康永鋒，段 松，張紅軍，甘建紅,*

1上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)征醫(yī)院藥學(xué)部，上海 200433；3上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心；4食品科學(xué)與工程國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，上海 201306

海綿屬多孔動(dòng)物門(mén)(Porifera)，是最原始的低等多細(xì)胞動(dòng)物，海綿多變的生境和原始的進(jìn)化地位，使其產(chǎn)生并積累了大量結(jié)構(gòu)新穎且具有抗腫瘤、抗寄生蟲(chóng)、抗病毒、抗菌、抗炎和免疫調(diào)節(jié)等不同生物活性的次生代謝產(chǎn)物，是海洋天然產(chǎn)物的首要來(lái)源[2,3]。我國(guó)南海海域遼闊，是世界上海綿集中分布的海域之一，多年來(lái)南海海綿一直是被研究的海洋天然產(chǎn)物化學(xué)研究熱點(diǎn)生物之一[4]。早在1933年，美國(guó)耶魯大學(xué)的Bergmann教授開(kāi)始對(duì)海綿的化學(xué)成分進(jìn)行研究，從中得到了甾體類(lèi)成分。1951年，他從海綿Phyllospongiasp.中分離獲得了spongothymidine和spongouridine 等核苷類(lèi)化合物；后來(lái)的抗病毒藥阿糖腺苷和抗癌藥阿糖胞苷就是spongothymidine的合成類(lèi)似物[5,6]。從海綿研究中獲得的laulimalide、peloruside A、salicylihalimide A、variolins、dictyodendrins已作為抗腫瘤藥進(jìn)入臨床前研究[7]。

本文的研究對(duì)象杯葉海綿Phyllospongiasp.屬尋常海綿綱(Demospongiae)，網(wǎng)角海綿目(Dictyoceratida)，角骨海綿科(Spongiidae)海綿[8]。目前，國(guó)內(nèi)外有很多課題組對(duì)該種海綿進(jìn)行了系列研究報(bào)道，從中分離得到許多結(jié)構(gòu)新穎的次生代謝產(chǎn)物，包括二倍半萜類(lèi)、甾體類(lèi)、二苯基醚類(lèi)、甘油糖脂類(lèi)和神經(jīng)酰胺類(lèi)等化合物[9]。其中含有獨(dú)特的四環(huán)或五環(huán)scalarane型的二倍半萜類(lèi)和甾體類(lèi)化合物占大多數(shù)。但其生物活性研究報(bào)道較少，為了更好地闡明Phyllospongiasp.中具有生物活性的成分，本實(shí)驗(yàn)綜合運(yùn)用各種現(xiàn)代色譜和光譜技術(shù)，對(duì)提取物的石油醚和乙酸乙酯部位分離的化合物進(jìn)行研究，并進(jìn)行細(xì)胞毒活性的篩選，豐富了Phyllospongiasp.的成分，為后續(xù)該海綿的活性成分的開(kāi)發(fā)與利用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

Q-Tof micro YA019型液質(zhì)聯(lián)用儀、Bruker AV-600型核磁共振儀、Waters 1525/2996高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司)；EYELAN-2000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；Sephadex LH-20凝膠柱(美國(guó)Pharmacia公司)；層析硅膠(200～300目)、TLC高效薄層層析板(煙臺(tái)江友硅膠開(kāi)發(fā)有限公司)；甲醇、乙腈、正已烷(色譜純，美國(guó)Promptar公司)；二氯甲烷、甲烷、石油醚、乙酸乙酯、丙酮(分析純，上?；瘜W(xué)試劑公司)；氘代試劑(上海思域化工科技有限公司)；顯色劑用10%硫酸香蘭素溶液。

MCF-7(人乳腺癌細(xì)胞株)、HT-29(人結(jié)腸癌細(xì)胞細(xì)胞株)、Hep-2(人喉癌上皮細(xì)胞株)(上海交通大學(xué)細(xì)胞中心)；HF 90 CO2培養(yǎng)箱(上海力升科學(xué)儀器)；Nikon Eclipse倒置顯微鏡，LDZM位式壓力蒸汽滅菌鍋(上海申安醫(yī)療器械廠)；Spark多功能酶標(biāo)儀試劑(瑞士Tecan公司)；離心機(jī)(上海貝克曼庫(kù)爾特儀器設(shè)備)；胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基(美國(guó)Hyclone 公司)；青鏈霉素混合液、PBS、MTT、胰酶(上海鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司)。

杯葉海綿Phyllospongiasp.(XS-2019.12)樣品于2019年12月采自中國(guó)南海西沙永興島附近，種屬名稱(chēng)經(jīng)上海交通大學(xué)林厚文教授和本文作者之一張紅軍教授鑒定為Phyllospongia屬海綿(Phyllospongiafoliascens)。標(biāo)本(XS-2019.12)存放于上海海洋大學(xué)食品學(xué)院。

1.1 提取與分離

將冷凍的杯葉海綿(Phyllospongiasp.，干重2.0 kg)切碎后，用丙酮超聲1 h提取共3次；每次用二氯甲烷∶甲醇(1∶1)混合溶劑超聲1.5 h提取，共3次。合并提取液，減壓濃縮得到總浸膏32.0 g，將其混懸分散于90 %的甲醇溶液中，用石油醚萃取3次，濃縮萃取液得到石油醚部位浸膏(12.5 g)；再加水將混懸液的甲醇濃度調(diào)整至65 %，用二氯甲烷萃取3次，濃縮萃取液得到二氯甲烷部位浸膏(6.3 g)。將石油醚部位浸膏進(jìn)行減壓硅膠柱色譜，二氯甲烷-甲醇(100∶1→5∶1)梯度洗脫，根據(jù) TLC顯色合并相似流分得到 7個(gè)組分Fr.a ～ Fr.g。對(duì)組分Fr.e進(jìn)行正相硅膠柱色譜，石油醚-乙酸乙酯(100∶1→5∶1)梯度洗脫，根據(jù)TLC顯色合并相似流分得到5個(gè)組分(Fr.e1 ～ Fr.e5)。其中Fr.e-3(13.7 mg)以95%甲醇-水(含0.1%甲酸，2 mL/min，UV 254 nm )經(jīng)高效液相色譜洗脫，得到化合物1(1.5 mg，tR= 35 min)、2(2.5 mg，tR= 38 min)和3(1.9 mg，tR= 47 min)。Fr.e-4(18.5 mg)以90%甲醇-水(含0.1%甲酸，2 mL/min，UV 254 nm )經(jīng)高效液相色譜洗脫，得到化合物4(2.4 mg，tR= 32 min)和5(2.7 mg，tR= 39 min)。將二氯甲烷部位浸膏按照上述同樣的方法，經(jīng)HPLC檢測(cè)合并得到5個(gè)組分(Fr.1 ～ Fr.5)，其中Fr.3(20.4 mg)以75%甲醇-水(2 mL/min，UV 254 nm)經(jīng)制備液相色譜洗脫，得到化合物6(2.3 mg，tR= 19 min)、7(1.3 mg，tR= 26 min)和8(2.5 mg，tR= 34 min)。

1.2 細(xì)胞毒活性篩選

將MCF-7、HT-29和Hep-2細(xì)胞株用含10%新生胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)至細(xì)胞覆蓋率達(dá)85%以上時(shí)傳代，生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)研究[10]。用MTT法檢測(cè)化合物對(duì)MCF-7、HT-29和Hep-2細(xì)胞的抑制作用，將三種細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)后接種于96孔板內(nèi)(體積為100 μL/孔)，設(shè)相應(yīng)濃度的溶媒對(duì)照孔，然后加入不同濃度的受試藥物100 μL/孔，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，空白組加入等量含0.1% DMSO的培養(yǎng)基[11]。以順鉑為陽(yáng)性對(duì)照，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后用MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)情況。取出細(xì)胞培養(yǎng)板，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。每孔加入10 μL MTT，置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄去MTT，然后在DMSO中溶解[12]。用酶標(biāo)儀在測(cè)定550 nm處的OD值，計(jì)算IC50，試驗(yàn)反復(fù)進(jìn)行3次。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

從杯葉海綿Phyllospongiasp.的石油醚和二氯甲烷萃取部位首次分離鑒定了8個(gè)甾體類(lèi)化合物(1～8)(見(jiàn)圖1)。

圖1 化合物1～8的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structures of compounds 1-8

2.2 細(xì)胞毒活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

檢測(cè)化合物對(duì)MCF-7、HCT-116和Hep-2的細(xì)胞毒活性，鏡下觀察可見(jiàn)，化合物3、6和8組細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)規(guī)則，破碎不明顯，其余各化合物不同劑量組細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則出現(xiàn)細(xì)胞破碎等現(xiàn)象，陽(yáng)性對(duì)照順鉑組細(xì)胞出現(xiàn)明顯的細(xì)胞破碎現(xiàn)象。各化合物對(duì)以上三種細(xì)胞的IC50值如表1所示?；衔?對(duì)MCF-7具有顯著的細(xì)胞毒活性，IC50值為3.9 μmol/L，順鉑為陽(yáng)性對(duì)照(IC50= 6.0 μmol/L)；化合物2對(duì)Hep-2有較好的細(xì)胞毒活性，IC50值為10.6 μmol/L，順鉑為陽(yáng)性對(duì)照(IC50= 6.3 μmol/L)。

表1 各化合物對(duì)MCF-7、HT-29和Hep-2的IC50值

3 結(jié)論

本文對(duì)采自我國(guó)南海西沙群島的杯葉海綿Phyllospongiasp.進(jìn)行了化學(xué)成分研究，首次從石油醚和二氯甲烷部位中分離得到8個(gè)甾體類(lèi)化合物，并采用MTT法測(cè)試了其對(duì)MCF-7(人乳腺癌細(xì)胞)、HT-29(人結(jié)腸癌細(xì)胞)和Hep-2(人喉癌上皮細(xì)胞)的細(xì)胞毒活性試驗(yàn)，其中化合物1、3、4、6、8對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29毒活性較弱，IC50均大于83 μmol/L；化合物1、2、7對(duì)MCF-7的細(xì)胞毒活性顯著，IC50分別為8.8、10.3、3.9 μmol/L；化合物2對(duì)Hep-2的細(xì)胞毒活性較好，IC50為10.6 μmol/L。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明化合物7的細(xì)胞毒活性優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照藥順鉑組，由于該化合物的含量較少，且未有文獻(xiàn)報(bào)道顯著活性，故有望通過(guò)結(jié)構(gòu)修飾或有機(jī)合成發(fā)展成為新的抗腫瘤藥物的潛力。這些工作進(jìn)一步對(duì)南海西沙海綿資源和生物活性的考察和研究，尋求高效低毒的新的抗腫瘤化學(xué)結(jié)構(gòu)和先導(dǎo)化合物提供了參考依據(jù)。