìn)行取食行為觀察(胡想順等, 2006; 張玉秀等, 2014)。首先將西花薊馬成蟲(chóng)置于冰袋上，然后用銀膠將金絲線粘合在其背板上；待銀膠干后，將薊馬置于平面上自由活動(dòng)1 h，使其適應(yīng)背部粘合金線的狀態(tài)。然后，將長(zhǎng)約10 cm的銅質(zhì)棒狀植物電極插人植株盆栽土壤中，再將粘好薊馬的銅釘插人對(duì)應(yīng)的插槽內(nèi)，薊馬置于供試植株頂端第2片真葉的葉面上，使其可以相對(duì)自由地活動(dòng)。整個(gè)試驗(yàn)置于80 cm×70 cm×80 cm的金屬籠中，以避免噪音干擾，試驗(yàn)條件為溫度(27±1)℃，相對(duì)濕度75%±5%。采用軟件Stylet對(duì)西花薊馬取食行為進(jìn)行記錄。

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Microsoft Excel 2016對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。通過(guò)SPSS 20.0軟件進(jìn)行方差和Duncan氏多重比較差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 西花薊馬對(duì)根施球孢白僵菌黃瓜上為害的情況

在處理后不同時(shí)間點(diǎn)檢查各處理黃瓜葉片上西花薊馬的數(shù)量，結(jié)果表明，各時(shí)間點(diǎn)兩個(gè)濃度球孢白僵菌處理與對(duì)照組黃瓜上的西花薊馬數(shù)量差異不顯著(圖1)，但是該蟲(chóng)在球孢白僵菌處理的黃瓜葉上的危害面積明顯低于對(duì)照組，但兩個(gè)分生孢子濃度處理后的黃瓜葉片上西花薊馬的危害面積無(wú)明顯差異(圖2和圖3)。

圖1 西花薊馬在黃瓜葉片上的蟲(chóng)口數(shù)量Fig.1 Insect population of Frankliniella occidentalis on cucumber leaves注：柱狀圖中小寫(xiě)字母表示組間差異顯著性(P<0.05)，相同小寫(xiě)字母表示組間差異不顯著，不同小寫(xiě)字母表示組間差異顯著，各值為均值。下圖同。Note: In the histogram, different small letters indicated significant differences between groups (P<0.05), same small letters indicated no significant differences between groups and each value was the mean value.The same below.

2.2 黃瓜葉片MDA和可溶性蛋白的變化

球孢白僵菌分生孢子處理7 d和14 d后，黃瓜葉片的MDA含量顯著低于對(duì)照組，并且差異顯著，而可溶性蛋白含量顯著高于對(duì)照組(圖4)；球孢白僵菌分生孢子處理的黃瓜葉片內(nèi)MDA和可溶性蛋白的含量隨分生孢子濃度增加無(wú)顯著變化(圖5)。

2.3 黃瓜葉片SOD、POD和CAT的變化

經(jīng)球孢白僵菌處理黃瓜7 d和14 d，葉片中SOD、POD和CAT的活性高于對(duì)照組(圖6)；但是不同濃度的球孢白僵菌分生孢子處理黃瓜后，在相同處理時(shí)間上SOD和POD活性無(wú)明顯差異，而CAT的活性隨著球孢白僵菌分生孢子濃度的增加而提高。1×109spores/mL球孢白僵菌分生孢子處理黃瓜14 d后SOD和POD最高值為212.5661 U/g和4 400 U/g，分別是對(duì)照組水的1.33倍和1.09倍。1×108spores/mL和1×109spores/mL球孢白僵菌分生孢子處理黃瓜14 d后CAT活性達(dá)到最高值為0.4886 U/g和0.5275 U/g，分別是對(duì)照組水的1.25倍和1.34倍的。

圖2 西花薊馬對(duì)黃瓜葉片的危害Fig.2 Damage of cucumber leaf with Frankliniella occidentalis注：a，對(duì)照；b，吐溫80；c，1×108 孢子/mL；d，1×109 孢子/mL。Note: a, control; b,tween-80; c, 1×108 spores/mL; d, 1×109 spores/mL.

圖3 西花薊馬對(duì)黃瓜葉片危害面積Fig.3 Damage area of Frankliniella occidentalis to cucumber leaves

圖4 球孢白僵菌處理后黃瓜中MDA含量變化Fig.4 Changes of MDA content in cucumber treated with Beauveria bassiana

圖5 球孢白僵菌處理黃瓜后后對(duì)可溶性蛋白的變化Fig.5 Changes of soluble protein in cucumber treated with Beauveria bassiana

2.4 黃瓜葉片中類(lèi)黃酮和單寧含量

經(jīng)球孢白僵菌處理黃瓜7 d和15 d后，葉片類(lèi)黃酮的含量明顯高于對(duì)照組，而單寧含量與對(duì)照組無(wú)明顯差異(圖7和圖8)。分生孢子濃度從1×108spores/mL提高到1×109spores/mL時(shí)，黃瓜葉片中類(lèi)黃酮的含量也隨之增加，在7 d含量分別為57.42 mg/g和43.56 mg/g，13 d達(dá)到最大值(74.76 mg/g和70.88 mg/g)，之后含量下降(圖7)。

2.5 西花薊馬EPG取食行為分析

經(jīng)球孢白僵菌處理黃瓜7 d后，西花薊馬第一刺探的持續(xù)時(shí)間、長(zhǎng)取食次數(shù)、R波總持續(xù)時(shí)間以及平均取食時(shí)間分別為0.23 s、10.5 s、7 666.51 s和86.72 s，明顯低于兩個(gè)對(duì)照組，但是從EPG開(kāi)始到第一次刺探的時(shí)間為228.67 s，明顯高于兩個(gè)對(duì)照組。

圖6.1 球孢白僵菌處理黃瓜后SOD的變化Fig.6.1 Changes of SOD in cucumber after Beauveria bassiana treatment

圖6.2 球孢白僵菌處理黃瓜后POD的變化Fig.6.2 Changes of POD in cucumber after Beauveria bassiana treatment

圖6.3 球孢白僵菌處理黃瓜后CAT的變化Fig.6.3 Changes of CAT in cucumber after Beauveria bassiana treatment

圖7 黃瓜經(jīng)不同濃度球孢白僵菌處理后類(lèi)黃酮含量變化Fig.7 Changes of flavonoids content in cucumber treated with Beauveria bassiana

圖8黃瓜經(jīng)不同濃度球孢白僵菌處理后單寧含量變化Fig.8 Change of tannin content in cucumber treated with Beauveria bassiana

表1 球孢白僵菌處理黃瓜后西花薊馬在葉片上取食行為(Mean±SE)

3 結(jié)論與討論

西花薊馬取食經(jīng)球孢白僵菌處理的黃瓜葉片，西花薊馬的數(shù)量和繁殖能力并無(wú)明顯差異，但西花薊馬對(duì)黃瓜葉片的危害面積是降低的。本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)球孢白僵菌處理的黃瓜葉片中可溶性蛋白、SOD、CAT、POD及類(lèi)黃酮的含量上升，而MDA的含量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，單寧含量則無(wú)明顯變化。

植物體內(nèi)氧化酶濃度的提升，次生代謝物的產(chǎn)生，或通過(guò)誘導(dǎo)植物的間接系統(tǒng)防御反應(yīng)從而對(duì)昆蟲(chóng)的取食產(chǎn)生抗性(秦秋菊和高希武, 2005)。棉花接種球孢白僵菌和內(nèi)生淡紫擬青霉菌后對(duì)其生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，同時(shí)對(duì)棉鈴蟲(chóng)的存活和發(fā)育有毒害作用(Lopezetal., 2015)。番茄幼苗接種球孢白僵菌后，番茄幼苗根部的PAL、POD、PPO、SOD活性均高于對(duì)照，可溶性蛋白的含量也顯著增加，對(duì)番茄根結(jié)線蟲(chóng)病害具有較好的防治效果(陳增齊等, 2009)。本研究也發(fā)現(xiàn)黃瓜經(jīng)球孢白僵菌菌株處理后，葉片SOD、POD、CAT的活性和可溶性蛋白含量高于對(duì)照組。同時(shí)研究中還發(fā)現(xiàn)施用球孢白僵菌的黃瓜葉片中的MDA含量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。MDA用來(lái)衡量膜脂過(guò)氧化程度的強(qiáng)弱，MDA含量多，則細(xì)胞膜流動(dòng)性下降，膜功能受到損傷(Ariasetal., 2005)，因此MDA含量降低的同時(shí)，細(xì)胞膜的耐氧化程度提高。植物體內(nèi)類(lèi)黃酮的含量與植物的抗蟲(chóng)性呈正相關(guān)關(guān)系，其含量越高，美國(guó)白蛾對(duì)植株的取食量越低(李路莎等, 2018)。本研究也發(fā)現(xiàn)黃瓜經(jīng)球孢白僵菌菌株處理后，葉片類(lèi)黃酮活性高于對(duì)照組。綜合分析本試驗(yàn)和已有研究結(jié)果，推斷球孢白僵菌處理黃瓜體內(nèi)相關(guān)物質(zhì)的變化是西花薊馬對(duì)其葉片的危害面積低于對(duì)照組的原因。

采用EPG技術(shù)對(duì)西花薊馬在不同處理的黃瓜上的刺探行為進(jìn)行分析，西花薊馬在取食期間產(chǎn)生了6種不同的波形，分別是非刺探波(np波)、上顎口針刺入波(P波)、上顎口針重復(fù)刺吸波(S波)、下顎口針刺入(Q波)、細(xì)胞內(nèi)取食波(R波)、不規(guī)則波形(X波)(Kindtetal., 2003)。并且西花薊馬在取食中的細(xì)胞內(nèi)取食波(R波)與蚜蟲(chóng)取食中的韌皮部取食波(E2波)具有相似的生物學(xué)功能。麥長(zhǎng)管蚜Sitobionavenae在吡蟲(chóng)啉、噻蟲(chóng)嗪、呋蟲(chóng)胺和吡蚜酮等藥劑處理下的E2波的總持續(xù)時(shí)間明顯低于對(duì)照組(彭建紅, 2018)；禾縊管蚜Rhopalosiphumpadi和苜蓿斑蚜Theriaphistrifolii在抗性品種上E2波的總持續(xù)時(shí)間明顯低于抗性小的品種(Beantetal., 2020; 周雪飛等, 2020)；說(shuō)明E2波的總持續(xù)時(shí)間與寄主對(duì)昆蟲(chóng)取食抵抗能力相關(guān)。西花薊馬需對(duì)寄主進(jìn)行表面物質(zhì)識(shí)別，進(jìn)而完成取食的下一步的“刺探”。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)西花薊馬在接種球孢白僵菌的黃瓜上從EPG開(kāi)始到第一次刺探時(shí)間為228.67 s，而在清水處理黃瓜上的時(shí)間為4.9 s，表明西花薊馬對(duì)接種球孢白僵菌的黃瓜選擇性?xún)A向低于對(duì)照組。而西花薊馬在接種球孢白僵菌的黃瓜上第一次刺探的持續(xù)時(shí)間、R波的總持續(xù)時(shí)間、長(zhǎng)取食次數(shù)以及平均取食時(shí)間均低于對(duì)照組，表明了西花薊馬對(duì)接種球孢白僵菌的黃瓜取食量低，反映出西花薊馬在對(duì)寄主植物分析完成后會(huì)對(duì)取食策略進(jìn)行了調(diào)整。

綜上所述，黃瓜植株接種球孢白僵菌后，黃瓜體內(nèi)相關(guān)物質(zhì)的變化，造成西花薊馬取食行為的改變，并且其對(duì)黃瓜葉片危害下降，使其具有一定的抗蟲(chóng)性，為提高植物的抗蟲(chóng)性提供了理論依據(jù)。