張亞妮，吳兆圓，萬中義，張志剛，石麗橋，方 偉，柯少勇，王開梅

湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心，武漢 430064

微生物為藥物和農(nóng)藥的開發(fā)提供了大量的先導(dǎo)化合物資源。鏈霉菌屬是放線菌的一個主要類群，鏈霉菌次級代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)多樣，生物活性顯著，被認(rèn)為是許多抗生素的來源和潛在的藥物來源[1]。近年來，從鏈霉菌中發(fā)現(xiàn)了一些具有良好生物活性的代謝產(chǎn)物，例如，阿德加霉素P(aldgamycin P)是分離自土壤鏈霉菌Streptomycessp.KIB-K1的新大環(huán)內(nèi)脂類化合物，對金黃色葡萄球菌具有顯著的抑制作用，MIC值為7.81 μg/mL[2]?；衔飁ndostemonines A～J是首次報道的從一株內(nèi)生鏈霉菌屬的菌株BS-1 中分離鑒定出的新天然吡咯-2-羧酸酯衍生物，對棉蚜具有很強的致死活性，72 h LC50值為3.55～32.00 mg/L[3]。

在我們從放線菌中尋找活性代謝產(chǎn)物的過程中，發(fā)現(xiàn)一株土壤鏈霉菌StreptomycesardusWS-65090發(fā)酵提取物具有較好的殺蟲活性，為了明確其活性代謝產(chǎn)物，對其進(jìn)行了分離純化，獲得了一些teleocidin類化合物。Teleocidin最早是在1960年作為有毒物質(zhì)由地中海鏈霉菌菌絲體的甲醇提取物中分離出來[4-6]，其擁有獨特的吲哚內(nèi)酰胺骨架，有A-1、A-2、B-1、B-2、B-3和B-4 6種立體構(gòu)型[7,8]，因獨特的結(jié)構(gòu)和多樣的生物活性而備受關(guān)注[9-11]。目前，已從微生物中分離出多種teleocidin結(jié)構(gòu)相關(guān)的化合物，如lyngbyatoxins A～C[12,13]、olivoretins A～C[14,15]、14-O-(N-acetylglucosaminyl)teleocidin A[16]和2-oxo-teleocidin A1[17]。這些化合物表現(xiàn)出重要的生物活性，如皮膚刺激物、腫瘤促進(jìn)劑和PKC激活劑以及細(xì)胞毒活性[12-17]。本研究報道的新teleocidin B類構(gòu)型的類似物及其殺蟲與細(xì)胞毒活性，豐富了此類化合物的結(jié)構(gòu)類型及活性，也豐富了鏈霉菌活性代謝產(chǎn)物類型，為其在農(nóng)用方面的研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器

MPC 500旋光計(Waltham，USA)；島津UV-2600 PC紫外分光度計(Shimadzu，Japan)；NICOLET IS50 FT-IR紅外光譜儀(Thermo Fisher Scientific，USA)；Bruker AVANCE 700核磁共振儀(TMS為內(nèi)標(biāo)，德國BrukerBioSpin公司)；Jasco J-810圓二色光譜儀(日本分光公司)，Waters Xevo TQD UPLC-MS超高效液質(zhì)聯(lián)用(Waters Corporation,USA)；Bruker maXis Q-TOF高分辨質(zhì)譜(Bruker，Germany)；Waters高效液相制備色譜儀器(Waters2525泵，帶2767自動收集系統(tǒng)，2996二極管陣列檢測器，色譜工作站Masslynx V4.0，Waters，USA)；色譜柱：Sunfire C18OBD 制備柱(19 mm×250 mm /10 mm×250 mm，5 μm，Waters，USA)。

1.2 菌株來源

菌株分離于湖北隨縣山坡土壤(2015年4月采樣)，編號為WS-65090，在ISP-2培養(yǎng)基上菌落生長旺盛，28 ℃下培養(yǎng)14天，菌落直徑7～8 mm，顏色為白色，菌落背面呈淡黃色(見圖1)。氣生菌絲長而直，表面光滑，孢子稀少(見圖2)。將WS-65090菌株的16S rRNA序列以AB184864的登錄號篩選到Gen-Bank，與ardus-NBRC 13430菌株的相似性為99.57%。通過形態(tài)鑒定和16S rRNA基因序列分析結(jié)果，將菌株WS-65090鑒定為鏈霉菌屬StreptomycesardusWS-65090(艱難鏈霉菌)。菌種現(xiàn)保存于中國典型物保藏中心(武漢，CCTCC)，登記號為CCTCCM2020096。

圖1 WS-65090菌株的平板菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphological characteristics of strain WS-65090

圖2 WS-65090菌株電鏡掃描圖片(Bar 2.0 μm)Fig.2 Scanning electron micrograph of strain WS-65090 (Bar 2.0 μm)

1.3 供試?yán)ハx

草地貪夜蛾(Spodopterafrugiperda)初孵幼蟲、棉鈴蟲(Helicoverpaarmigera)初孵幼蟲、小菜蛾(PlutellaxylostellaL.)二齡幼蟲、豆蚜(Aphiscraccivora)均由湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心提供。

1.4 細(xì)胞株

人肝癌細(xì)胞株HepG2、人惡性黑色素瘤細(xì)胞株A875、非洲綠猴腎細(xì)胞株Marc-145均由湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心實驗室常規(guī)保存培養(yǎng)。

1.5 培養(yǎng)基

發(fā)酵培養(yǎng)基：ISP-2液體培養(yǎng)基：葡萄糖4.0 g/L，麥芽提取物10.0 g/L，酵母提取物 4.0 g/L，pH值調(diào)至7.2。

1.6 菌株發(fā)酵

將S.ardusWS-65090菌株的斜面菌種接種到含有100 mL種子培養(yǎng)基ISP-2的500 mL錐形瓶中。在28 ℃下，以150 rpm進(jìn)行振搖培養(yǎng)。發(fā)酵96 h后，在無菌條件下，將10%的種子培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到含有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶中，在28 ℃下，搖床上以150 rpm發(fā)酵培養(yǎng)120 h。

1.7 提取與分離

將鏈霉菌WS-65090菌株的10L發(fā)酵液凍干，用乙酸乙酯萃取凍干粉2次，合并乙酸乙酯萃取液，過濾并在真空下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到粗提取物。將粗提物溶解于甲醇、離心，采用反相制備液相色譜進(jìn)行分離純化，色譜柱為Waters Sunfire prep C18OBD柱(19 mm×250 mm，5 μm)；乙腈(B)和水(A)為流動相，以24 mL/min的流速梯度洗脫(0～2 min，5%B；2～27 min，5%→100% B；27～32 min，100%B；32～37 min，100%→5%B；37～40 min，5%B)，采用PDA 全波長掃描，收集得到13個組分(Fr1～Fr13)。其中，組分Fr4～13對草地貪夜蛾、棉鈴蟲、小菜蛾和蚜蟲具有較強的毒殺活性，采用反相制備液相色譜分別對組分Fr4～13進(jìn)行進(jìn)一步分離純化，色譜柱為Waters Sunfire prep C18OBD柱(19 mm×250 mm，5 μm)；乙腈(B)和水(A)為流動相，以24 mL/min的流速梯度洗脫(0～2 min，20%B；2～22 min，20%→100%B；22～26 min，100%B；26～30 min，100%→20%B；30～33 min，20%B)。采用PDA全波長掃描，由Fr11分離到了化合物1(19.08 mg)，由Fr12獲得了化合物2(10.96 mg)，由Fr7獲得了化合物3(28.70 mg)，由Fr8獲得化合物4(16.93 mg)，從Fr5獲得化合物5(10.33 mg)。

1.8 殺蟲活性測定

采用24孔微量盤人工飼料表面涂布法測定了化合物1～5對草地貪夜蛾、棉鈴蟲和小菜蛾幼蟲的殺蟲活性。首先將每種化合物溶解在甲醇中，并用含0.1%吐溫-80的水稀釋至0.25、0.125、0.63、0.031、0.016 mg/mL。將40 μL樣品溶液轉(zhuǎn)移到24孔微量盤人工飼料表面。然后，將10只幼蟲放入孔中，在25 ℃下培養(yǎng)。每一種濃度使用30只幼蟲(每孔10只幼蟲)。72 h后，與85%阿維菌素陽性對照組和陰性空白對照組比較，目測死亡率，計算致死濃度50%值(LC50)。

化合物1～5對蚜蟲的殺蟲活性采用浸漬法[18]。每一種化合物用0.1%吐溫-80乙醇溶液制備成5種濃度梯度(0.8、0.4、0.2、0.1、0.05 mg/mL)。在實驗室條件下，將帶蚜蟲大豆幼苗浸入不同濃度的供試樣品溶液5 s，吸取多余的溶液，然后置于室溫培養(yǎng)。每種處理重復(fù)3次，72 h后，與陰性對照組和85%阿維菌素陽性對照組比較，觀察死亡率。然后計算致死濃度50%值(LC50)。

1.9 體外細(xì)胞毒活性測定

化合物1～5對HepG2、A875和Marc-145 3種細(xì)胞系的體外細(xì)胞毒活性采用MTT法[19]。實驗重復(fù)3次，用統(tǒng)計軟件SPSS16.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析并計算樣品的半數(shù)抑制濃度(IC50)。

2 結(jié)果與分析

2.1 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

表1 化合物1和2的1H NMR(700 MHz)和13C NMR(175 MHz)數(shù)據(jù)(CDCl3)

圖3 化合物1～5的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.3 Structures of compounds 1-5

圖4 化合物1和2的HMBC和1H-1H COSY相關(guān)信號Fig.4 1H-1H COSY and HMBC correlations of compounds 1 and 2

雖然化合物1和2具有相同的平面結(jié)構(gòu)，且CD譜表明兩者在220～340 nm呈現(xiàn)相似的科頓效應(yīng)(見圖5)，但它們的一些核磁共振數(shù)據(jù)卻有很大不同，表明它們是立體異構(gòu)體?；衔?和2在二維NOESY譜中并未表現(xiàn)出明顯的相關(guān)，根據(jù)1和3，2和4的1H和13C NMR中化學(xué)位移的相似性，推測1的立體中心的相對構(gòu)型與3相同，2與4相同。由于未能成功獲得化合物1和2的晶體，通過化學(xué)方法堿水解實驗進(jìn)一步確定1和2的絕對構(gòu)型。分別用相同質(zhì)量的0.1 N氫氧化鈉溶液水解化合物1和2[21]，應(yīng)用UPLC-MS將它們的水解產(chǎn)物分別與共同分離的化合物teleocidin B-2(3)、B-3(4)進(jìn)行比較分析，通過比較其紫外吸收光譜、分子離子、色譜數(shù)據(jù)及CD譜(補充數(shù)據(jù))，確認(rèn)化合物1和2的水解產(chǎn)物分別為化合物teleocidin B-2、B-3，而teleocidin B-2、B-3的立體構(gòu)型早在20世紀(jì)80年代通過X-Ray確定[8]。因此，1與teleocidin B-2(3)具有相同的立體結(jié)構(gòu)，為9S，12S，19R，22S；2與teleocidin B-3(4)具有相同的立體結(jié)構(gòu)，為9S，12S，19S，22S。

圖5 化合物1～4的CD譜Fig.5 CD spectrum of compounds 1-4

化合物3白色無定形固體；ESI-MS：m/z452.73 [M+H]+,450.77 [M-H]-；1H NMR(700 MHz，CDCl3)δ：8.20(1H，br s，H-1)，6.81(1H，br s，H-2)，6.55(1H，s，H-5)，6.12(1H，dd，J= 17.5，10.4 Hz，H-28)，5.18(1H，dd，J= 10.5，1.4 Hz，H-29)，5.10(1H，dd，J= 17.4，1.3 Hz，H-29)，4.35(1H，d，J= 10.2 Hz，H-12)，4.34(1H，m，H-9)，3.74(1H，dd，J= 11.4，3.8 Hz，H-8)，3.54(1H，dd，J= 11.4，8.5 Hz，H-14)，3.16(1H，d，J= 17.3 Hz，H-8)，3.00(1H，dd，J= 17.3，3.9 Hz，H-8)，2.93(3H，s，H-18)，2.62(1H，m，H-15)，2.11(1H，m，H-24)，1.90～1.82(2H，m，H-20)，1.88～1.62(2H，m，H-21)，1.48(3H，s，H-27)，1.32(3H，s，H-23)，0.98(3H，d，J=6.8 Hz,H-25)，0.93(3H，d,J=6.3 Hz，H-17)，0.70(3H，d，J=6.7 Hz,H-16)，0.60(3H，d，J=6.9 Hz,H-26)；13C NMR(175 MHz，CDCl3)δ：174.4(C-11)，148.5(C-28)，145.9(C-4)，140.0(C-7a)，137.8(C-6)，120.8(C-2)，117.6(C-7)，117.2(C-3a)，113.9(C-3)，113.1(C-29)，107.0(C-5)，71.1(C-12)，65.3(C-14)，56.1(C-9)，40.4(C-19)，39.8(C-22)，38.4(C-24)，35.8(C-21)，34.0(C-8)，33.3(C-18)，28.6(C-15)，28.1(C-23)，26.9(C-20)，25.6(C-27)，21.9(C-17)，19.8(C-16)，18.9(C-26)，17.8(C-25)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8,22]基本一致，故化合物3鑒定為teleocidin B-2。

化合物4白色無定形固體；ESI-MS：m/z452.73 [M+H]+，450.86 [M-H]-。1H NMR(700 MHz，CDCl3)δ：8.46(1H，br s，H-1)，6.76(1H，br s，H-2)，6.47(1H，s，H-5)，6.22(1H，dd，J= 17.7，10.6 Hz，H-28)，5.38(1H，dd，J= 17.7，1.2 Hz，H-29)，5.25(1H，dd，J= 10.6，1.2 Hz，H-29)，4.35(1H，m，H-9)，4.29(1H，d，J= 10.2 Hz，H-12)，3.76(1H，dd，J= 11.4，3.7 Hz，H-14)，3.57(1H，dd，J= 11.4，8.5 Hz，H-14)，3.13(1H，d，J= 17.1 Hz，H-8)，2.98(1H，dd，J= 17.4，3.7 Hz，H-8)，2.90(3H，s，H-18)，2.60(1H，m，H-15)，2.27(1H，m，H-24)，1.94～1.42(2H，m，H-20)，1.94～1.42(2H，m，H-21)，1.47(3H，s，H-27)，1.31(3H，s，H-23)，1.02(3H，d,J=6.8 Hz，H-25)，0.92(3H，d，J=6.3 Hz,H-17)，0.65(3H，d，J=6.8 Hz,H-16)，0.63(3H，d,J=6.8 Hz，H-26)；13C NMR(175 MHz，CDCl3)δ：174.6(C-11)，151.9(C-28)，146.0(C-4)，138.6(C-7a)，137.5(C-6)，120.3(C-2)，118.3(C-7)，116.8(C-3a)，113.7(C-3)，111.4(C-29)，106.7(C-5)，71.0(C-12)，65.5(C-14)，56.0(C-9)，39.8(C-19)，39.6(C-22)，37.2(C-24)，34.9(C-21)，33.9(C-8)，33.4(C-18)，30.1(C-23)，28.7(C-15)，25.1(C-20)，21.9(C-17)，21.8(C-27)，19.5(C-16)，18.6(C-26)，17.2(C-25)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8,22]基本一致，故化合物4鑒定為teleocidin B-3。

化合物5白色無定形固體；ESI-MS：m/z438.73 [M+H]+，436.68 [M-H]-。1H NMR(700 MHz，CDCl3)δ：8.53(br s，1H，H-1)，6.97(d，J= 8.1 Hz，1H，H-6)，6.82(br s，1H，H-2)，6.48(d，J= 8.1 Hz，1H，H-5)，6.20(dd，J=17.7，10.6 Hz，1H，H-21)，5.30(d，J= 19.0 Hz，1H，H-22)，5.26(d，J= 10.7 Hz，1H，H-22)，5.09～5.06(m，1H，H-25)，4.34(d，J= 10.0 Hz，1H，H-12)，4.33(br s，1H，H-9)，3.74(dd，J= 11.3，4.1 Hz，1H，H-14)，3.55(dd，J= 11.3，8.5 Hz，1H，H-14)，3.15(br d，J= 17.2 Hz，1H，H-8)，3.02(dd，J= 17.3，3.6 Hz，1H，H-8)，2.91(s，3H，H-18)，2.59(m，1H，H-15)，1.99～1.81(m，2H，H-23)，1.96～1.89(m，2H，H-24)，1.63(s，3H，H-28)，1.45(s，3H，H-20)，1.39(s，3H，H-27)，0.91(d，J= 6.3 Hz，3H，H-16)，0.60(d，J= 6.7 Hz，3H，H-17)；13C NMR(175 MHz，CDCl3)δ：174.3(C-11)，149.2(C-21)，146.7(C-4)，137.7(C-7a)，131.7(C-26)，124.8(C-25)，121.3(C-2)，120.6(C-6)，120.3(C-3)，118.7(C-7)，114.1(C-3a)，112.4(C-22)，106.2(C-5)，71.3(C-12)，65.4(C-14)，55.8(C-9)，43.6(C-19)，38.2(C-23)，34.3(C-8)，33.2(C-18)，28.8(C-15)，25.9(C-27)，25.0(C-20)，23.4(C-24)，21.8(C-16)，19.6(C-17)，17.6(C-28)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[7,23,24]基本一致，故化合物5鑒定為teleocidin A-2。

2.2 化合物活性測試結(jié)果

2.2.1 殺蟲活性測試結(jié)果

化合物1～5對草地貪夜蛾、棉鈴蟲和小菜蛾幼蟲的活性測定，采用24孔盤人工飼料表面涂布法，對蚜蟲的測定采用浸漬法。72 h殺蟲活性結(jié)果如表2所示，化合物1對草地貪夜蛾、棉鈴蟲、小菜蛾這3種供試?yán)ハx的活性是這5個化合物中表現(xiàn)最強的，其LC50值分別為42.6、36.5、66.4 μg/mL；其次為化合物2，LC50值分別為44.8、44.2、68.1 μg/mL；化合物3～5對這3種供試?yán)ハx的LC50值為76.6～168.3 μg/mL。這5個化合物對蚜蟲表現(xiàn)出中等的殺蟲活性，其LC50值為144.5～206.8 μg/mL。而陽性對照阿維菌素對這4種供試?yán)ハx的活性均高于化合物1～5，其LC50值分別為2.2、1.9、3.1、1.7 μg/mL。

表2 化合物1～5對4種供試?yán)ハx的殺蟲活性

2.2.2 體外細(xì)胞毒活性

化合物1～5的細(xì)胞毒活性測試采用MTT法。結(jié)果表明，與陽性對照5-氟尿嘧啶相比，這些化合物的細(xì)胞毒活性較強，對A875、HepG2和Marc-145細(xì)胞系的IC50值為3.08 ± 1.04～18.40 ± 2.06 μM(表3)。具體而言，1對這3種細(xì)胞系表現(xiàn)出細(xì)胞毒活性的IC50值分別為15.53 ± 2.53、4.64 ± 0.95、13.52 ± 2.88 μM；2對這3種細(xì)胞系的IC50值為11.72 ± 1.42、5.29 ± 1.95、13.86 ± 3.16 μM，與化合物3～5相比，顯示出近似的細(xì)胞毒活性。

表3 化合物1～5對A875、HepG2和Marc-145細(xì)胞系的體外細(xì)胞毒活性

3 結(jié)論

從鏈霉菌StreptomycesardusWS-65090發(fā)酵提取物中分離得到5個teleocidin類化合物，這些化合物均具有殺蟲和細(xì)胞毒活性。其中14-O-acetylteleocidin B-2(1)是一種新的化合物，14-O-acetylteleocidin B-3(2)是一種新的天然產(chǎn)物，首次對其核磁共振波譜數(shù)據(jù)進(jìn)行了詳細(xì)闡述。這也是近年來首次從土壤來源的鏈霉菌菌株中分離出的teleocidin B類型結(jié)構(gòu)的化合物，其對草地貪夜蛾、棉鈴蟲、小菜蛾和蚜蟲具有殺蟲活性。另外，這兩種新的teleocidin類似物在C-14處含有乙酰基，其殺蟲活性強于已知的三種化合物。結(jié)合細(xì)胞毒活性的實驗結(jié)果，說明了teleocidin類似物的C-14位的乙?；鶊F(tuán)對其生物活性有重要影響。Teleocidin類化合物生物活性多集中在醫(yī)用活性方面，本研究報道的化合物豐富了teleocidin類化合物的種類，擴(kuò)展了生物活性，為其在農(nóng)用方面的研究提供了探討。