陳 靜，魏鑒騰，裴 棟，陳文雅，劉建飛，邸多隆，劉曄瑋*

1蘭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)研究所；2中國科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所；3中科院西北特色植物資源化學(xué)重點實驗室，蘭州 730000

酪氨酸酶(EC.1.14.18.1)廣泛存在于微生物、動植物和人體中，是參與黑色素生成過程的重要限速酶，其表達(dá)水平和活性決定著黑色素合成的速度和產(chǎn)量[1]。抑制酪氨酸酶的活性，可改善皮膚中色素細(xì)胞的酪氨酸酶代謝，阻止色素沉著的形成，起到預(yù)防雀斑、黃褐斑、老年斑等的形成和美白等作用[2]。目前常用的酪氨酸酶抑制劑，如曲酸、氫醌具有良好的抑制能力，但會產(chǎn)生皮炎、皮膚過敏甚至皮膚癌等副作用[3]。因此尋找安全、有效且對人體無副作用的酪氨酸酶抑制劑是目前研究的熱點。目前，研究表明許多植物提取物中的酚類、黃酮類及其衍生物、多糖類、揮發(fā)油、有機(jī)酸、香豆素類等是酪氨酸酶抑制劑的較好來源[4]。

橄欖苦苷(oleuropein)是由羥基酪醇和油橄欖骨架形成的裂環(huán)烯醚萜苷化合物，分布于整棵油橄欖，其中油橄欖葉中含量是最豐富的，其次為油橄欖果[5]。近年來,隨著國內(nèi)外學(xué)者對橄欖苦苷研究的不斷深入,發(fā)現(xiàn)其具有多種生物活性，如：抗病毒作用[6]、抗腫瘤作用[7]、抗菌作用[8]、抗氧化作用[9]、降血糖作用[10]、降血壓作用[11]、抗阿爾茨海默病[12]、皮膚創(chuàng)傷保護(hù)作用[13]等，但橄欖苦苷對酪氨酸酶活性影響的研究鮮見報道，本文通過研究橄欖苦苷對酪氨酸酶活性的影響及其作用機(jī)理，旨在為橄欖苦苷作為美白成分的開發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小鼠B16黑色素瘤細(xì)胞(來源于日本JCRB細(xì)胞庫)；Hyclone DMEM高糖培養(yǎng)液(美國Thermo Fisher公司)；胎牛血清、胰蛋白酶-EDTA溶液及青-鏈霉素(Biological Industries 公司)；MTT(北京索萊寶科技有限公司)；橄欖苦苷(純度≥98%，中科院西北特色植物資源化學(xué)重點實驗室自制)；蘑菇酪氨酸酶(≥1 000 U/mg，Sigma公司)；L-多巴(純度>99%，麥克林公司)；曲酸(純度>99%，北京索萊寶科技有限公司)；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉及其他試劑均為分析純。

CI-191C型191L氣套式CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國精騏有限公司)；HFsafe-1200型生物安全柜(上海力申科學(xué)儀器有限公司)；CKX41SF型倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；ELx808型酶標(biāo)儀(美國 BioTek 公司)；XMTD-7000型電熱恒溫水浴鍋(北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及傳代

將B16細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM高糖完全培養(yǎng)基中,培養(yǎng)條件為37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中,每天換液，2～3天傳代一次。

1.2.2 MTT法檢測B16細(xì)胞的活力

參照文獻(xiàn)[14]報道的方法，取對數(shù)生長期的B16細(xì)胞，接種于96孔板中(5×103個/100 μL/孔)，37 ℃培養(yǎng)24 h。實驗設(shè)立對照組、不同濃度的橄欖苦苷組和曲酸組，每組設(shè)6個復(fù)孔。對照組更換新鮮培養(yǎng)基，橄欖苦苷組更換為含不同濃度橄欖苦苷的培養(yǎng)基，曲酸組更換為含不同濃度曲酸的培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后，加入MTT溶液(5 mg/mL，20 μL/孔)，繼續(xù)培養(yǎng)3 h。棄上清加DMSO(150 μL/孔)，充分振蕩，待結(jié)晶物完全溶解后，酶標(biāo)儀于490 nm處測各孔吸光度。按下式計算細(xì)胞相對活力：

1.2.3 B16細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶活性的測定

參照文獻(xiàn)[15]報道的方法，取對數(shù)生長期的B16細(xì)胞，接種于96孔板中(5×103個/100 μL/孔)，37 ℃培養(yǎng)24 h。實驗設(shè)立對照組、不同濃度的橄欖苦苷組和曲酸組，每組設(shè)6個復(fù)孔。對照組更換新鮮培養(yǎng)基，橄欖苦苷組換為含不同濃度橄欖苦苷的培養(yǎng)基，曲酸組換為含不同濃度曲酸的培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后，用PBS清洗一次,每孔加50 μL含1% Triton X-100的PBS，-80 ℃放置30 min，37 ℃孵育使細(xì)胞完全破裂，反復(fù)3次后加入L-多巴(4 mmol/L，50 μL/孔)，37 ℃孵育1 h，酶標(biāo)儀于475 nm處測各孔吸光度。按下式計算細(xì)胞相對酪氨酸酶活性：

1.2.4 橄欖苦苷對酪氨酸酶活力的影響

將50 μL橄欖苦苷(終濃度為0、0.05、0.09、0.19、0.28、0.37和0.46 mmol/L)和50 μL酪氨酸酶(終濃度為25 U/mL)于37 ℃水浴保溫5 min，再加入50 μL磷酸鹽緩沖液(pH=6.8)和50 μLL-多巴(終濃度為0.5 mmol/L)，37℃恒溫下反應(yīng)10 min，475 nm下測定吸光度。曲酸作為陽性對照(終濃度為0、0.003、0.007、0.014、0.035、0.070、0.176、0.352 mmol/L)。按下式計算相對酶活力：

式中：A1和A2是橄欖苦苷、酪氨酸酶與L-多巴反應(yīng)初末的吸光度；A3和A4是酪氨酸酶與L-多巴反應(yīng)初末的吸光度。

按照上述測定方法，將反應(yīng)液置于酶標(biāo)儀中37 ℃恒溫，間隔40 s測定一次，共測定10 min，選取0～5.3 min吸光度隨時間的改變擬合方程，其斜率即為酶活力值。

1.2.5 橄欖苦苷對酪氨酸酶活性的抑制作用機(jī)理

按照“1.2.4”項下的測定方法。通過固定L-多巴濃度，改變酪氨酸酶濃度(終濃度為12.5、25、37.5、50、62.5 U/mL)，測定不同濃度橄欖苦苷在各濃度酪氨酸酶催化下氧化L-多巴產(chǎn)生的吸光度。以相對酶活力對酶濃度作圖，根據(jù)圖像判斷橄欖苦苷對酪氨酸酶活性的抑制作用是否可逆。如果作圖結(jié)果為一組直線且通過原點，則為可逆抑制；如果得到一組平行直線，則為不可逆抑制。

1.2.6 橄欖苦苷對酪氨酸酶活性的抑制類型和抑制常數(shù)

1.2.7 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果

2.1 橄欖苦苷對B16黑色素瘤細(xì)胞活力的影響

由圖1可見，橄欖苦苷濃度為400 μmol/L時對B16細(xì)胞有明顯的損傷作用(P<0.01)，25～200 μmol/L橄欖苦苷對B16細(xì)胞既無毒性作用，也無明顯的促細(xì)胞增殖作用(P>0.05)。

圖1 橄欖苦苷對B16細(xì)胞活力的影響(n=6)Fig.1 Effect of oleuropein on the B16 cells viability(n=6)注：與對照組比較，**P<0.01。Note:**P<0.01 vs control group.

2.2 橄欖苦苷對B16黑色素瘤細(xì)胞酪氨酸酶活性的影響

由圖2可見，100～200 μmol/L的橄欖苦苷對B16細(xì)胞酪氨酸酶活性有抑制作用(P<0.01)，橄欖苦苷濃度為100 μmol/L，對B16細(xì)胞酪氨酸酶活性的抑制率為8.96%±2.53%，濃度為200 μmol/L，對B16細(xì)胞酪氨酸酶活性的抑制率為33.41%±3.74%。曲酸作為陽性對照，濃度為600 μmol/L，其抑制率為13.77±1.78%。濃度為800 μmol/L，其抑制率為24.59±0.82%。相比較而言，橄欖苦苷對B16細(xì)胞酪氨酸酶活性優(yōu)于曲酸。

圖2 橄欖苦苷對B16細(xì)胞酪氨酸酶活性的影響(n=6)Fig.2 Effect of oleuropein on tyrosinase activity of B16 cells (n=6)注：與對照組比較，**P<0.01。Note:**P<0.01 vs control group.

2.3 不同濃度的橄欖苦苷對酪氨酸酶活力的影響

由圖3可見，反應(yīng)體系吸光度隨反應(yīng)時間的延長而逐漸增大，吸光度隨時間變化的曲線通過原點，不存在遲滯效應(yīng)。在相同反應(yīng)時間下，隨著橄欖苦苷濃度的增大，曲線的斜率不斷減小，即酪氨酸酶催化氧化L-多巴的速度不斷降低，說明橄欖苦苷具有抑制酪氨酸酶活性的能力。由圖4、5可見，橄欖苦苷和曲酸的IC50分別為0.210、0.037 mmol/L。橄欖苦苷對酪氨酸酶抑制活性低于陽性對照曲酸，由于曲酸對皮膚的不良作用，使用受到一定的限制。

圖3 橄欖苦苷對酪氨酸酶作用進(jìn)程曲線Fig.3 The curve of the action of oleuropein on tyrosinase

圖4 橄欖苦苷對酪氨酸酶活力的影響Fig.4 Effect of oleuropein on tyrosinase activity

圖5 曲酸對酪氨酸酶活力的影響Fig.5 Effect of kojic acid on tyrosinase activity

2.4 橄欖苦苷對酪氨酸酶活性的抑制作用機(jī)理

圖6為不同濃度橄欖苦苷下酶活力與酶濃度的關(guān)系。由圖6可見，以酶活力對酶濃度作圖時，得到一組通過原點的直線，該直線的斜率隨著橄欖苦苷濃度的增大而逐漸降低，表明橄欖苦苷是通過抑制酶活力導(dǎo)致酪氨酸酶催化氧化L-多巴的速度減慢，而不是通過降低有效酶量所導(dǎo)致的，說明橄欖苦苷對酪氨酸酶活性的抑制屬于可逆型抑制。

圖6 不同濃度橄欖苦苷下酶濃度與酶活力的關(guān)系Fig.6 Relationship between enzyme concentration and enzyme activity under different concentrations of oleuropein

2.5 橄欖苦苷對酪氨酸酶活性的抑制類型和抑制常數(shù)

圖7為橄欖苦苷的抑制類型和抑制常數(shù)。由圖7A可見雙倒數(shù)Lineweaver-Burk圖，該圖為相交于橫軸一點的直線，隨著橄欖苦苷濃度增大，Km值不變，Vm值逐漸減小，符合非競爭型抑制類型的特征。以米氏方程的斜率對橄欖苦苷濃度二次作圖得到圖7B，橄欖苦苷對游離酶的抑制常數(shù)(KI)為6.77 mmol/L。橄欖苦苷的最大酶促反應(yīng)速率和米氏常數(shù)見表1，Km為0.42 mmol/L。

圖7 橄欖苦苷的抑制類型(A)和抑制常數(shù)KI(B)Fig.7 Inhibition types (A) and inhibition constants (B) of oleuropein

表1 橄欖苦苷的最大酶促反應(yīng)速度和米氏常數(shù)

續(xù)表1(Continued Tab.1)

3 討論與結(jié)論

酶促反應(yīng)中以測定單位時間內(nèi)產(chǎn)物的增量來表示酶促反應(yīng)速度。初速度是指在酶促反應(yīng)開始的一段時間內(nèi)的速度，此時，斜率幾乎不變，在一定底物濃度下，由產(chǎn)物與時間關(guān)系曲線過零切線的斜率求得[16]。一般采用測定酶促反應(yīng)初速度的方法來測定酶活力，此時干擾因素較少。本實驗中，在反應(yīng)0～5.3 min時A475 nm-Time曲線近似呈線性關(guān)系，隨著時間的延長，曲線逐漸平坦，斜率降低，反應(yīng)的速度也就降低，此時測得的酶活力不能代表真實的酶活力，故取反應(yīng)5.3 min時的反應(yīng)速度為初速度。

體外抑制酪氨酸酶活性實驗分為細(xì)胞實驗和生化實驗。Chan等[17]認(rèn)為，細(xì)胞能夠模擬真實的生理環(huán)境，通過細(xì)胞實驗測定酪氨酸酶的活性比直接測定酪氨酸酶活性可靠，更能反映其抑制活性。本研究中橄欖苦苷對B16細(xì)胞酪氨酸酶抑制活性和對蘑菇酪氨酸酶的抑制活性存在差異，在細(xì)胞水平上，橄欖苦苷抑制酪氨酸酶活性優(yōu)于陽性對照曲酸。這與Li等[18]研究結(jié)果一致。

當(dāng)人體皮膚暴露于紫外線輻射時，會產(chǎn)生大量的活性氧(ROS)和自由基，進(jìn)而加速皮膚的老化、色素沉著、皺紋加深等[19]。研究表明，升高的ROS會通過在表皮中動員α-黑色素細(xì)胞刺激素來激活酪氨酸酶，最終刺激黑素細(xì)胞產(chǎn)生黑色素[20]?？寡趸瘎┩ㄟ^清除活性氧和自由基，促進(jìn)機(jī)體的正常代謝，改善皮膚的不良狀況，使色素逐漸消散，從而起到美白的作用[21]。Wang等[22]研究發(fā)現(xiàn)，抗氧化劑：光甘草定、白藜蘆醇、氧化白藜蘆醇及苯乙基間苯二酚，當(dāng)以L-多巴作為底物時，抗氧化活性與抑制酪氨酸酶活性之間具有協(xié)同作用，極大地抑制了酪氨酸酶活性。橄欖苦苷具有較強的抗氧化活性[9]，其抑制酪氨酸酶活性是否與抗氧化活性有關(guān)，橄欖苦苷與抗氧化劑是否存在協(xié)同作用值得進(jìn)一步探索。

酪氨酸酶是黑色素合成過程中的關(guān)鍵酶，通過抑制酪氨酸酶的活性，可以抑制黑色素的生成，進(jìn)而達(dá)到美白的功效[23,24]。本研究結(jié)果表明，橄欖苦苷對B16細(xì)胞酪氨酸酶及蘑菇酪氨酸酶均有明顯的抑制作用，呈現(xiàn)良好的劑量依賴關(guān)系。通過動力學(xué)分析，橄欖苦苷對蘑菇酪氨酸酶的抑制作用類型為可逆性非競爭性抑制，即橄欖苦苷與酪氨酸酶的結(jié)合在底物結(jié)合部位以外的必需基團(tuán)上，橄欖苦苷并不降低酪氨酸酶對底物(L-多巴)的親和力，而是通過阻止酶的催化作用，使Vm降低從而達(dá)到抑制酶活性的作用。橄欖苦苷來源廣泛，安全性高，且有較好的抗氧化活性，作為潛在的美白產(chǎn)品的原料具有廣泛的應(yīng)用前景。