王 藝，馮麗萍，黃李璐，胡 攀，嚴(yán) 鑫，王 希，鄭 雨，夏厚林*

1成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，成都 611137；2成都市中草藥研究所，成都 610016；3成都市植物園，成都 610083

木芙蓉花，為錦葵科木槿屬植物木芙蓉HibiscusmutabilisL.的干燥花，《本草綱目》云：“此花艷如荷花，故有芙蓉、木蓮之名……”[1]，又有華木、拒霜、霜降花等多個(gè)稱(chēng)謂。味微辛、性涼，歸肺、肝經(jīng)，有清肺涼血，散熱解毒，消腫排膿之效，臨床上多用于治療肺熱咳嗽、瘰疬、腸癰、白帶等，外用還可用于治療癰癤膿腫、膿耳、無(wú)名腫毒、燒燙傷等，收載于2019版《廣東省中藥材標(biāo)準(zhǔn)第三冊(cè)》[2]。

四川成都自古以來(lái)盛栽芙蓉，芙蓉花從1983年開(kāi)始被定為成都市“市花”，是天府文化的重要組成元素，它不僅是城市地域人文特征的濃縮和象征，更是城市形象的重要標(biāo)志和特色名片。除了人文方面的深厚積淀，木芙蓉也是兼具營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值的藥食同源性中藥，現(xiàn)代藥理研究表明其具有抗過(guò)敏[3]、降低血糖[4]等作用并對(duì)溶血性鏈球菌有較強(qiáng)抑制作用[2]，其提取物也被廣泛應(yīng)用于化妝品[5]和食品的原料或添加品[6]等方面。但由于目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于木芙蓉花化學(xué)成分的報(bào)道相對(duì)較少、相關(guān)藥理研究多以粗提物為研究對(duì)象、藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的發(fā)現(xiàn)與作用機(jī)制的闡述不夠深入等因素，其臨床應(yīng)用相對(duì)較少，范圍局限，僅在治療癰腫[7]和炎癥[8]等方面有相關(guān)報(bào)道，不僅影響木芙蓉花在醫(yī)藥基礎(chǔ)研究與臨床應(yīng)用上的發(fā)現(xiàn)與拓展，也是其在食品、化妝品等應(yīng)用領(lǐng)域發(fā)展的瓶頸，故明確木芙蓉花的物質(zhì)基礎(chǔ)并開(kāi)展相關(guān)的藥效學(xué)研究對(duì)其應(yīng)用和開(kāi)發(fā)有著重要意義。超高效液相色譜串聯(lián)四極桿靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜技術(shù)是近幾年發(fā)展起來(lái)的新型液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，具有分辨率高、質(zhì)量精度好、定性和定量能力強(qiáng)等特點(diǎn)，在中藥分析領(lǐng)域也展現(xiàn)出了極大的應(yīng)用前景。因此為了進(jìn)一步了解木芙蓉花的化學(xué)成分，本實(shí)驗(yàn)采用UPLC-Q-Orbitrap HRMS對(duì)其進(jìn)行化學(xué)分析，以期對(duì)木芙蓉花的物質(zhì)基礎(chǔ)做出闡述。

1 材料

Vanquish 型超高效液相色譜聯(lián)用Q Exactive四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜儀(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；KQ-600DE型超聲波清洗器(頻率40 kHz，功率600 W，昆山市超聲儀器有限公司)，Discovery DV215CD型十萬(wàn)分之一電子天平(美國(guó)Ohaus Corporation公司)；BS124S型萬(wàn)分之一析天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)。

對(duì)照品鹽酸黃連堿(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)112026-201601)；L-苯丙氨酸、蘆丁、金絲桃苷、椴樹(shù)苷(成都克洛瑪生物科技有限公司，批號(hào)分別為CHB180328、CHB190110、CHB171010、CHB180214)；水楊酸、槲皮素、山奈酚(成都埃法生物科技有限公司，批號(hào)分別為AF9070721、AF20032451、AF20050953)；異槲皮苷、原兒茶酸(四川省維克奇生物科技有限公司，批號(hào)分別為wkq20060104、wkq16012105)；甜菜堿(成都得思特生物技術(shù)有限公司，批號(hào)DSTDT001202)；腺苷(英國(guó)PureChemLand公司，批號(hào)PCL-#-Ad559)，以上對(duì)照品純度均>98%。色譜乙腈(美國(guó)Fisher公司)，色譜甲醇(美國(guó)TIDIA公司)，水為超純水，乙醇為分析純。

木芙蓉花樣品于2019年10月中旬采集于四川省成都市三合鎮(zhèn)木芙蓉花種植基地，自然陰干。經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院龍飛副教授鑒定為木芙蓉HibiscusmutabilisL.的干燥花。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱為Waters BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)，流動(dòng)相：流動(dòng)相0.1%甲酸水(A)-乙腈(B)梯度洗脫(0～4 min，95%→90%A；4～10 min，90%→55%A；10～18 min，55%→5%A；18～20 min，5%A)；流速：0.3 mL/min，柱溫25 ℃，進(jìn)樣量：3 μL。

2.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源(ESI)，掃描方式：正負(fù)離子同時(shí)掃描，噴霧電壓：3.5 kV；鞘氣流速：35 psi；輔助氣流速：10 psi；毛細(xì)管溫度：320 ℃，探頭加溫器溫度：350 ℃；最大噴霧電流：100 A；S-Lens分辨率：50。掃描模式為全掃描/數(shù)據(jù)依賴(lài)二級(jí)掃描(Full MS/dd-MS2)，一級(jí)分辨率70 000，二級(jí)分辨率17 500，掃描范圍m/z100～1 500。

2.3 對(duì)照品溶液的制備

分別稱(chēng)取甜菜堿、腺苷、苯丙氨酸、原兒茶酸、金絲桃苷、異槲皮苷、水楊酸、蘆丁、椴樹(shù)苷、槲皮素、小檗堿、山奈酚適量，置于10 mL量瓶中，加甲醇定容，制得濃度分別為25 μg/mL混合對(duì)照品溶液。

2.4 供試品溶液的制備

稱(chēng)取芙蓉花粉末5.0 g，加入90%乙醇25 mL進(jìn)行回流提取兩次，每次2 h，過(guò)濾，合并濾液，過(guò)0.22 μm微孔濾膜即得。

3 結(jié)果與分析

按“2.1”“2.2”項(xiàng)下條件對(duì)木芙蓉花供試品溶液進(jìn)行UPLC-Q-Orbitrap HRMS分析，分別得到正負(fù)離子模式下的總離子流圖(見(jiàn)圖1、2)。根據(jù)得到的高分辨精確化合物分子量，通過(guò)Thermo Xcalibur軟件篩選出實(shí)測(cè)相對(duì)分子量與理論相對(duì)分子量差值小于5 ppm的化合物，并計(jì)算其可能的元素組成。結(jié)合mz Cloud、mz Vault、ChemSpide、Pubchem等數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行匹配，參考相關(guān)文獻(xiàn)信息及與對(duì)照品比對(duì)等方式，最終從木芙蓉花中鑒別出54個(gè)化學(xué)成分，質(zhì)譜信息和結(jié)構(gòu)見(jiàn)表1和圖3。54個(gè)成分中黃酮及其苷類(lèi)成分25個(gè)，有機(jī)酸類(lèi)14個(gè)，香豆素類(lèi)成分4個(gè)，氨基酸類(lèi)2個(gè)，核苷類(lèi)2個(gè)，生物堿類(lèi)2個(gè)，其他類(lèi)5個(gè)，其中12個(gè)化合物經(jīng)過(guò)對(duì)照品比對(duì)后得到明確標(biāo)識(shí)。

圖1 木芙蓉花90%乙醇提取物的UPLC-Q-Orbitrap HRMS正離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of 90% ethanol extract of Hibiscus mutabilis flowers by UPLC-Q-Orbitrap HRMS in positive ion mode

圖2 木芙蓉花90%乙醇提取物的UPLC-Q-Orbitrap HRMS負(fù)離子流圖Fig.2 Total ion chromatogram of 90% ethanol extract of Hibiscus mutabilis flowers by UPLC-Q-Orbitrap HRMS in negative ion mode

圖3 木芙蓉花化合物的結(jié)構(gòu)Fig.3 Compounds structures of Hibiscus mutabilis flowers

3.1 黃酮類(lèi)及其苷類(lèi)化合物鑒定

黃酮及其苷類(lèi)成分為木芙蓉花的主要化學(xué)成分，本實(shí)驗(yàn)從木芙蓉花中鑒定了黃酮醇(峰34、42、46)，以槲皮素、山奈酚、異鼠李素等為母核黃酮苷(峰20、21、24、25、27～29、31～33、35、39～41、43)，二氫黃酮(峰25、36、45)，黃酮(峰30、50、51)，異黃酮類(lèi)(峰49)化合物共25個(gè)。

黃酮醇糖苷類(lèi)化合物易發(fā)生糖苷鍵斷裂，丟失葡萄糖殘基、鼠李糖殘基或是木糖殘基等碎片后形成黃酮醇苷元，而后苷元可繼續(xù)丟失CO2、H2O等碎片離子或是發(fā)生逆狄爾斯-阿爾德(RDA)裂解，形成[1,3A]-、[1,4A]-、[1,3B]-、[1,4B]-等特征碎片離子[9]。例如化合物27在ESI-模式下的準(zhǔn)分子離子峰m/z433.077 58，在二級(jí)質(zhì)譜中，丟失了阿拉伯糖殘基形成槲皮素特征離子m/z301.035 03、300.027 31，苷元離子脫去H2O、CO等中性碎片形成碎片離子m/z283.024 57、271.024 63、255.029 65、227.034 81；或者發(fā)生RDA裂解，脫去C8H6O3，生成特征碎片離子m/z151.002 85[1,3A]-。根據(jù)文獻(xiàn)信息[10]比對(duì)，推測(cè)該化合物可能為番石榴苷；化合物46在ESI-模式下的準(zhǔn)分子離子峰m/z285.040 19，脫去CO、H2O、CO2后形成二級(jí)碎片離子m/z257.044 59、239.034 65、229.050 40、211.039 08；或是C4-C10鍵斷裂形成碎片m/z243.028 61。根據(jù)文獻(xiàn)信息[11]及與對(duì)照品比對(duì)，確定該化合物為山奈酚，裂解途徑見(jiàn)圖4。

圖4 山奈酚的質(zhì)譜裂解途徑Fig.4 Fragmentation pathway of kaempferol

黃酮、異黃酮類(lèi)化合物二級(jí)質(zhì)譜裂解過(guò)程中易丟失CO、CO2等，鄰位羥基取代還易失去H2O，若有甲氧基取代的時(shí)候，則優(yōu)先連續(xù)丟失CH3，然后丟失CO。例如化合物50在ESI-模式下的準(zhǔn)分子離子峰m/z373.092 62，二級(jí)質(zhì)譜產(chǎn)生的碎片離子m/z358.069 27、343.045 75、328.022 28、300.027 19、285.003 94、257.009 09、229.013 26。根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索及與文獻(xiàn)信息[12]比對(duì)，確定該化合物為蔓荊子黃素。

二氫黃酮類(lèi)化合物易丟失H2O、CO等中性碎片離子或是發(fā)生RDA裂解。例如化合物26在ESI-模式下的準(zhǔn)分子離子峰m/z303.144 81，脫去H2O、CO2后形成二級(jí)質(zhì)譜產(chǎn)生的碎片離子m/z285.040 31、259.061 61、241.049 67；或發(fā)生RDA裂解生成[1,4A]-、[1,4B]-特征碎片離子m/z178.997 74和m/z124.015 70。根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索及與文獻(xiàn)信息[10]對(duì)比，確定該化合物為二氫槲皮素。

3.2 有機(jī)酸類(lèi)成分

從木芙蓉花中共鑒別有機(jī)酸類(lèi)成分14個(gè)(峰2、6、7、9、11、12、15、16、18、19、23、37、38、48)，二級(jí)質(zhì)譜裂解特征通常易失去H2O、CO、CO2、CH2等中性碎片且大多在負(fù)離子模式下有較好響應(yīng)?；衔?8在ESI-模式下的準(zhǔn)分子離子峰為m/z137.023 50，二級(jí)質(zhì)譜產(chǎn)生的碎片離子m/z93.033 54。根據(jù)文獻(xiàn)信息[13]及與對(duì)照品比對(duì)，確定化合物為水楊酸，裂解途徑見(jiàn)圖5。

圖5 水楊酸的質(zhì)譜裂解途徑Fig.5 Fragmentation pathway of salicylic acid

3.3 香豆素類(lèi)成分

從木芙蓉花中共鑒別香豆素類(lèi)成分4個(gè)(峰13、14、17、47)，其二級(jí)質(zhì)譜裂解過(guò)程中易丟失CO、H2O、CH3等中性分子，化合物13在ESI+模式下的準(zhǔn)分子離子峰m/z193.049 47，二級(jí)質(zhì)譜產(chǎn)生的碎片離子m/z178.026 02、165.054 75、133.028 38。根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索及與文獻(xiàn)信息[14]比對(duì)，確定化合物為東莨菪內(nèi)酯，裂解途徑見(jiàn)圖6。

圖6 東莨菪內(nèi)酯的質(zhì)譜裂解途徑Fig.6 Fragmentation pathway of scopoletin

3.4 核苷類(lèi)成分

從木芙蓉花中共鑒別2個(gè)核苷類(lèi)成分(峰4、8)，化合物4在ESI+模式下的準(zhǔn)離子峰為m/z268.103 94，在二級(jí)質(zhì)譜中，丟失一分子呋喃核糖殘基形成m/z136.061 68碎片離子。根據(jù)文獻(xiàn)信息[15]及與對(duì)照品比對(duì)，確定該化合物為腺苷，裂解途徑見(jiàn)圖7。

圖7 腺苷的質(zhì)譜裂解途徑Fig.7 Fragmentation pathway of adenosine

3.5 氨基酸類(lèi)成分

從木芙蓉花中共鑒別2個(gè)氨基酸類(lèi)成分(峰7、12)，二級(jí)質(zhì)譜裂解特征通常為連續(xù)丟失NH3、H2O、HCOOH等碎片，化合物10在ESI+模式下的準(zhǔn)分子離子峰為m/z166.086 07，二級(jí)質(zhì)譜產(chǎn)生的碎片離子有m/z149.059 62、131.049 18、120.080 87、103.054 54。根據(jù)文獻(xiàn)信息[16]及與對(duì)照品比對(duì)，確定該化合物為L(zhǎng)-苯丙氨酸，裂解途徑見(jiàn)圖8。

圖8 L-苯丙氨酸的質(zhì)譜裂解途徑Fig.8 Fragmentation pathway of L-phenylalanine

3.6 生物堿類(lèi)成分

從木芙蓉花中共鑒別2個(gè)生物堿類(lèi)成分(峰1、44)，化合物1在ESI+模式下的準(zhǔn)分子離子峰為m/z118.086 45，丟失一分子CH2和COOH后形成二級(jí)碎片離子m/z59.073 62。根據(jù)文獻(xiàn)信息[17]及與對(duì)照品比對(duì)，確定該化合物為甜菜堿，裂解途徑見(jiàn)圖9。

圖9 甜菜堿的質(zhì)譜裂解途徑Fig.9 Fragmentation pathway of betaine

3.7 其他類(lèi)

從木芙蓉花中共鑒別5個(gè)其他類(lèi)成分(峰3、22、52、53、54)，化合物3在ESI-離子模式下的準(zhǔn)分子離子峰為m/z341.109 86，二級(jí)質(zhì)譜產(chǎn)生的碎片離子有m/z179.055 25、161.044 68、119.034 12。根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索及與文獻(xiàn)信息[14]比對(duì)，確定該化合物為蔗糖。

4 討論與結(jié)論

近年來(lái)，UPLC-Q-Orbitrap HRMS技術(shù)以其高分辨率、高質(zhì)量精度、定性定量快速準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)廣泛應(yīng)用于中藥化學(xué)成分分析及復(fù)雜多成分質(zhì)量控制等領(lǐng)域。本實(shí)驗(yàn)選用0.1%甲酸水-乙腈為流動(dòng)相對(duì)木芙蓉花化學(xué)成分進(jìn)行梯度洗脫，為更好的探究木芙蓉花的化學(xué)成分，選用正、負(fù)兩種離子掃描方式進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。根據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道的保留時(shí)間、相對(duì)分子量、準(zhǔn)分子離子峰、二級(jí)質(zhì)譜碎片離子，結(jié)合二級(jí)質(zhì)譜裂解規(guī)律以及化學(xué)對(duì)照品質(zhì)譜信息等，對(duì)各質(zhì)譜峰進(jìn)行歸屬分析，從木芙蓉花乙醇提取液中共檢測(cè)到7類(lèi)成分(黃酮及其苷類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)、香豆素類(lèi)、氨基酸類(lèi)、核苷類(lèi)、生物堿類(lèi)等)，共54個(gè)化合物。結(jié)合文獻(xiàn)以及scifinder數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)其中33個(gè)成分首次在木芙蓉中報(bào)道，11個(gè)成分首次在木槿屬中報(bào)道。在花中新發(fā)現(xiàn)的11個(gè)黃酮類(lèi)成分，例如廣寄生苷和番石榴苷通過(guò)降低游離脂肪酸的釋放[18]、柚皮素-7-O-葡萄糖苷通過(guò)激活PPARγ受體和磷酸化PI3K/AKT信號(hào)通路表現(xiàn)出降糖作用[19]；蔓荊子黃素可通過(guò)下調(diào)PI3K/Akt信號(hào)通路抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲[20]、與微管蛋白結(jié)合來(lái)促使MCF7乳腺癌細(xì)胞G2/M期阻滯[21]，廣寄生苷、野鳶尾黃素通過(guò)抑制PI3K/AKT信號(hào)通路[22]、ROS介導(dǎo)的線粒體功能性障礙[23]來(lái)誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡；櫻桃苷對(duì)中波紫外線(UVB)導(dǎo)致的人角質(zhì)細(xì)胞(HaCaT)損傷[24]有修復(fù)作用等，對(duì)于木芙蓉花臨床應(yīng)用的拓展具有一定的意義。從構(gòu)效關(guān)系來(lái)看，黃酮類(lèi)成分的抗腫瘤、抗炎等多種藥理活性主要受羥基化程度、C2-3位雙鍵、糖基以及母核結(jié)構(gòu)的影響，木芙蓉花黃酮種類(lèi)眾多，結(jié)構(gòu)多樣性強(qiáng)，具有生物活性多樣性。本文完善了木芙蓉的化學(xué)成分庫(kù)，為后續(xù)木芙蓉花的開(kāi)發(fā)利用、藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究、質(zhì)量控制等提供了依據(jù)。

木芙蓉是一種常用中藥，木芙蓉葉收載于2020版《中國(guó)藥典》[25]，且葉和花均可以入藥。本實(shí)驗(yàn)與已報(bào)道的木芙蓉葉[11]化學(xué)成分對(duì)比，相同的黃酮類(lèi)成分有14個(gè)，有機(jī)酸和香豆素類(lèi)成分5個(gè)，體現(xiàn)了同一藥用植物不同部位中的化學(xué)成分具有一定的相似性。此外，木芙蓉花中某些已知成分未在此次分析中檢測(cè)到，可能與ESI的離子化效率有關(guān)；同分異構(gòu)體化合物的鑒定一直以來(lái)都是質(zhì)譜分析中的難點(diǎn)，因此僅通過(guò)質(zhì)譜來(lái)進(jìn)行指認(rèn)具有一定的局限性，需要核磁共振等波譜分析進(jìn)一步確認(rèn)。通過(guò)觀察總離子流圖，可以發(fā)現(xiàn)在保留時(shí)間11～17 min鑒別出化合物較少，因此為了進(jìn)一步了解該段化合物的組成，我們可以采用不同極性溶劑對(duì)其進(jìn)行部位萃取，通過(guò)用相同高效液相色譜條件進(jìn)行色譜峰分析，尋找其可能存在的極性部位，這也可為我們后續(xù)對(duì)木芙蓉花進(jìn)行以化合物分離為手段的物質(zhì)基礎(chǔ)研究起到一定指示作用。