白巖松，池 軍，張玲霞，馮慶梅，代麗萍*，王智民

1河南中醫(yī)藥大學藥學院；2河南中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥科學院；3河南省豫產道地藥材綜合開發(fā)利用工程技術研究中心；4鄭州市豫產食藥物質研發(fā)工程研究中心，鄭州450046；5中國中醫(yī)科學院中藥研究所，北京100700

丁香茄Calonyctionmuricatum(Linn.) G.Don為旋花科(Convolvulaceae)月光花屬一年生粗壯纏繞草本，又名金絲指葫蘆。廣泛分布于我國云南、河南、湖南、湖北等地。丁香茄始載于《救荒本草》，味苦，性寒，具有瀉下、解毒的功效[1]。全株可入藥，民間廣泛用于治療風火牙痛、乳腺炎、關節(jié)炎等疾病。鮮葉外敷患處，治療風火牙痛，幾分鐘即可止痛。迄今為止，未見丁香茄葉化學成分研究的相關報道，僅見少數(shù)天茄子(丁香茄種子)化學成分的報道，從中分離鑒定了生物堿類、樹脂糖苷類、苯丙素類等30個化合物[2-4]。為明確丁香茄葉的化學信息，發(fā)現(xiàn)丁香茄葉中結構新穎、活性強的抗炎鎮(zhèn)痛先導化合物或候選藥物，本研究基于脂多糖(LPS)誘導的小鼠巨噬細胞(RAW 264.7)為生物活性導向模型首次研究了丁香茄葉乙酸乙酯部位的化學成分，以期發(fā)現(xiàn)丁香茄葉中的抗炎活性成分，為其臨床應用及資源的合理開發(fā)利用提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

Bruker AV-500型核磁共振儀(德國Bruker公司)；Waters e2695型高效液相色譜儀，2998PDA型紫外檢測器(美國Waters公司)；Dinoex UltiMate 3000-LTQ orbitrap液質聯(lián)用儀(美國賽默飛公司)；Applied Photophysics Chirascan V100圓二色光譜儀(英國Applied Photophysics公司)；QBH LC 52型半制備液相(北京清博華公司)；BT25s精密天平(德國賽多利斯公司)；CO2培養(yǎng)箱(美國賽默飛公司)；酶標儀(美國賽默飛公司)；薄層色譜硅膠(GF254)和柱色譜硅膠(青島海洋化工公司)；ODS(30～50 μm，日本YMC公司)；MCI(日本三棱公司)；Toyopearl HW-40C(北京慧德易科技公司)；Agela FLash柱(天津博納艾杰爾公司)；ChromCore ODS-C18半制備型色譜柱(10 mm×250 mm，5 μm，蘇州納譜分析公司)；氘代試劑(上海麥克林公司)；噻唑藍(MTT)和脂多糖(LPS)購買于美國Sigma-Aldrich公司，胎牛血清(FBS)和DEME培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，NO檢測試劑盒(上海碧云天生物科技有限公司)。實驗所用試劑均為分析純(天津富宇公司)和色譜純(美國TEDIA公司)。

丁香茄葉于2019年6月采自河南省商丘市民權縣，經河南中醫(yī)藥大學藥學院代麗萍教授鑒定為旋花科月光花屬植物丁香茄Calonyctionmuricatum(Linn.) G.Don的葉。樣品(NO.2019-0613)存放于河南省豫產道地藥材綜合開發(fā)利用工程技術研究中心。

1.2 提取與分離

丁香茄干燥葉(17.0 kg)，粉碎，用10倍量70%乙醇冷凝回流提取2次，每次2 h。合并提取液，減壓濃縮得粗浸膏(約1.8 kg)。將粗浸膏用水分散，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，減壓回收溶劑，得到石油醚部位123.0 g，乙酸乙酯部位810.0 g，正丁醇部位375.0 g，水部位380.0 g。

分別以LPS誘導的小鼠巨噬細胞(RAW 264.7)作為抗炎活性篩選模型，對萃取部位進行活性篩選，取抗炎活性較好的乙酸乙酯萃取部位(800.0 g)經硅膠柱色譜(100～200目)，用二氯甲烷-甲醇(1∶0→0∶1)梯度洗脫得到7個流分Fr.A～G。Fr.B(160.0 g)經硅膠柱色譜(200～300目)，用石油醚-乙酸乙酯(1∶0→5∶1)梯度洗脫得到7個流分Fr.B-1～B-7。其中Fr.B-2析出化合物7(50.0 mg)，F(xiàn)r.B-5析出化合物14(20.0 mg)。Fr.B-5剩余母液(13.0 g)經MCI柱層析，用甲醇-水(30%→100%)梯度洗脫得到7個流分Fr.B-5-A～B-5-G。Fr.B-5-C(100.0 mg)經半制備型HPLC(ChromCore ODS-C18，23%乙腈-水，3 mL/min)得到化合物13(tR= 40.21 min，77.0 mg)。Fr.B-5-E(1.0 g)經反相Flash柱色譜，用乙腈-水(43%→50%)梯度洗脫得到11個流分Fr.B-5-E-1～B-5-E-11。Fr.B-5-E-3(48.7 mg)經半制備型HPLC(45%乙腈-0.1%甲酸水)分別得到化合物1(tR= 30.20 min，6.8 mg)、化合物4(tR= 37.21 min，10.0 mg)、化合物15(tR= 40.30 min，15.5 mg)。Fr.B-5-E-8(65.3 mg)經半制備型HPLC(45%乙腈-0.1%甲酸水)純化得到化合物2(tR= 45.42 min，13.1 mg)。Fr.B-5-E-10(175.2 mg)經半制備型HPLC(45%乙腈-0.1%甲酸水)得到化合物5(tR= 52.25 min，7.0 mg)。Fr.B-5-E-11(157.0 mg)經半制備型HPLC(70%甲醇-0.1%甲酸水)分別得到化合物3(tR= 50.23 min，10.5 mg)、化合物6(tR= 52.31 min，3.1 mg)。

Fr.D(178 g)經硅膠柱色譜(200～300目)，用二氯甲烷-甲醇(1∶0→0∶1)梯度洗脫得到7個流分Fr.D-1～D-7。Fr.D-6(40.0 g)經HW-40C柱色譜，用二氯甲烷-甲醇(1∶1)洗脫得到4個流分Fr.D-6-A～D-6-D。Fr.D-6-D(20.0g)經反相Flash柱色譜，用乙腈-水(5%→18%)梯度洗脫得到5個流分Fr.D-6-D-1～D-6-D-5。Fr.D-6-D-3(182.4 mg)經半制備型HPLC(14%乙腈-水)純化得到化合物12(tR= 50.30 min，15.9 mg)，F(xiàn)r.D-6-D-4(100.0 mg)經半制備型HPLC(14%乙腈-水)分別得到化合物8(tR= 30.25 min，7.0 mg)、化合物9(tR= 32.50 min，8.7 mg)、化合物10(tR= 45.20 min，10.1 mg)、化合物11(tR= 46.30 min，10.8 mg)。

1.3 抗炎活性測定

1.3.1 細胞活力實驗

取處于對數(shù)生長期的小鼠巨噬細胞(RAW 264.7)細胞，按1×105個/mL濃度稀釋，細胞稀釋液加至96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔加入100 μL細胞懸液。用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后棄培養(yǎng)基，分別加入不同濃度的待測樣品，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每組設3個復孔，MTT法測定細胞存活率。

1.3.2 抗炎活性篩選

本研究采用脂多糖(LPS)誘導的小鼠巨噬細胞(RAW 264.7)細胞炎癥篩選模型，對萃取部位和單體化合物進行活性篩選，取處于對數(shù)生長期的RAW 264.7細胞，按1×105個/mL濃度稀釋，細胞稀釋液加至96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔加入100 μL細胞懸液。隨后，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，給藥組分別加入不同濃度的待測樣品，再加入終濃度為1 μg/mL的LPS進行刺激，同時設置空白對照組(培養(yǎng)液)、模型組(LPS+培養(yǎng)液)和陽性對照組(地塞米松+LPS+培養(yǎng)液)，每組設3個復孔。小鼠巨噬細胞RAW 264.7在37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，后吸取培養(yǎng)液上清液100 μL轉移到酶標板中，按照NO試劑盒說明書步驟，用酶標儀在540 nm下測定OD值，計算化合物對NO釋放的抑制率。

2 實驗結果

2.1 結構鑒定

圖1 化合物1～15的化學結構Fig.1 The chemical structures of compounds 1-15

化合物2無色油狀物(甲醇)；HR-ESI-MS：m/z293.211 6 [M - H]-(calcd for C18H29O3，293.211 7)；ECD(MeOH)：λ(Δε)229(- 0.07)。1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：6.52(1H，dd，J= 15.2，11.0 Hz，H-14)，5.96(1H，dd，J= 11.8，9.9 Hz，H-13)，5.62(1H，dd，J= 15.2，6.7 Hz，H-15)，5.30～5.41(3H，m，H-9，10，12)，3.99(1H，q，J= 6.5 Hz，H-16)，2.91(2H，q，J= 6.8 Hz，H-11)，2.25(2H，t，J= 7.4 Hz，H-2)，2.06(2H，q，J= 7.0 Hz，H-8)，0.89(3H，t，J= 7.5 Hz，H-18)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：177.6(C-1),137.5(C-15)，131.5(C-9)，130.9(C-12)，129.2(C-13)，128.4(C-10)，126.4(C-14)，74.7(C-16)，35.1(C-2)，31.2(C-17)，30.7(C-4)，30.3(C-7)，30.2(C-6)，30.2(C-5)，28.1(C-8)，27.0(C-11)，26.1(C-3)，10.2(C-18)。以上數(shù)據與文獻[6]報道一致，鑒定化合物為(9Z,12Z,14E,16R)-16-hydroxyoc tadeca-9,12,14-trienoic acid。

化合物7白色粉末；1H NMR(500 MHZ，CDCl3)δ：3.64(2H，t，J= 6.6 Hz，H-1)，1.57(2H，m，H-2)，1.22～1.39(18H，s，H-3～11)，0.88(3H，t，J= 6.8 Hz，H-12)；13C NMR(125 MHZ，CDCl3)δ：63.3(C-1)，33.0(C-2)，32.1(C-3)，29.9(C-4)，29.8(C-5)，29.8(C-6)，29.8(C-7)，29.6(C-8)，29.5(C-9)，25.9(C-10)，22.9(C-11)，14.3(C-12)。以上數(shù)據與文獻[11]報道一致，鑒定化合物為1-十二烷醇。

化合物8黃色粉末；HR-ESI-MS：m/z447.091 8 [M - H]-(calcd for C21H19O11，447.092 7)。1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：8.06(2H，d，J= 8.8 Hz，H-2′，6′)，6.85(2H，d，J= 8.7 Hz，H-3′，5′)，6.42(1H，s，H-8)，6.19(1H，s，H-6)，5.38(1H，d，J= 7.7 Hz，H-1′′)；13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：177.6(C-4)，164.5(C-7)，161.3(C-5)，160.0(C-4′)，156.5(C-2)，156.4(C-9)，133.3(C-3)，131.1(C-2′，6′)，120.9(C-1′)，115.2(C-3′，5′)，103.9(C-10)，101.8(C-1′′)，98.9(C-6)，93.8(C-8)，75.8(C-5′′)，73.2(C-3′′)，71.3(C-2′′)，68.0(C-4′′)，60.3(C-6′′)。以上數(shù)據與文獻[12]報道一致，鑒定化合物為山柰酚-3-O-半乳糖苷。

化合物9黃色粉末；HR-ESI-MS：m/z477.102 7 [M - H]-(calcd for C22H21O12，477.103 3)。1H NMR(500 MHZ，DMSO-d6)δ：8.06(2H，d，J= 8.9 Hz，H-2′，6′)，6.85(2H，d，J= 9.0 Hz，H-3′，5′)，6.53(1H，s，H-8)，5.40(1H，d，J= 7.7Hz，H-1′′)，3.75(3H，d，J= 2.4 Hz，6-OMe)；13C NMR(125 MHZ，DMSO-d6)δ：177.7(C-4)，160.0(C-2)，157.6(C-4′)，156.4(C-9)，152.4(C-5)，151.6(C-7)，132.9(C-3)，131.3(C-6)，131.0(C-2′，6′)，120.9(C-1′)，115.1(C-3′，5′)，104.3(C-10)，101.6(C-1′′)，94.0(C-8)，75.8(C-5′′)，73.1(C-3′′)，71.2(C-2′′)，67.9(C-4′′)，60.2(C-6′′)，60.0(6-OMe)。以上數(shù)據與文獻[13]報道一致,鑒定化合物為6-methoxykaempferol-3-O-galactoside。

化合物10黃色粉末；HR-ESI-MS：m/z447.092 3 [M - H]-(calcd for C21H19O11，447.092 7)。1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：8.03(2H，d，J= 8.6 Hz，H-2′，6′)，6.88(2H，d，J= 8.6 Hz，H-3′，5′)，6.40(1H，s，H-8)，6.18(1H，s，H-6)，5.44(1H，d，J= 7.5 Hz，H-1′′)；13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：177.4(C-4)，165.1(C-7)，161.3(C-5)，160.0(C-4′)，156.5(C-2)，156.2(C-9)，133.2(C-3)，131.0(C-2′，6′)，121.0(C-1′)，115.2(C-3′，5′)，103.8(C-10)，101.0(C-1′′)，99.0(C-6)，93.9(C-8)，77.6(C-3′′)，76.5(C-5′′)，74.3(C-2′′)，70.0(C-4′′)，60.9(C-6′′)。以上數(shù)據與文獻[14]報道一致，鑒定化合物為紫云英苷。

化合物11黃色粉末；HR-ESI-MS：m/z477.102 8 [M - H]-(calcd for C21H21O12，477.103 3)。1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：8.03(2H，d，J= 8.9Hz，H-2′，6′)，6.88(2H，d，J= 8.9 Hz，H-3′，5′)，6.51(1H，s，H-8)，5.45(1H，d，J= 7.5 Hz，H-1′′)，3.75(3H，s，6-OMe)；13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：177.6(C-4)，160.0(C-2)，158.3(C-4′)，156.2(C-9)，152.3(C-5)，151.7(C-7)，132.8(C-3)，131.5(C-6)，130.9(C-2′，6′)，121.0(C-1′)，115.1(C-3′，5′)，104.1(C-10)，100.9(C-1′′)，94.0(C-8)，77.5(C-3′′)，76.4(C-5′′)，74.2(C-2′′)，69.9(C-4′′)，60.9(C-6′′)，60.0(6-OMe)。以上數(shù)據與文獻[15]報道一致，鑒定化合物為6-methoxykaempferol-3-O-glucoside。

化合物13白色粉末；分子式C11H12O4。1H NMR(500 MHZ，CD3OD)δ：7.54(1H，d，J= 15.9 Hz，H-7)，7.04(1H，d，J= 1.8 Hz，H-2)，6.94(1H，d，J= 1.7 Hz，H-6)，6.78(1H，d，J= 8.2 Hz，H-5)，6.25(1H，d，J= 15.9 Hz，H-8)，4.22(2H，q，J= 7.1 Hz，H-1′)，1.32(3H，t，J= 7.1 Hz，H-2′)；13C NMR(125 MHZ，CD3OD)δ：169.3(C-9)，149.5(C-3)，146.8(C-7)，146.7(C-4)，127.7(C-1)，122.9(C-6)，116.5(C-5)，115.2(C-8)，115.1(C-2)，61.4(C-1′)，14.6(C-2′)。以上數(shù)據與文獻[17]報道一致，鑒定化合物為咖啡酸乙酯。

化合物14白色粉末；分子式C6H6O3。1H NMR(500 MHZ，CDCl3)δ：7.71(1H，d，J= 5.5 Hz，H-5)，6.43(1H，d，J= 5.5 Hz，H-6)，2.37(3H，s，H-1)；13C NMR(125 MHZ，CDCl3)δ：173.0(C-4)，154.4(C-6)，149.1(C-2)，143.3(C-3)，113.1(C-5)，14.5(C-1)。以上數(shù)據與文獻[18]報道對照基本一致，鑒定化合物為麥芽酚。

2.2 不同給藥組的抗炎活性

2.2.1 RAW 264.7細胞活力

采用MTT實驗檢測不同濃度萃取部位或單體對RAW 264.7細胞活力的影響，結果見表1。不同萃取部位，包括石油醚、乙酸乙酯、正丁醇及水部位濃度，分別在不高于100、25、50、25 μg/mL的濃度下，沒有明顯細胞毒性(細胞活力≥90%)；單體化合物1、3、4、5分別在不高于100 μM的濃度下，均沒有明顯細胞毒性(細胞活力≥90%)。

表1 不同給藥組對RAW 264.7細胞活力影響

2.2.2 抑制NO釋放活性

評價不同給藥組抑制RAW 264.7細胞釋放NO水平，結果見表2。乙酸乙酯部位顯示出較強的抑制NO釋放作用，在25 μg/mL濃度下其抑制率達28.24%±1.80%；化合物1、3、4、5均顯示一定的抗炎活性，其中1和5抑制NO釋放較為顯著，其IC50值分別為1.17±0.51、0.97±0.89 μM。

表2 不同給藥組對LPS誘導的RAW 264.7細胞NO水平影響

3 討論與結論

丁香茄葉外敷治療風火牙痛具有悠久的應用歷史，且療效確切。但其物質基礎不明確。體外活性篩選結果表明，丁香茄葉乙酸乙酯部位具有較好的抗炎活性。因此，本研究重點對丁香茄葉乙酸乙酯部位的化學成分進行了系統(tǒng)研究，從中分離鑒定了15個化合物，包括十八元不飽和脂肪酸類、黃酮苷類、有機酸類等。其中14個化合物(1～12、14、15)均為首次從該屬植物中分離得到。單體化合物的體外活性篩選結果表明，化合物1、3、4、5均具有較好的抗炎活性，其中化合物1和5的抗炎活性較為顯著。本研究為該植物在抗炎活性方面的研究奠定了基礎，豐富了丁香茄葉的化學信息。