劉 偉，張揚(yáng)星，楊新洲，歐陽艷，趙 平*

1伊犁師范大學(xué)新疆維吾爾自治區(qū)教育廳高校天然產(chǎn)物化學(xué)與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，伊寧 835000；2中南民族大學(xué)，武漢 430074

糖尿病是一組由于胰島素分泌或胰島素作用缺陷引起的以高血糖和最終糖尿癥為特征的代謝性疾病[1]。研究數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)在2017年全球糖尿病患者人數(shù)為8.51億，90%以上都為2型糖尿病(T2DM)[2]。T2DM是一種復(fù)雜的代謝失調(diào)疾病，其特征是慢性高血糖和不同程度的胰島素抵抗(IR)[3,4]。引起IR的原因之一是葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(GLUT4)蛋白的表達(dá)和功能的失調(diào)[5]。胰島素可以刺激骨骼肌葡萄糖攝取，主要是通過誘導(dǎo)GLUT4從細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存位置向質(zhì)膜移位，GLUT4向細(xì)胞表面的轉(zhuǎn)運(yùn)缺陷是2型糖尿病胰島素抵抗的一個(gè)關(guān)鍵特征[6]。因此，了解GLUT4的轉(zhuǎn)位和表達(dá)機(jī)制對(duì)防治糖尿病有著極為重要的作用，也表明其是潛在糖尿病治療的藥物靶點(diǎn)[7]。

苦豆子(SophoraalopecuroidesL.)作為豆科槐屬多年生草本植物，廣泛分布于中國(guó)西北部各省和中亞國(guó)家，具有清熱解毒、祛風(fēng)解渴等功效[8]，成為了西北地區(qū)常用少數(shù)民族藥材。生物堿是苦豆子中主要的化學(xué)成分之一，多數(shù)的化學(xué)與藥理學(xué)研究是圍繞苦豆子中的生物堿成分展開的[9,10]?？喽棺又械亩鄶?shù)生物堿屬于喹諾里西啶生物堿，是屬于哌啶或吡啶的衍生物[11]，在抗炎、抗心律失常、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等方面具有重要的藥理活性和應(yīng)用前景[12]。近年來，有研究表明從苦豆子中提取出的總生物堿能夠?qū)SS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠有保護(hù)作用，可減輕結(jié)腸損傷，防止腸道微生物群失調(diào)，調(diào)節(jié)膽酸代謝[13]?，F(xiàn)有關(guān)于苦豆子總堿在糖尿病方面的研究還較少，因此，本實(shí)驗(yàn)通過提取苦豆子中總堿，研究其降血糖效果及相關(guān)作用通路，以期充分利用苦豆子藥用資源價(jià)值，為研究抗糖尿病藥物提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 儀器

Thermo Forma 371直熱式CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo Fisher公司)；Olympus IX 81倒置顯微鏡(Olympus公司)；Tecan M200 PRO多功能酶標(biāo)儀(Tecan公司)；DYY-6C型電泳儀(北京市六一儀器廠)；Rio-Rad Chemidoc XRS化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司)；LSM700 激光共聚焦顯微鏡(Zeiss公司)。

1.2 藥品與試劑

苦豆子地上部分于2018年7月采于新疆伊犁，經(jīng)中南民族大學(xué)藥學(xué)院萬定榮教授鑒定為苦豆子(SophoraalopecuroidesL.)的地上部分，植物樣本保存于中南民族大學(xué)標(biāo)本館。

BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，Lot：082820201207)；PAGE凝膠快速制備試劑盒(10%)(上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司，Lot：04542025)；葡萄糖(GLU-OX)檢測(cè)試劑盒(氧化酶法)(英科新創(chuàng)有限公司，Lot：7008240303)；特靈敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，Lot：121720210418)；MTT(德國(guó)BioFroxx公司，Lot：EZ2811A179)；Anti-Akt、Anti-p-Akt、Anti-β-actin、Anti-GLUT4、Anti-AMPKα、Anti-p-AMPKα、Anti-p-PKC(pan)(Cell signaling technology公司，Lot：28、30、18、7、21、2、2)；HRP-goat anti rabbit IgG、HRP-goat anti mouse IgG(CWBIO 公司，Lot：01332/40242；00393/50537)；α-Minimal Essential Medium(α-MEM，美國(guó)Gibco公司，Lot：8121273)；胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司，Lot：19050501)。

PSS生理鹽溶液：135 mM NaCl，5 mM KCl，2 mM CaCl2，1 mM MgCl2，10 mM HEPES，10 mM Glucose，加水定容至1 L，用5 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至7.4。

1.3 細(xì)胞

L6-myc-GLUT4-mOrange細(xì)胞：穩(wěn)定表達(dá)轉(zhuǎn)染了紅色熒光蛋白myc-GLUT4-mOrange的L6骨骼肌細(xì)胞。

1.4 方法

1.4.1 苦豆子總堿的提取

取干燥的苦豆子地上部分1 kg，粉碎，用95%的乙醇室溫下提取4次，合并多次提取液，減壓濃縮至無醇味即得浸膏150 mL。將浸膏加200 mL熱蒸餾水分散后，加10% H2SO4調(diào)pH至2～3左右，然后用石油醚萃取多次除去脂肪酸等小極性成分，之后將溶液加氨水調(diào)節(jié)至pH值為10左右，再次用乙酸乙酯萃取多次得苦豆子總生物堿部位(TASA，23 g)。

1.4.2 L6骨骼肌細(xì)胞的培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化

將穩(wěn)定表達(dá)轉(zhuǎn)染了紅色熒光蛋白myc-GLUT4-mOrange的L6骨骼肌細(xì)胞在含10%胎牛血清和1%雙抗的α-MEM培養(yǎng)基于37 ℃，5% CO2條件下培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至80%左右，換為含2%胎牛血清和1%雙抗的α-MEM培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)分化。隔天換液，誘導(dǎo)分化培養(yǎng)5～7天，至80%的細(xì)胞生長(zhǎng)出肌管，即得到分化成熟的成肌細(xì)胞。

1.4.3 L6骨骼肌細(xì)胞葡萄糖攝取實(shí)驗(yàn)

為測(cè)定TASA對(duì)L6骨骼肌細(xì)胞葡萄糖攝取的刺激作用。首先，將L6骨骼肌細(xì)胞接種于96孔板中，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置10個(gè)重復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組(control,Con)、陽性對(duì)照胰島素組(insulin,Ins)和藥物組。待細(xì)胞匯合到80%左右后，換成含2%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基分化5～7天。接下來將96孔板中培養(yǎng)的細(xì)胞用不含血清的α-MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基饑餓2 h，然后分別加入100 μL的15、30、60 μg/mL TASA(TASA-15、TASA-30、TASA-60)、100 nM胰島素和無血清α-MEM(空白對(duì)照)后，放入37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min，另取一個(gè)新的96孔板，按照試劑盒說明書對(duì)每孔加入200 μL葡萄糖氧化酶試劑，并另取一排加入氧化酶試劑后加入2 μL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，從舊96孔板中一對(duì)一地取上清液2 μL加入到新板中，30 min內(nèi)用酶標(biāo)儀于505 nm處測(cè)量吸光值。

1.4.4 MTT法檢測(cè)TASA作用L6骨骼肌細(xì)胞藥物毒性

按照“1.4.3”方法加入無血清α-MEM培養(yǎng)基和不同濃度TASA作用L6骨骼肌細(xì)胞30 min后，吸去培養(yǎng)基及藥物，每孔加入100 μL用α-MEM稀釋的MTT溶液(5 mg/mL)，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱避光培養(yǎng)4 h后，吸去MTT，再向每孔內(nèi)加入150 μL DMSO溶液后，測(cè)量490 nm處吸光值。

1.4.5 激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)L6骨骼肌細(xì)胞中GLUT4的轉(zhuǎn)運(yùn)

當(dāng)L6-myc-GLUT4-mOrange細(xì)胞長(zhǎng)到適合傳代密度時(shí)，將其接種在經(jīng)95%酒精滅菌后的無菌蓋玻片上，于培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)使其完全的貼壁，然后利用不含血清的α-MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液饑餓細(xì)胞2 h后，再用PSS生理鹽溶液清洗，將饑餓的細(xì)胞放置在激光共聚焦顯微鏡之下，加入200 μL PSS生理鹽溶液，于555 nm激發(fā)波長(zhǎng)下觀測(cè)myc-GLUT4-mOrange的熒光轉(zhuǎn)位的動(dòng)態(tài)變化。觀察并記錄加入30 μg/mL TASA后5 min內(nèi)myc-GLUT4-mOrange的熒光強(qiáng)度的變化，并計(jì)算GLUT4在胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)。

1.4.6 總蛋白的提取

將分化5～7天的細(xì)胞用無血清α-MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基饑餓2 h，然后分別加入陽性對(duì)照和不同濃度的TASA作用30 min后，立即將培養(yǎng)皿放于冰上，棄去含藥物的培養(yǎng)基．終止藥物的作用，并用預(yù)先在4 ℃預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞3次后吸干，每皿加入含苯甲基磺酰氟(PMSF)的RIPA裂解液100 μL。用1 mL槍頭底部將細(xì)胞盡量均勻地刮起；并收集于1.5 mL EP管中，再依次用27孔徑和12孔徑注射器進(jìn)行多次的抽提破碎30次，全部操作必須保持在冰上完成。利用冷凍離心機(jī)在4 ℃，12 000 rpm的條件下，對(duì)破碎后的細(xì)胞進(jìn)行冷凍離心處理10 min，再小心地吸取上清，棄去沉淀，上清液即為細(xì)胞總蛋白。按照Beyotime BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒說明書對(duì)蛋白濃度進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)收集所得的蛋白濃度及體積，加入相對(duì)應(yīng)體積的5×SDS-PAGE loading buffer，振蕩后置于95 ℃金屬加熱器上變性10 min，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.7 Western blot檢測(cè)GLUT4及相關(guān)信號(hào)通路蛋白表達(dá)情況

取等量蛋白質(zhì)樣品上樣，使用SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，并轉(zhuǎn)膜至NC膜，利用5%脫脂奶粉溶液封閉2 h，之后用TBST洗膜3次，每次10 min，再加入稀釋后的AKT、p-AKT、β-actin、GLUT4、AMPKα、p-AMPKα和p-PKC(pan)一抗，4 ℃搖床上孵育過夜。之后再用TBST洗膜3次，每次10 min，室溫?fù)u床孵育稀釋的二抗1 h。使用ECL化學(xué)發(fā)光液顯色發(fā)光，凝膠成像系統(tǒng)顯影及配套軟件計(jì)算灰度值。

1.4.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 TASA對(duì)L6骨骼肌細(xì)胞內(nèi)葡萄糖攝取的影響

利用葡萄糖檢測(cè)試劑盒研究了TASA對(duì)于L6骨骼肌細(xì)胞內(nèi)葡萄糖攝取的情況。如圖1所示，以Ins作為陽性對(duì)照，并設(shè)立空白對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，結(jié)果證明使用100 nM Ins和不同濃度的TASA分別處理L6細(xì)胞，兩者都能明顯促進(jìn)L6細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取。

圖1 不同濃度的TASA處理對(duì)L6細(xì)胞葡萄糖攝取的影響Fig.1 Effect of TASA with different concentrations on glucose uptake of L6 cells注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。NS表明無顯著性差異，下同。Note:Compared with control,*P < 0.05,**P < 0.01,***P< 0.001.NS showed no significant difference The same below.

2.2 TASA對(duì)L6骨骼肌細(xì)胞的毒性影響

利用MTT法對(duì)TASA作用于L6骨骼肌細(xì)胞進(jìn)行了細(xì)胞毒性檢測(cè)。結(jié)果如圖2所示，15、30、60 μg/mL濃度的TASA作用細(xì)胞30 min后，均對(duì)細(xì)胞無明顯毒性作用，說明TASA具有成為降糖藥的良好潛質(zhì)。

圖2 TASA對(duì)L6細(xì)胞的毒性影響Fig.2 Toxic effect of TASA on L6 cells

2.3 TASA促進(jìn)L6骨骼肌細(xì)胞內(nèi)GLUT4的轉(zhuǎn)位

為進(jìn)一步探究TASA促進(jìn)L6骨骼肌細(xì)胞內(nèi)葡萄糖攝取的作用機(jī)理，利用激光共聚焦顯微鏡監(jiān)測(cè)L6-myc-GLUT4-mOrange細(xì)胞中myc-GLUT4-mOrange的熒光強(qiáng)度的動(dòng)態(tài)變化，來反映L6骨骼肌細(xì)胞中GLUT4的轉(zhuǎn)位情況。如圖3A、3B所示(Basal是指基礎(chǔ)狀態(tài)，即加藥前狀態(tài))，發(fā)現(xiàn)30 μg/mL TASA作用細(xì)胞1 min時(shí)即能顯著增加細(xì)胞膜上myc-GLUT4-mOrange熒光強(qiáng)度，且呈現(xiàn)時(shí)間依賴性，表明TASA能促進(jìn)GLUT4易位到細(xì)胞膜上，進(jìn)而促使L6骨骼肌細(xì)胞內(nèi)葡萄糖攝取。

圖3 TASA處理對(duì)L6細(xì)胞內(nèi)GLUT4的轉(zhuǎn)位(標(biāo)尺：50 μm)Fig.3 Effect of TASA treatment on translocation of GLUT4 in L6 cells (scale:50 μm)注：A.Confocal監(jiān)測(cè)L6-myc-GLUT4-mOrange細(xì)胞中myc-GLUT4-mOrange每分鐘熒光強(qiáng)度動(dòng)態(tài)變化；B.加藥處理后相對(duì)應(yīng)的熒光變化曲線。Note:A.Confocal was used to monitor the dynamic changes of fluorescence intensity per minute of myc-GLUT4-mOrange in L6-myc-GLUT4-mOrange cells;B.The corresponding fluorescence curve after the treatment of adding medicine.

2.4 TASA促進(jìn)L6骨骼肌細(xì)胞中GLUT4的蛋白表達(dá)

利用Western blot檢測(cè)TASA作用L6骨骼肌細(xì)胞后GLUT4的蛋白表達(dá)情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，加入100 nM胰島素的陽性對(duì)照組和分別加入15、30、60 μg/mL的TASA作用細(xì)胞30 min后能夠增加GLUT4的蛋白表達(dá)，且呈濃度依賴性(見圖4A、4B)。結(jié)果表明TASA能夠促進(jìn)L6細(xì)胞中GLUT4的蛋白表達(dá)水平增加。

圖4 TASA處理對(duì)L6細(xì)胞內(nèi)GLUT4蛋白表達(dá)影響Fig.4 Effect of TASA treatment on GLUT4 protein expression in L6 cells

2.5 TASA增強(qiáng)了L6骨骼肌細(xì)胞內(nèi)AMPK和PKC信號(hào)通路的磷酸化水平

體內(nèi)GLUT4細(xì)胞膜轉(zhuǎn)位受多種信號(hào)通路的影響，主要涉及磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)信號(hào)通路、腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)信號(hào)通路等。因此，本研究進(jìn)一步驗(yàn)證TASA促進(jìn)GLUT4轉(zhuǎn)位和表達(dá)是通過哪種信號(hào)通路。由蛋白磷酸化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TASA能夠增加AMPK和PKC信號(hào)通路中蛋白的磷酸化水平，且呈濃度依賴性(見圖5A、5B)，但經(jīng)TASA處理后的細(xì)胞的AKT磷酸化現(xiàn)象沒有顯著變化(見圖5C)。這些發(fā)現(xiàn)支持了TASA是通過AMPK和PKC信號(hào)通路促進(jìn)GLUT4表達(dá)和轉(zhuǎn)位。

圖5 TASA通過促進(jìn)L6細(xì)胞中AMPK和PKC信號(hào)通路的磷酸化誘導(dǎo)GLUT4表達(dá)Fig.5 TASA induced GLUT4 expression by promoting phosphorylation of AMPK and PKC signaling pathway in L6 cells注：A.100 μg/mL陽性藥二甲雙胍(MET)和不同濃度TASA處理細(xì)胞30 min后，其AMPK磷酸化水平顯著升高；B.200 nM陽性藥佛波酯(PMA)和不同濃度TASA處理細(xì)胞30 min后，其PKC磷酸化水平顯著升高；C.不同濃度TASA處理細(xì)胞30 min后，對(duì)AKT磷酸化水平無影響。Note:A.The phosphorylation level of AMPK increased significantly after 100 μg/mL positive drug Metformin (MET) and different concentrations of TASA treatment for 30 min;B.The phosphorylation level of PKC increased significantly after 200 nM positive drug PMA and different concentrations of TASA treatment for 30 min;C.The phosphorylation of AKT was not affected by different concentrations of TASA for 30 min.

3 討論與結(jié)論

2型糖尿病(T2DM)是一種復(fù)雜的慢性糖代謝紊亂疾病，其發(fā)病率一直呈上升趨勢(shì)。目前針對(duì)2型糖尿病治療的傳統(tǒng)藥物主要是二甲雙胍、胰島素、磺脲類藥物及其他口服降糖藥，而新型的降糖藥主要有胰高血糖素樣肽1(GLP-1)受體激動(dòng)劑、二肽基肽酶4抑制劑(DPP-4i)等[14]，這些藥物或多或少都存在一定的副作用。而從天然植物中提取的傳統(tǒng)藥物已被證明比現(xiàn)代藥物更經(jīng)濟(jì)，臨床療效好且副作用相對(duì)較少[15]，因此尋求相對(duì)安全的藥用植物在糖尿病的治療中已變得越來越重要。

中藥治療糖尿病的主要成分按化學(xué)結(jié)構(gòu)可分為生物堿類、多糖類、皂苷類、黃酮類等幾大類[16]。有研究表明，天然藥物生物堿類成分中具有顯著降血糖活性的異喹啉生物堿類小檗堿能增強(qiáng)胰島素誘導(dǎo)的糖攝取及GLUT4轉(zhuǎn)位，改善胰島素抵抗[17]。哌啶生物堿類胡椒堿通過激活L6細(xì)胞內(nèi)AMPK上游通路，進(jìn)而磷酸化AMPK誘導(dǎo)GLUT4轉(zhuǎn)位至質(zhì)膜[18]。苦豆子總堿是從藥用植物苦豆子中提取出的堿類，其是含有槐果堿、槐定堿、苦參堿等多種生物堿的總稱[19]，現(xiàn)有的研究表明，苦豆子總堿在抗腫瘤、抗微生物、降血壓等[20]方面起著一定藥理作用，但還鮮有關(guān)于對(duì)糖尿病研究的報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)從苦豆子地上部位提取出總堿來研究其降糖作用。

體內(nèi)GLUT4細(xì)胞膜轉(zhuǎn)位受多種信號(hào)通路的影響，影響GLUT4轉(zhuǎn)位的一個(gè)重要通路是胰島素介導(dǎo)的信號(hào)效應(yīng)通路，即胰島素可與胰島素受體(insulin receptor，IR)結(jié)合后，通過磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B，PI3K/AKT)通路調(diào)節(jié)糖原合成、葡萄糖的攝取和降解，從而發(fā)揮調(diào)節(jié)血糖的作用[21,22]。本實(shí)驗(yàn)以L6細(xì)胞為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)TASA作用細(xì)胞后的AKT磷酸化水平?jīng)]有顯著變化，說明TASA的降糖作用不影響AKT通路。骨骼肌葡萄糖攝取還可以通過胰島素非依賴性AMPK通路激活骨骼肌葡萄糖攝取和利用，其機(jī)理是AMPK被激活后，會(huì)引起TBC1D1的磷酸化，進(jìn)而上調(diào)下游信號(hào)分子GLUT4的表達(dá)，并促進(jìn)GLUT4從細(xì)胞內(nèi)向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)，增加細(xì)胞對(duì)葡萄糖的吸收和利用[23]。PKC可分為多種激酶亞型包括典型PKC(PKC-α、PKC-β、PKC-γ)，新型PKC(PKC-ε、PKC-η、PKC-θ)和非典型PKC(PKC-ζ、PKC-λ)，研究結(jié)果表明使用PKC-ζ抑制劑后，胰島素刺激下的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)受到抑制，而PKC-ζ的活化可增加葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)[24]。本實(shí)驗(yàn)通過研究TASA對(duì)細(xì)胞AMPK和PKC通路影響，發(fā)現(xiàn)AMPK和PKC磷酸化水平均升高，提示TASA可能通過激活A(yù)MPK和PKC通路來進(jìn)一步上調(diào)GLUT4表達(dá)。

綜上所述，基于GLUT4為作用靶點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)圍繞TASA對(duì)GLUT4的表達(dá)和轉(zhuǎn)位作用展開研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TASA能夠有效增加L6骨骼肌細(xì)胞內(nèi)葡萄糖的攝取和GLUT4的轉(zhuǎn)位和表達(dá)，由進(jìn)一步的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)TASA作用GLUT4的蛋白表達(dá)是通過AMPK和PKC兩種信號(hào)通路來促進(jìn)。這些結(jié)果發(fā)掘出TASA在治療糖尿病方面的潛力。然而該研究還缺乏TASA在活體水平上的相關(guān)實(shí)驗(yàn)，之后的研究將通過TASA作用于2型糖尿病小鼠模型來觀測(cè)其對(duì)活體模型的血糖及相關(guān)指標(biāo)的影響。