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        黑藏羊不同部位肌纖維組織學(xué)特征的差異分析

        2022-01-05 11:00:14吳占月張峰碩桂林生侯生珍
        關(guān)鍵詞:二頭肌肌纖維B型

        周 力,吳占月,張峰碩,桂林生,侯生珍

        (青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院,西寧 810016)

        肌纖維作為骨骼肌肌肉的基本構(gòu)成單位,其類型及組成對肉質(zhì)特性具有明顯的調(diào)控作用[1]。不同的肌纖維類型具有不同形態(tài)特征、收縮以及代謝特征[2]。根據(jù)免疫組化的方法可以將其劃分為I型(慢速氧化型)、IIA型(快速氧化型)、IIB型(快速酵解型)和IIX型(中間型肌纖維)4種類型[3],其收縮速率大小為IIB>IIX>IIA>I[4-5]。

        據(jù)報道,當(dāng)氧化型肌纖維比例高時,可以改善肌肉色澤,提高嫩度,從而提高肌肉品質(zhì)[6],這在青海牦牛試驗上有過類似的報道[7]。在不同部位豬肉上也發(fā)現(xiàn)[8],相較于含更多ⅡB型肌纖維,含有更多Ⅰ型肌纖維中血紅素鐵與高鐵肌紅蛋白含量會更高,顏色偏紅,同時具有更高的pH值與持水力。以上試驗結(jié)果均說明肌纖維特性與肉質(zhì)性狀間的關(guān)系緊密,同時在不同部位間也存在一定的差異。此外,關(guān)于蘇尼特羊的研究進(jìn)一步證實[9],Ⅰ型和ⅡA型肌纖維的數(shù)量比例與MyHCⅠ、MyHCⅡA基因的表達(dá)量呈正相關(guān),ⅡB型肌纖維的數(shù)量比例與MyHCⅡB和MyHCⅡX基因的表達(dá)量亦呈正相關(guān),其中ⅡB型肌纖維數(shù)量比例與MyHCⅡB基因的表達(dá)量呈顯著正相關(guān)。這進(jìn)一步表明肌纖維類型以及MyHCs基因的表達(dá)豐度的變化緊密相關(guān)。目前許多研究者對湖羊[10]、灘羊[11]及黑山羊[12]等肉質(zhì)進(jìn)行了大量的研究,但關(guān)于黑藏羊肌纖維特性和肉品質(zhì)之間關(guān)系的報道極度匱乏。黑藏羊作為藏系綿羊種類中特有的品種資源[13]。其肉質(zhì)是一種高蛋白、低脂肪、礦物質(zhì)含量高,且肉質(zhì)細(xì)嫩、味道鮮美、營養(yǎng)價值高,屬于當(dāng)前人們所追求的優(yōu)質(zhì)羊肉[14]。然而傳統(tǒng)放牧效率較低,不能滿足市場對畜禽產(chǎn)品的需求,因而對黑藏羊進(jìn)行舍飼就成了一種必然的趨勢。

        基于此,本研究以舍飼條件下黑藏羊背最長肌、臂三頭肌和股二頭肌作為試驗材料,通過ATP酶染色分析黑藏羊的肌纖維特性,并利用實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)測定肌纖維MyHCs基因的mRNA表達(dá)量,旨在為黑藏羊的肉質(zhì)改進(jìn)提供理論支持,同時也為我國優(yōu)質(zhì)地方肉羊資源的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 試驗設(shè)計

        選取20只體況良好、發(fā)育健康且平均體重為(10.28±0.43)kg的2月齡青海黑藏羊公羔,在青海貴南縣黑藏羊繁育中心進(jìn)行為期128 d(預(yù)試期8 d,正試期120 d)的集中飼養(yǎng)。日糧配方參考中國《肉羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T 816-2004)進(jìn)行配制[15],每天早上08:00和下午17:30進(jìn)行飼喂,自由飲水,自由采食全混合日糧(total mixed ration,TMR),全混合日糧中精料補充料和粗飼料比例為5∶5,粗飼料由燕麥青貯和燕麥青干草組成(按干物質(zhì)各占1/2計)。TMR日糧營養(yǎng)成分含量見表1。

        表1 TMR日糧營養(yǎng)成分含量(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 Dietary nutrient content of TMR (DM basis) %

        1.2 樣品采集和制片

        試驗結(jié)束時,選取5只黑藏羊(禁食12 h、禁水2 h)按照頸靜脈方式進(jìn)行放血屠宰。立即采取左半胴體的背最長肌、臂三頭肌以及股二頭肌組織樣,沿著樣品肌纖維的方向,切成0.5 cm×0.5 cm×1 cm的肉塊,在預(yù)冷的異戊烷中脫水干燥30 s,經(jīng)液氮速凍,制片時將肌肉塊放入-25℃的冰凍切片機內(nèi)切片,厚度為8~10 μm。再利用ATP酶組織化學(xué)法對黑藏羊不同部位的肌肉樣品進(jìn)行染色[16]。根據(jù)ATP酶染色后顏色最深(黑色)的是Ⅰ型肌纖維,顏色最淺(白色)是ⅡB型肌纖維,介于兩者顏色之間(棕褐色)是ⅡA型肌纖維的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷。

        1.3 試驗方法

        1.3.1 肌纖維特性分析

        試驗應(yīng)用顯微鏡彩圖分析軟件(Leica Qwin v3)在20×10倍下觀察并分析肌纖維特性。每個樣本制作4張切片,每張片子隨機選擇3~5個組織完整的視野進(jìn)行拍照,使總肌纖維數(shù)目大于1 500根[17]。肌纖維橫截面最長兩點距離與最短兩點距離之和的平均值,作為肌纖維直徑。圈出每個視野內(nèi)面積,并統(tǒng)計出每個視野中肌纖維的根數(shù),然后換算成每平方毫米的根數(shù),即為被測樣本的肌纖維密度。通過多次測量視野內(nèi)各型肌纖維的橫截面積,求其平均值作為肌纖維橫截面積。測出視野內(nèi)不同類型肌纖維的數(shù)量,計算每種類型肌纖維的數(shù)量比例。測量每種類型肌纖維的橫截面積,求出每種類型肌纖維的面積比例。

        1.3.2 MyHCs基因相對表達(dá)量測定

        屠宰后,分別采集約100 mg黑藏羊背最長肌、臂三頭肌以及股二頭肌的組織樣,立即裝入無酶凍存管置于液氮中速凍。使用Trizol法提取不同部位肌肉的總RNA,經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性,再通過微孔板分光光度計測定其吸光度(OD)值,對符合要求的RNA按照FastQant RT Kit(with gDNase)反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟反轉(zhuǎn)錄成cDNA。按照SYBR Prime ScriptTM RT-PCR Kit進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為:1.6 μL cDNA 模板,2×SYBR Rremix ExTaq 10μL,上下游引物各0.4μL (10μmol/L),50×ROX Reference Dye 0.4 μL,加 RNase-free ddH2O 補足到20 μL。擴(kuò)增后經(jīng)熔解曲線檢測特異性,反應(yīng)均設(shè)空白對照,每個樣品設(shè)置3個重復(fù)。選擇肌球蛋白重鏈Ⅰ(myosin heavy chainⅠ,MyHCⅠ)、肌球蛋白重鏈 ⅡA(myosin heavy chainⅡA,MyHC ⅡA)、肌球蛋白重鏈ⅡB(myosin heavy chainⅡB,MyHCⅡB)及肌球蛋白重鏈ⅡX(myosin heavy chainⅡX,MyHCⅡX)作為目的基因,以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)作為內(nèi)參基因,引物由艾博生物技術(shù)有限公司設(shè)計合成,基因序列設(shè)計引物見表2。

        表2 熒光定量PCR引物Table 2 Primer sequences used for q RT-PCR

        1.4 數(shù)據(jù)處理

        試驗相對定量的結(jié)果采用2-ΔΔCt法[18]進(jìn)行計算,原始數(shù)據(jù)使用Microsoft Excel 2020進(jìn)行初步處理,采用SPSS 25.0統(tǒng)計分析軟件中One-way ANOVA進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗,所得數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)”表示,P<0.05表示差異顯著。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 黑藏羊不同部位肌纖維的相關(guān)指標(biāo)分析

        肌纖維直徑分析結(jié)果如表3所示。黑藏羊背最長?。↙D)和臂三頭?。˙F)中ⅡA型、ⅡB型肌纖維直徑顯著低于股二頭?。═F)(P<0.05),而背最長?。↙D)和臂三頭肌(BF)中ⅡA型、ⅡB型肌纖維差異不明顯(P>0.05)。不同部位肌肉間Ⅰ型肌纖維直徑無顯著差異(P>0.05)。

        表3 黑藏羊不同部位肌纖維直徑的比較Table 3 Comparison of muscle fiber diameter in different parts of black Tibetan sheep μm

        肌纖維橫截面積分析結(jié)果如表4所示。黑藏羊股二頭?。═F)中Ⅰ型、ⅡA型、ⅡB型肌纖維橫截面積顯著高于背最長?。↙D)(P<0.05),但與臂三頭肌(BF)中Ⅰ型、ⅡA型和ⅡB型肌纖維橫截面積差異不顯著(P>0.05)。

        表4 黑藏羊不同部位肌纖維橫截面積的比較Table 4 Comparison of cross-sectional areas of muscle fibers in different parts of black Tibetan sheep μm2

        肌纖維密度分析結(jié)果如表5所示。黑藏羊Ⅰ型、ⅡA型和ⅡB型肌纖維密度表現(xiàn)為:背最長?。↙D)>臂三頭肌(BF)>股二頭?。═F),但都差異不顯著(P>0.05)。

        表5 黑藏羊不同部位肌纖維密度的比較Table 5 Comparison of muscle fiber density in different parts of black Tibetan sheep N·μm-2

        肌纖維數(shù)量比例分析結(jié)果如表6所示。背最長肌(LD)中Ⅰ型肌纖維數(shù)量比例為12.55%,分別比臂三頭肌(BF)、股二頭肌(TF)高出了0.21%和0.63%,但各組間都差異不顯著(P>0.05)。股二頭?。═F)中ⅡA型肌纖維數(shù)量比例顯著低于背最長肌(LD)(P<0.05),較臂三頭?。˙F)差異不顯著(P>0.05)。不同部位肌肉間ⅡB型肌纖維數(shù)量比例差異不顯著(P>0.05)。

        表6 黑藏羊不同部位肌纖維數(shù)量比例Table 6 Muscle fiber quantity proportion of black Tibetan sheep in different parts %

        肌纖維面積比例分析結(jié)果如表7所示。黑藏羊Ⅰ型肌纖維面積比例以背最長?。↙D)中最高,分別比臂三頭肌 (BF)和股二頭?。═F)高于1.64%、2.48%,其中背最長?。↙D)與股二頭肌(TF)差異顯著(P<0.05)。不同部位肌肉間ⅡA型和ⅡB型肌纖維面積比例差異不顯著(P>0.05)。

        表7 黑藏羊不同部位肌纖維面積比例Table 7 Muscle fiber area ratio of black Tibetan sheep in different parts %

        2 黑藏羊不同部位肌肉相關(guān)基因的表達(dá)

        不同部位肌肉中MyHCs基因的表達(dá)量結(jié)果如圖1所示。背最長肌MyHCⅡA基因的表達(dá)量高于臂三頭肌、股二頭肌,其中背最長肌與股二頭肌間差異顯著(P<0.05)。MyHCⅡB和MyHCⅡX基因的表達(dá)量表現(xiàn)為背最長肌<臂三頭肌<股二頭?。≒>0.05),而MyHCⅠ基因的表達(dá)量則相反(P>0.05)。由此可見,黑藏羊MyHCⅡA基因的表達(dá)量在不同部位肌肉中存在較大差異。

        圖1 黑藏羊不同部位肌肉中MyHCs基因的表達(dá)量(n=5)Figure 1 Expression of MyHCs gene in different parts of black Tibetan sheep

        3 討論

        肌纖維類型組成與其肉質(zhì)性狀密切相關(guān)[19]。影響骨骼肌中肌纖維組織學(xué)特性的因素有許多,如年齡、品種、性別、激素、活動量以及飼糧類型等,其中部位也是一個重要方面[20]。諸多試驗研究證實,不同部位肌肉中肌纖維類型組成通常存在較大的差異[21-23]。因此,若能了解動物肌肉中肌纖維類型分布規(guī)律對于研究機體生長、發(fā)育、代謝以及肉質(zhì)特性均具有重要的意義[24]。在豬上研究表明[25],肌肉的嫩度、色澤與Ⅰ型和ⅡA型肌纖維比例呈正相關(guān),但與ⅡB型肌纖維比例呈負(fù)相關(guān)。在西門塔爾公牛上試驗發(fā)現(xiàn)[26],肌纖維特性影響肉品質(zhì),特別是肌肉的質(zhì)構(gòu)特性,提高Ⅰ型纖維比例和降低ⅡB型纖維比例能夠改善肉質(zhì)嫩度。侯艷茹等[27]曾報道稱,與舍飼相比,放牧飼養(yǎng)能夠通過提高AMPKα2的mRNA相對表達(dá)量,增強機體線粒體生物合成水平和氧化代謝能力,促使肌纖維類型由酵解型(ⅡB型+ⅡX型)向氧化型(Ⅰ型+ⅡA型)轉(zhuǎn)化,繼而改善肌肉品質(zhì)。本研究利用ATPase堿孵育法對黑藏羊不同部位肌肉肌纖維類型組成進(jìn)行分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在不同部位肌肉中均檢測到Ⅰ、ⅡA和ⅡB 3種肌纖維類型,背最長肌氧化型肌纖維數(shù)量比例>臂三頭肌氧化型肌纖維數(shù)量比例>股二頭肌氧化型肌纖維數(shù)量比例,這與上述人員研究結(jié)果基本類似。說明肌肉中氧化性肌纖維所占比例越高,肌肉品質(zhì)越好,而酵解型肌纖維則相反。

        肌纖維類型轉(zhuǎn)化與MyHCs基因表達(dá)對肉品質(zhì)的調(diào)控具有重要作用[28]。尹麗卿等[29]試驗表明,蘇尼特羊背最長肌、股二頭肌及臂三頭肌的MyHCⅠ基因表達(dá)量與剪切力值均呈負(fù)相關(guān),而MyHCⅡB和MyHCⅡX基因表達(dá)量與剪切力值呈正相關(guān),MyHC-ⅡA基因表達(dá)量和a*值呈顯著正相關(guān)。侯普馨等[30]進(jìn)一步證實,MyHCⅠ和MyHCⅡA基因mRNA相對表達(dá)量均與Ⅰ型和ⅡA型肌纖維數(shù)量比例和面積比例呈正相關(guān);MyHCⅡB基因和MyHCⅡX基因mRNA相對表達(dá)量均與ⅡB型肌纖維的數(shù)量比例和面積比例呈正相關(guān)。由此可知,MyHCs基因表達(dá)量與ATPase組織化學(xué)染色法對肌纖維的分型結(jié)果基本都是一致的。而本試驗通過RT-qPCR技術(shù)對與黑藏羊肌纖維中MyHCs的基因表達(dá)量進(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)背最長肌MyHCⅡA基因的表達(dá)量高于臂三頭肌、股二頭肌,其中背最長肌與股二頭肌間差異明顯。表明不同部位肌肉中MyHCs基因表達(dá)水平存在一定的差異性。提示黑藏羊的肌纖維特性可以作為衡量不同肌肉部位品質(zhì)的重要指標(biāo),如何提高不同部位肌肉中氧化性(Ⅰ型+ⅡA型)肌纖維的所占比例來改善羊肉品質(zhì)是團(tuán)隊未來研究的重要方向。

        4 結(jié)論

        綜述,在相同舍飼條件下,黑藏羊不同部位的肌纖維組織特性存在較大的差異,整體考慮,黑藏羊背最長肌的肉質(zhì)最好,其次是臂三頭肌,最后為股二頭肌。這為今后肉塊分割增值技術(shù)和等級評價體系的建立提供理論依據(jù)。

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