周 力，吳占月，張峰碩，桂林生，侯生珍

（青海大學農牧學院，西寧 810016）

肌纖維作為骨骼肌肌肉的基本構成單位，其類型及組成對肉質特性具有明顯的調控作用[1]。不同的肌纖維類型具有不同形態(tài)特征、收縮以及代謝特征[2]。根據免疫組化的方法可以將其劃分為I型（慢速氧化型）、IIA型（快速氧化型）、IIB型（快速酵解型）和IIX型（中間型肌纖維）4種類型[3]，其收縮速率大小為IIB>IIX>IIA>I[4-5]。

據報道，當氧化型肌纖維比例高時，可以改善肌肉色澤，提高嫩度，從而提高肌肉品質[6]，這在青海牦牛試驗上有過類似的報道[7]。在不同部位豬肉上也發(fā)現(xiàn)[8]，相較于含更多ⅡB型肌纖維，含有更多Ⅰ型肌纖維中血紅素鐵與高鐵肌紅蛋白含量會更高，顏色偏紅，同時具有更高的pH值與持水力。以上試驗結果均說明肌纖維特性與肉質性狀間的關系緊密，同時在不同部位間也存在一定的差異。此外，關于蘇尼特羊的研究進一步證實[9]，Ⅰ型和ⅡA型肌纖維的數(shù)量比例與MyHCⅠ、MyHCⅡA基因的表達量呈正相關，ⅡB型肌纖維的數(shù)量比例與MyHCⅡB和MyHCⅡX基因的表達量亦呈正相關，其中ⅡB型肌纖維數(shù)量比例與MyHCⅡB基因的表達量呈顯著正相關。這進一步表明肌纖維類型以及MyHCs基因的表達豐度的變化緊密相關。目前許多研究者對湖羊[10]、灘羊[11]及黑山羊[12]等肉質進行了大量的研究，但關于黑藏羊肌纖維特性和肉品質之間關系的報道極度匱乏。黑藏羊作為藏系綿羊種類中特有的品種資源[13]。其肉質是一種高蛋白、低脂肪、礦物質含量高，且肉質細嫩、味道鮮美、營養(yǎng)價值高，屬于當前人們所追求的優(yōu)質羊肉[14]。然而傳統(tǒng)放牧效率較低，不能滿足市場對畜禽產品的需求，因而對黑藏羊進行舍飼就成了一種必然的趨勢。

基于此，本研究以舍飼條件下黑藏羊背最長肌、臂三頭肌和股二頭肌作為試驗材料，通過ATP酶染色分析黑藏羊的肌纖維特性，并利用實時熒光定量聚合酶鏈式反應技術測定肌纖維MyHCs基因的mRNA表達量，旨在為黑藏羊的肉質改進提供理論支持，同時也為我國優(yōu)質地方肉羊資源的開發(fā)提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

選取20只體況良好、發(fā)育健康且平均體重為（10.28±0.43）kg的2月齡青海黑藏羊公羔，在青海貴南縣黑藏羊繁育中心進行為期128 d（預試期8 d，正試期120 d）的集中飼養(yǎng)。日糧配方參考中國《肉羊飼養(yǎng)標準》（NY/T 816-2004）進行配制[15]，每天早上08：00和下午17：30進行飼喂，自由飲水，自由采食全混合日糧（total mixed ration，TMR），全混合日糧中精料補充料和粗飼料比例為5∶5，粗飼料由燕麥青貯和燕麥青干草組成（按干物質各占1/2計）。TMR日糧營養(yǎng)成分含量見表1。

表1 TMR日糧營養(yǎng)成分含量（干物質基礎）Table 1 Dietary nutrient content of TMR （DM basis） %

1.2 樣品采集和制片

試驗結束時，選取5只黑藏羊（禁食12 h、禁水2 h）按照頸靜脈方式進行放血屠宰。立即采取左半胴體的背最長肌、臂三頭肌以及股二頭肌組織樣，沿著樣品肌纖維的方向，切成0.5 cm×0.5 cm×1 cm的肉塊，在預冷的異戊烷中脫水干燥30 s，經液氮速凍，制片時將肌肉塊放入-25℃的冰凍切片機內切片，厚度為8～10 μm。再利用ATP酶組織化學法對黑藏羊不同部位的肌肉樣品進行染色[16]。根據ATP酶染色后顏色最深（黑色）的是Ⅰ型肌纖維，顏色最淺（白色）是ⅡB型肌纖維，介于兩者顏色之間（棕褐色）是ⅡA型肌纖維的標準進行判斷。

1.3 試驗方法

1.3.1 肌纖維特性分析

試驗應用顯微鏡彩圖分析軟件（Leica Qwin v3）在20×10倍下觀察并分析肌纖維特性。每個樣本制作4張切片，每張片子隨機選擇3～5個組織完整的視野進行拍照，使總肌纖維數(shù)目大于1 500根[17]。肌纖維橫截面最長兩點距離與最短兩點距離之和的平均值，作為肌纖維直徑。圈出每個視野內面積，并統(tǒng)計出每個視野中肌纖維的根數(shù)，然后換算成每平方毫米的根數(shù)，即為被測樣本的肌纖維密度。通過多次測量視野內各型肌纖維的橫截面積，求其平均值作為肌纖維橫截面積。測出視野內不同類型肌纖維的數(shù)量，計算每種類型肌纖維的數(shù)量比例。測量每種類型肌纖維的橫截面積，求出每種類型肌纖維的面積比例。

1.3.2 MyHCs基因相對表達量測定

屠宰后，分別采集約100 mg黑藏羊背最長肌、臂三頭肌以及股二頭肌的組織樣，立即裝入無酶凍存管置于液氮中速凍。使用Trizol法提取不同部位肌肉的總RNA，經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，再通過微孔板分光光度計測定其吸光度（OD）值，對符合要求的RNA按照FastQant RT Kit（with gDNase）反轉錄試劑盒操作步驟反轉錄成cDNA。按照SYBR Prime ScriptTM RT-PCR Kit進行PCR擴增。反應體系為：1.6 μL cDNA 模板，2×SYBR Rremix ExTaq 10μL，上下游引物各0.4μL （10μmol/L），50×ROX Reference Dye 0.4 μL，加 RNase-free ddH2O 補足到20 μL。擴增后經熔解曲線檢測特異性，反應均設空白對照，每個樣品設置3個重復。選擇肌球蛋白重鏈Ⅰ（myosin heavy chainⅠ，MyHCⅠ）、肌球蛋白重鏈 ⅡA（myosin heavy chainⅡA，MyHC ⅡA）、肌球蛋白重鏈ⅡB（myosin heavy chainⅡB，MyHCⅡB）及肌球蛋白重鏈ⅡX（myosin heavy chainⅡX，MyHCⅡX）作為目的基因，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作為內參基因，引物由艾博生物技術有限公司設計合成，基因序列設計引物見表2。

表2 熒光定量PCR引物Table 2 Primer sequences used for q RT-PCR

1.4 數(shù)據處理

試驗相對定量的結果采用2-ΔΔCt法[18]進行計算，原始數(shù)據使用Microsoft Excel 2020進行初步處理，采用SPSS 25.0統(tǒng)計分析軟件中One-way ANOVA進行方差分析和顯著性檢驗，所得數(shù)據以“平均值±標準差（mean±SD）”表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 黑藏羊不同部位肌纖維的相關指標分析

肌纖維直徑分析結果如表3所示。黑藏羊背最長肌（LD）和臂三頭?。˙F）中ⅡA型、ⅡB型肌纖維直徑顯著低于股二頭?。═F）（P<0.05），而背最長?。↙D）和臂三頭?。˙F）中ⅡA型、ⅡB型肌纖維差異不明顯（P>0.05）。不同部位肌肉間Ⅰ型肌纖維直徑無顯著差異（P>0.05）。

表3 黑藏羊不同部位肌纖維直徑的比較Table 3 Comparison of muscle fiber diameter in different parts of black Tibetan sheep μm

肌纖維橫截面積分析結果如表4所示。黑藏羊股二頭?。═F）中Ⅰ型、ⅡA型、ⅡB型肌纖維橫截面積顯著高于背最長?。↙D）（P<0.05），但與臂三頭?。˙F）中Ⅰ型、ⅡA型和ⅡB型肌纖維橫截面積差異不顯著（P>0.05）。

表4 黑藏羊不同部位肌纖維橫截面積的比較Table 4 Comparison of cross-sectional areas of muscle fibers in different parts of black Tibetan sheep μm2

肌纖維密度分析結果如表5所示。黑藏羊Ⅰ型、ⅡA型和ⅡB型肌纖維密度表現(xiàn)為：背最長肌（LD）>臂三頭?。˙F）>股二頭?。═F），但都差異不顯著（P>0.05）。

表5 黑藏羊不同部位肌纖維密度的比較Table 5 Comparison of muscle fiber density in different parts of black Tibetan sheep N·μm-2

肌纖維數(shù)量比例分析結果如表6所示。背最長肌（LD）中Ⅰ型肌纖維數(shù)量比例為12.55%，分別比臂三頭?。˙F）、股二頭?。═F）高出了0.21%和0.63%，但各組間都差異不顯著（P>0.05）。股二頭肌（TF）中ⅡA型肌纖維數(shù)量比例顯著低于背最長?。↙D）（P<0.05），較臂三頭?。˙F）差異不顯著（P>0.05）。不同部位肌肉間ⅡB型肌纖維數(shù)量比例差異不顯著（P>0.05）。

表6 黑藏羊不同部位肌纖維數(shù)量比例Table 6 Muscle fiber quantity proportion of black Tibetan sheep in different parts %

肌纖維面積比例分析結果如表7所示。黑藏羊Ⅰ型肌纖維面積比例以背最長?。↙D）中最高，分別比臂三頭肌 （BF）和股二頭?。═F）高于1.64%、2.48%，其中背最長?。↙D）與股二頭肌（TF）差異顯著（P<0.05）。不同部位肌肉間ⅡA型和ⅡB型肌纖維面積比例差異不顯著（P>0.05）。

表7 黑藏羊不同部位肌纖維面積比例Table 7 Muscle fiber area ratio of black Tibetan sheep in different parts %

2 黑藏羊不同部位肌肉相關基因的表達

不同部位肌肉中MyHCs基因的表達量結果如圖1所示。背最長肌MyHCⅡA基因的表達量高于臂三頭肌、股二頭肌，其中背最長肌與股二頭肌間差異顯著（P<0.05）。MyHCⅡB和MyHCⅡX基因的表達量表現(xiàn)為背最長肌<臂三頭肌<股二頭肌（P>0.05），而MyHCⅠ基因的表達量則相反（P>0.05）。由此可見，黑藏羊MyHCⅡA基因的表達量在不同部位肌肉中存在較大差異。

圖1 黑藏羊不同部位肌肉中MyHCs基因的表達量（n=5）Figure 1 Expression of MyHCs gene in different parts of black Tibetan sheep

3 討論

肌纖維類型組成與其肉質性狀密切相關[19]。影響骨骼肌中肌纖維組織學特性的因素有許多，如年齡、品種、性別、激素、活動量以及飼糧類型等，其中部位也是一個重要方面[20]。諸多試驗研究證實，不同部位肌肉中肌纖維類型組成通常存在較大的差異[21-23]。因此，若能了解動物肌肉中肌纖維類型分布規(guī)律對于研究機體生長、發(fā)育、代謝以及肉質特性均具有重要的意義[24]。在豬上研究表明[25]，肌肉的嫩度、色澤與Ⅰ型和ⅡA型肌纖維比例呈正相關，但與ⅡB型肌纖維比例呈負相關。在西門塔爾公牛上試驗發(fā)現(xiàn)[26]，肌纖維特性影響肉品質，特別是肌肉的質構特性，提高Ⅰ型纖維比例和降低ⅡB型纖維比例能夠改善肉質嫩度。侯艷茹等[27]曾報道稱，與舍飼相比，放牧飼養(yǎng)能夠通過提高AMPKα2的mRNA相對表達量，增強機體線粒體生物合成水平和氧化代謝能力，促使肌纖維類型由酵解型（ⅡB型+ⅡX型）向氧化型（Ⅰ型+ⅡA型）轉化，繼而改善肌肉品質。本研究利用ATPase堿孵育法對黑藏羊不同部位肌肉肌纖維類型組成進行分析，結果發(fā)現(xiàn)在不同部位肌肉中均檢測到Ⅰ、ⅡA和ⅡB 3種肌纖維類型，背最長肌氧化型肌纖維數(shù)量比例>臂三頭肌氧化型肌纖維數(shù)量比例>股二頭肌氧化型肌纖維數(shù)量比例，這與上述人員研究結果基本類似。說明肌肉中氧化性肌纖維所占比例越高，肌肉品質越好，而酵解型肌纖維則相反。

肌纖維類型轉化與MyHCs基因表達對肉品質的調控具有重要作用[28]。尹麗卿等[29]試驗表明，蘇尼特羊背最長肌、股二頭肌及臂三頭肌的MyHCⅠ基因表達量與剪切力值均呈負相關，而MyHCⅡB和MyHCⅡX基因表達量與剪切力值呈正相關，MyHC-ⅡA基因表達量和a*值呈顯著正相關。侯普馨等[30]進一步證實，MyHCⅠ和MyHCⅡA基因mRNA相對表達量均與Ⅰ型和ⅡA型肌纖維數(shù)量比例和面積比例呈正相關；MyHCⅡB基因和MyHCⅡX基因mRNA相對表達量均與ⅡB型肌纖維的數(shù)量比例和面積比例呈正相關。由此可知，MyHCs基因表達量與ATPase組織化學染色法對肌纖維的分型結果基本都是一致的。而本試驗通過RT-qPCR技術對與黑藏羊肌纖維中MyHCs的基因表達量進行檢測，發(fā)現(xiàn)背最長肌MyHCⅡA基因的表達量高于臂三頭肌、股二頭肌，其中背最長肌與股二頭肌間差異明顯。表明不同部位肌肉中MyHCs基因表達水平存在一定的差異性。提示黑藏羊的肌纖維特性可以作為衡量不同肌肉部位品質的重要指標，如何提高不同部位肌肉中氧化性（Ⅰ型+ⅡA型）肌纖維的所占比例來改善羊肉品質是團隊未來研究的重要方向。

4 結論

綜述，在相同舍飼條件下，黑藏羊不同部位的肌纖維組織特性存在較大的差異，整體考慮，黑藏羊背最長肌的肉質最好，其次是臂三頭肌，最后為股二頭肌。這為今后肉塊分割增值技術和等級評價體系的建立提供理論依據。