竭 航，趙春容，諶穎蓮，趙貴軍，張承露，封孝蘭，曾德軍*

（1.重慶市藥物種植研究所/特色生物資源研究與利用川渝共建重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 408435；2.陸軍軍醫(yī)大學(xué)，重慶 400038）

麝鼠（Ondatra zibethicus）又名青根貂，因其繁殖期成年雄性個(gè)體的香腺中的分泌物麝鼠香（Muskrat musk）含有類似麝香的特性和成分，為麝香最佳替代原料。麝鼠香中的主要成分包括環(huán)酮類（如麝香酮、降麝香酮）、烷類、酯類、醛類和有機(jī)酸類等[1-3]，其中麝香酮含量為2%左右。研究表明麝鼠香具有與天然麝香類似的藥理作用[4]，能起到抗炎鎮(zhèn)痛[5]、增強(qiáng)心臟功能和降低血液黏稠度[6]、改善心肌缺血和保護(hù)心臟缺血性損傷等作用[7-9]。我國對(duì)麝鼠的研究有十多年的時(shí)間，但養(yǎng)殖規(guī)模小、數(shù)量少，還屬初級(jí)階段。麝鼠在非繁殖季節(jié)的秋冬季節(jié)不分泌麝鼠香，每只成年雄性麝鼠每年只能產(chǎn)麝鼠香5～6 g，麝鼠香就顯得尤為珍貴。因此亟待尋找提高麝鼠產(chǎn)香量的新途徑，以滿足市場(chǎng)的需求。

隨著細(xì)胞工程學(xué)的發(fā)展，前人在麝鼠香腺細(xì)胞離體分泌麝鼠香方面做了初步嘗試[10]。研究表明，體外細(xì)胞分泌的麝鼠香與自然分泌的麝鼠香均含有環(huán)酮類、烷類、酯類、醛類和有機(jī)酸類成分[3]。這表明采用細(xì)胞工程方法生產(chǎn)人工麝鼠香是可能的。我們已通過轉(zhuǎn)染的方法獲得了永生化的麝鼠香腺成纖維細(xì)胞（申報(bào)專利正在實(shí)審中，申請(qǐng)?zhí)枺?02110034354.8），解決了麝鼠香腺細(xì)胞在體外最多培養(yǎng)6代即發(fā)生凋亡的難題，鑒于生物體中各成分直接或間接由細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)控，因此，探究永生化過程對(duì)麝鼠香腺成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的影響有重要作用。

本研究在獲得了永生化麝鼠香腺成纖維細(xì)胞的基礎(chǔ)上，擬采用RNA-seq方法對(duì)永生化前后細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，為開展麝鼠香腺發(fā)育、泌香調(diào)控及香腺生物反應(yīng)器等能促進(jìn)麝鼠香增產(chǎn)的科學(xué)研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

麝鼠來自重慶市藥物種植研究所麝鼠養(yǎng)殖基地，在2020年8月麝鼠泌香盛期，挑選成年健康麝鼠（1.2歲，體重1.6 kg）。麝鼠經(jīng)乙醚吸入麻醉，立刻無菌采集香腺，置含100 U/mL青鏈霉素的PBS中帶回實(shí)驗(yàn)室備用。

1.2 樣品采集

采用常規(guī)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)法獲得麝鼠香腺原代成纖維細(xì)胞，分別收集一部分原代細(xì)胞，置1 mL Trizol中用于提取總RNA，另一部分原代細(xì)胞通過改進(jìn)的慢病毒轉(zhuǎn)染法獲得永生化的麝鼠成纖維細(xì)胞。同樣的方法收集一部分永生化的麝鼠香腺成纖維細(xì)胞，分別置1 mL Trizol中用于提取總RNA。

1.3 總RNA提取及質(zhì)量控制

采用Trizol法提取永生化及非永生化麝鼠細(xì)胞總RNA，然后用Agilent 2100 bioanalyzer對(duì)RNA的完整性進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 文庫構(gòu)建與質(zhì)檢

首先通過Oligo（dT）磁珠富集帶有polyA尾的mRNA，隨后在 Fragmentation Buffer中用二價(jià)陽離子將得到的mRNA隨機(jī)打斷。以片段化的mRNA為模版，隨機(jī)寡核苷酸為引物合成cDNA第二條鏈。用AMPure XP beads篩選370～420 bp的cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得文庫。文庫構(gòu)建完成后，使用Qubit2.0 Fluorometer進(jìn)行初步定量，稀釋文庫至1.5 ng/μL，隨后使用Agilent 2100 bioanalyzer對(duì)文庫的insert size進(jìn)行檢測(cè)，q-PCR對(duì)文庫有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量，以保證文庫質(zhì)量。

1.5 測(cè)序

將已質(zhì)檢的cDNA文庫送樣至北京諾禾致源生物科技有限公司進(jìn)行二代測(cè)序，采用Illumina 2500PE測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.6 數(shù)據(jù)分析

1.6.1 RAW READS質(zhì)量控制分析

為了保證數(shù)據(jù)分析的質(zhì)量及可靠性，去除原始數(shù)據(jù)中帶接頭、含N和Qphred≤20堿基數(shù)占整個(gè)read長(zhǎng)度的50%以上的低質(zhì)量reads。同時(shí)，對(duì)clean data進(jìn)行 Q20、Q30和 GC含量計(jì)算。

1.6.2 序列的組裝及基因注釋

由于目前尚無可參考的麝鼠全基因組序列，故本研究采用Trinity（v20140717）軟件進(jìn)行重頭組裝[11]。

1.6.3 基因注釋

對(duì)Unigene結(jié)果進(jìn)行基因功能注釋，所涉及數(shù)據(jù)庫包括Nr（NCBI官方的蛋白序列數(shù)據(jù)庫）、Nt（NCBI官方的核酸序列數(shù)據(jù)庫）、Pfam（最全面的蛋白結(jié)構(gòu)域注釋的分類系統(tǒng)）、KOG/COG、Swiss-prot、KEGG和GO等數(shù)據(jù)庫。

1.6.4 差異基因分析

使用DESeq2包（v1.20.0）進(jìn)行兩組的差異表達(dá)分析[12]。采用 GOseq（2.10.0）[13]和 KOBAS（v2.0.12）[14]軟件對(duì)差異基因集進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。差異表達(dá)基因的PPI分析基于已知和預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的STRING數(shù)據(jù)庫。對(duì)于數(shù)據(jù)庫中存在的物種，我們通過從數(shù)據(jù)庫中提取目標(biāo)基因列表來構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)；否則，使用diamond（0.9.13）將目標(biāo)基因序列與選擇的參考蛋白序列進(jìn)行比對(duì)，然后根據(jù)所選參考物種的已知相互作用建立網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果

經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染后，經(jīng)連續(xù)傳20余代后，細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，形態(tài)與非永生化時(shí)一致（圖1）。

圖1 麝鼠香腺成纖維細(xì)胞永生化前后對(duì)比圖Figure 1 Immortalized and normal muskrat scent gland fibroblasts

2.2 轉(zhuǎn)錄測(cè)序與基因組裝

6樣品序列凈讀序列保持一致，為6.64 G～7.24 G，堿基錯(cuò)誤率為0.02%，Phred數(shù)值大于20和30的堿基占比為95%以上，GC含量為52.21%～54.96%，這表明測(cè)序質(zhì)量可靠可進(jìn)行下一步分析。

用Trinity軟件對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行基因組裝，通過序列比對(duì)匯聚選擇同一基因中最長(zhǎng)的一條轉(zhuǎn)錄本為Unigene，總共發(fā)現(xiàn)基因數(shù)目為62 152個(gè)。

2.3 基因功能注釋

通過利用序列比對(duì)的方法，以NR、NT、KO、Swiss Prot、PFAM、GO和KOG數(shù)據(jù)庫為參考對(duì)Unigene進(jìn)行注釋，總共有44 406個(gè)unigenes被注釋到，其中置信度較高的Genbank蛋白數(shù)據(jù)庫NR注釋到21 262個(gè)，占比34.2%。

通過進(jìn)一步對(duì)有注釋的基因進(jìn)行GO、KOG和KEGG富集分析結(jié)果顯示，在GO富集結(jié)果中，基因主要聚集在基本的細(xì)胞代謝、細(xì)胞生物學(xué)調(diào)控、蛋白結(jié)合和酶催化等基因的細(xì)胞基礎(chǔ)代謝活動(dòng)；在KOG富集中，也包含細(xì)胞正?；顒?dòng)代謝的各類過程，其中以信號(hào)傳導(dǎo)過程富集數(shù)量占比最多；同樣在KEGG中，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)占比最高，同時(shí)含有細(xì)胞正常代謝活動(dòng)的各種生物學(xué)通路。

2.4 差異表達(dá)基因分析

對(duì)永生化麝鼠細(xì)胞和原代麝鼠細(xì)胞表達(dá)差異基因（表達(dá)差異兩倍以上且校正P值顯著，）及富集通路進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，永生化麝鼠細(xì)胞和原代麝鼠細(xì)胞表達(dá)差異的基因總共有8 690個(gè)，其中在永生化麝鼠細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)的基因有3 414個(gè)，表達(dá)下調(diào)的基因有5 276個(gè)（如圖2所示）。

圖2 表達(dá)差異基因火山圖Figure 2 Volcano plot of different expressional genes

2.5 差異表達(dá)基因功能預(yù)測(cè)

進(jìn)一步對(duì)差異基因進(jìn)行KEGG通路富集分析，結(jié)果顯示在永生化麝鼠細(xì)胞中上調(diào)的基因主要富集于DNA復(fù)制、同源重組、錯(cuò)配修復(fù)、細(xì)胞周期和RNA代謝通路，下調(diào)基因主要富集于氧化磷酸化、帕金森病和阿爾茨海默病疾病通路中（圖3）；表達(dá)差異基因富集的KEGG信號(hào)通路列于表1；表達(dá)差異基因GO富集通路前20列于表2，主要涉及趨化因子活動(dòng)、固醇類和激素代謝途徑。

圖3 表達(dá)差異基因通路富集Figure 3 Differental expressional gene pathway enrichment

表1 表達(dá)差異基因KEGG通路富集情況Table 1 KEGG pathway enrichment of differential expressional genes

表2 表達(dá)差異基因GO通路富集情況Table 2 GO pathway enrichment of differential expressional genes

3 討論與結(jié)論

麝香是享譽(yù)國內(nèi)外的珍稀中藥材，具有極高的藥用價(jià)值[15]，麝鼠香的開發(fā)已成為麝香替代的重點(diǎn)[1-3]。研究表明，基因的表達(dá)與泌香階段密切相關(guān)[16-17]，鑒于麝鼠泌香由香腺中的分泌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞共同完成[18-19]，開展麝鼠香腺細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組研究，找到相關(guān)差異表達(dá)基因?qū)Τ霰M麝鼠體外細(xì)胞培養(yǎng)泌香具有重要的理論支撐作用。

細(xì)胞永生化是指在體外培養(yǎng)過程中，由于自身基因變化或者外界理化生條件的刺激，避免了正常細(xì)胞的衰老死亡，可以無限分裂傳代的過程[20]。研究表明，奶牛乳腺上皮細(xì)胞永生化后在mRNA水平和表達(dá)及蛋白分泌方面依然能夠維持與原代細(xì)胞類似的功能[21]。但李嘉嘉[22]的發(fā)現(xiàn)小鼠脾臟原代網(wǎng)狀成纖維細(xì)胞永生化后2 815個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，3 099個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。本研究中麝鼠原代香腺細(xì)胞永生化前后表達(dá)上調(diào)的基因有3 414個(gè)，下調(diào)的基因有5 276個(gè)，趨勢(shì)與李嘉嘉[20]的結(jié)果類似，說明通過病毒感染的永生化對(duì)麝鼠原代細(xì)胞基因的影響較大。對(duì)本研究差異表達(dá)基因的KEGG預(yù)測(cè)結(jié)果表明，上調(diào)的基因主要富集于DNA復(fù)制、同源重組、錯(cuò)配修復(fù)、細(xì)胞周期和RNA代謝通路，與李嘉嘉[22]的結(jié)果類似。鑒于永生化后細(xì)胞在增殖傳代方面與原代細(xì)胞差異較大，而KEGG功能預(yù)測(cè)結(jié)果上調(diào)的基因主要富集于細(xì)胞增殖及核酸代謝，這與細(xì)胞永生化過程相符。這暗示麝鼠成纖維細(xì)胞增殖等通路可能與細(xì)胞永生化有關(guān)，為開展永生化過程如何影響麝鼠香腺細(xì)胞泌香功能的研究提供重要參考。

綜上，通過病毒感染的永生化對(duì)麝鼠原代細(xì)胞基因的影響較大，可為后續(xù)建立永生化香腺細(xì)胞體外泌香體系提供支撐。