孔慶博，楊 帥，王小菊，李佳佳，羅思源，丁春邦，周莉君

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川雅安 625014）

近年來(lái)，濫用化學(xué)除草劑使得很多雜草產(chǎn)生耐藥性，同時(shí)也造成了環(huán)境污染和人畜健康隱患[1]。研究發(fā)現(xiàn)，苘麻（Abutilon theophrasti）、萬(wàn)壽菊（Tagetes erecta）和豬毛蒿（Artemisia scoparia）的精油及其化學(xué)成分對(duì)種子發(fā)芽和幼苗生長(zhǎng)有強(qiáng)烈的化感作用[2-5]。利用植物化感作用代替化學(xué)合成除草劑是一個(gè)新的思路，因?yàn)樗影踩h(huán)保、高效且易降解。

化感作用是植物與其他生物之間產(chǎn)生次生物質(zhì)相互影響的一種現(xiàn)象[6]。產(chǎn)生化感作用的次生物質(zhì)被稱為化感物質(zhì)[7]。在自然狀況下化感物質(zhì)以自然揮發(fā)、雨淋液、根系分泌物以及枯枝落葉的分解等方式釋放[8-10]。尤其在桉樹(shù)林中化感作用普遍存在[11]。研究曾報(bào)道赤桉（Eucalyptus camaldensis）、檸檬桉（Eucalyptus citriodora）、藍(lán)桉（Eucalyptus globulus）和尾葉桉（Eucalyptus urophylla）等多種桉樹(shù)水浸液及精油的化學(xué)成分具有抑制桉樹(shù)林下植物種子的發(fā)芽及幼苗生長(zhǎng)的作用[12-16]。通過(guò)對(duì)植物間的化感作用研究，可進(jìn)一步揭示植物種群、群落和生態(tài)系統(tǒng)的時(shí)空分布，對(duì)指導(dǎo)農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)規(guī)劃有著重要的意義[17-18]。

巨尾桉（Eucalyptus grandis× E.urophylla）是桃金娘科（Myrtaceae）桉樹(shù)屬（Eucalyptus）人工授粉的雜交種，其雜交優(yōu)勢(shì)突出，已經(jīng)成為我國(guó)桉樹(shù)人工造林的主導(dǎo)品種。目前國(guó)內(nèi)對(duì)巨尾桉的利用主要集中于經(jīng)營(yíng)性木材加工，文獻(xiàn)報(bào)道了巨尾桉樹(shù)葉、樹(shù)皮和精油的成分的抗氧化、抑菌等生物活性[19-23]，但對(duì)巨尾桉葉精油的化感作用研究較少，其并沒(méi)得到充分開(kāi)發(fā)利用。

本研究采用水蒸氣蒸餾法提取巨尾桉葉精油并進(jìn)行GC-MS分析，以黑麥草、小麥為供試植物，使用不同質(zhì)量濃度的巨尾桉葉精油測(cè)定化感作用相關(guān)的試驗(yàn)指標(biāo)，為進(jìn)一步利用巨尾桉葉精油開(kāi)發(fā)環(huán)境友好型生物除草劑及農(nóng)作物合理栽培提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

巨尾桉葉2020年5月采摘于中國(guó)四川眉山市洪雅縣余坪鎮(zhèn)（N 29°52′36.52″，E 103°29′17.51″）。將自然風(fēng)干的葉子粉碎過(guò)篩并保存在4℃冰箱中，備后續(xù)試驗(yàn)。正己烷（色譜純）、吐溫（Tween）80、次氯酸鈉、無(wú)水乙醇、石英砂、碳酸鈣、硫代巴比妥酸以及三氯乙酸，所有試劑均購(gòu)買于成都科龍化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1900紫外分光光度計(jì)，島津儀器（蘇州）有限公司；電熱恒溫水浴鍋，北京市永光明醫(yī)儀器有限公司；SC-3614離心機(jī)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司。

1.3 精油提取

精準(zhǔn)稱取100 g巨尾桉葉干粉于圓底燒瓶，按1∶6的比例加600 mL蒸餾水混勻，連接蒸餾裝置，加熱提取5 h，待靜置分層后加無(wú)水硫酸鈉脫水收集精油，置棕色瓶中4℃下保存?zhèn)溆?。精油得率公式如下?/p>

精油得率=所得精油質(zhì)量/所用桉葉質(zhì)量×100%

1.4 GC-MS分析

精油用正己烷稀釋至10 μL/mL，并用正己烷作為空白對(duì)照。

氣相色譜條件：分析柱：HP-5MS柱子；升溫程序：50℃ 保持6 min，以10℃/min升溫速度升至120℃，保持5min；以8℃/min升至160℃，保持4min；再以12℃/min升至280℃保持5 min。載氣為氦氣，進(jìn)樣量：1 μL，分流 50∶1，進(jìn)樣口溫度為 260 ℃，接口溫度220℃。

質(zhì)譜條件：電子轟擊（EI）離子源，電子能量70 eV，電子倍增器電壓1.5 kV，質(zhì)量掃描范圍40～550 amu，全掃描，進(jìn)樣量 1 μL。

數(shù)據(jù)處理及質(zhì)譜檢索：通過(guò)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀提供的NIST MS質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析確定其組成成分，并通過(guò)峰面積歸一化法計(jì)算各成分的相對(duì)含量[24]。

1.5 化感作用的生物測(cè)定

1.5.1 植物種子準(zhǔn)備及預(yù)處理

黑麥草（Lolium perenne L.）、小麥（Triticum aestivumL.）種子購(gòu)買于農(nóng)資店。選取大小一致、飽滿且無(wú)蟲(chóng)害的種子，用0.5%次氯酸鈉溶液對(duì)種子消毒5 min，蒸餾水洗凈，濾紙吸干種子表面水分，以備后續(xù)使用。

1.5.2 種子萌發(fā)試驗(yàn)

采用培養(yǎng)皿法[13]，稍加改動(dòng)。用1%吐溫80溶液制備不同質(zhì)量濃度（0.125、0.250、0.500、1.000 和 2.000 mg/mL）的巨尾桉葉精油溶液。在直徑9 cm的培養(yǎng)皿中放2張已消毒的濾紙，試驗(yàn)組分別加入5 mL不同質(zhì)量濃度精油溶液，對(duì)照組加入5 mL蒸餾水。待濾紙浸濕后將已消毒籽粒飽滿大小均勻的黑麥草、小麥種子各40粒分別在濾紙上均勻鋪開(kāi)，立即蓋上皿蓋，并在培養(yǎng)皿的上方罩一個(gè)透光、透氣的塑料罩，置于（26±2）℃培養(yǎng)室培養(yǎng)，光照12 h，黑暗12 h。為保證濾紙濕潤(rùn)，培養(yǎng)3 d后每隔2 d向培養(yǎng)皿中加2 mL試驗(yàn)組溶液和對(duì)照組溶液。以胚根或胚軸突破種皮1～2 mm為種子發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)，每天統(tǒng)計(jì)種子發(fā)芽數(shù)量，連續(xù)統(tǒng)計(jì)7 d（直到種子不再發(fā)芽為止）。計(jì)算最終發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)；并在第7天用數(shù)碼顯示游標(biāo)卡尺測(cè)量幼苗的苗高及根長(zhǎng) (胚軸末端至根末端的長(zhǎng)度)，各處理均重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

計(jì)算公式：

發(fā)芽率=發(fā)芽終期（第7天）正常發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%

發(fā)芽勢(shì)=發(fā)芽初期（第3天）正常發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%

發(fā)芽指數(shù)=Σ（Gt/Dt），Gt為第t天的發(fā)芽數(shù)，Dt為相應(yīng)的發(fā)芽天數(shù)

1.5.3 葉綠素含量的測(cè)定

采用分光光度計(jì)法[25]，稍加改動(dòng)。稱0.1 g葉片置研缽中，加入適量石英砂、碳酸鈣及2mL95%乙醇充分研磨，研磨液轉(zhuǎn)移到2 mL離心管中離心，10 000 r/min，2 min；取上清液加95%乙醇定容于50 mL容量瓶混勻，測(cè)定440、645和663 nm 3個(gè)波長(zhǎng)的OD值。所有過(guò)程均在暗室中完成。

1.5.4 丙二醛含量的測(cè)定

參照王學(xué)奎[26]方法，稍加改動(dòng)。稱0.1 g葉片，加少許石英砂，加入5 mL 5%三氯乙酸研磨，將提取液4 000 r/min離心10 min；上清液保存?zhèn)溆?；? mL上清液，加入0.67%硫代巴比妥酸（TBA）3 mL，混勻后沸水浴 30 min，冷卻離心，4 000 r/min，8 min。測(cè)定450、532和600 nm 3個(gè)波長(zhǎng)上清液的OD值。

1.6 數(shù)據(jù)分析

化感作用響應(yīng)指數(shù)（RI）[27]表示化感作用強(qiáng)弱。當(dāng) T≥C，RI=1-C/T；當(dāng) T0，表現(xiàn)為促進(jìn)。其中，C為對(duì)照，T為處理。RI絕對(duì)值大小與作用強(qiáng)度一致。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析及顯著性檢驗(yàn)（P<0.05），用Graphpad 8.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理分析，均重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

巨尾桉葉精油提取率為0.58%，密度為0.89 g/mL。通過(guò)GC-MS對(duì)巨尾桉葉精油進(jìn)行檢測(cè)分析，采用面積歸一化法確定各成分相對(duì)含量。由表1所示，該精油鑒定出36種成分，占精油總量的92.076%。巨尾桉葉精油主要包含萜類、酯類、醇類和酮類等成分，含量最多的是萜類占61.372%，其中萜類含量最高的是桉葉油醇；其次酯類含量最多的是乙酸松油酯可達(dá)到24.604%，而含量最低是酮類的植酮只占0.405%。

表1 巨尾桉精油成分及相對(duì)含量Table 1 Composition and relative content of Eucalyptus grandis×E.urophylla essential oil

續(xù)表1

2.1 巨尾桉精油的化感活性

2.1.1 巨尾桉精油對(duì)種子萌發(fā)的影響

巨尾桉精油對(duì)2種種子最終發(fā)芽率的影響如表2所示。在不同質(zhì)量濃度的精油處理下，黑麥草和小麥種子的最終發(fā)芽率均受到了抑制影響。與對(duì)照組相比，種子的最終發(fā)芽率均表現(xiàn)為質(zhì)量濃度越高抑制效果越強(qiáng)，并且在精油質(zhì)量濃度為2.000 mg/mL處抑制效果最大。根據(jù)表2數(shù)據(jù)分析，巨尾桉精油對(duì)黑麥草、小麥種子萌發(fā)的半抑制質(zhì)量濃度（IC50）為1.000 mg/mL。

表2 巨尾桉精油對(duì)種子萌發(fā)的影響Table 2 Effect of Eucalyptus grandis×E.urophylla essential oil on germination of seeds

從表2中可以看出，巨尾桉精油具有降低黑麥草、小麥種子的最終發(fā)芽勢(shì)的作用。與巨尾桉精油的質(zhì)量濃度呈一定的依賴關(guān)系，尤其在2.000 mg/mL處，黑麥草發(fā)芽勢(shì)僅為10.83%?？梢?jiàn)，2.000 mg/mL的巨尾桉精油對(duì)2種植物種子最終發(fā)芽勢(shì)均有顯著影響（P<0.05）。

一般情況下，發(fā)芽指數(shù)越高說(shuō)明該種子發(fā)芽所需要的時(shí)間越短，發(fā)芽速度越快。由表2可見(jiàn)，各質(zhì)量濃度處理組的黑麥草、小麥種子發(fā)芽指數(shù)均低于對(duì)照組。說(shuō)明巨尾桉精油對(duì)黑麥草、小麥種子的發(fā)芽速率均有一定的抑制作用。隨著精油質(zhì)量濃度的提高，種子的發(fā)芽指數(shù)不斷降低。其中在2.000 mg/mL質(zhì)量濃度處理下，黑麥草和小麥種子的發(fā)芽指數(shù)均最低，與對(duì)照組有極顯著差異（P<0.05）。

2.1.2 巨尾桉精油對(duì)種子幼苗生長(zhǎng)的影響

幼苗生長(zhǎng)與苗高、根長(zhǎng)有關(guān)。如圖1A所示，巨尾桉精油對(duì)2種種子的苗高生長(zhǎng)均有抑制作用，且呈現(xiàn)明顯的質(zhì)量濃度依賴性，其中黑麥草對(duì)巨尾桉精油的敏感度要比小麥強(qiáng)，可見(jiàn)影響抑制效果與種類有關(guān)。如圖1B可見(jiàn)，黑麥草和小麥的根長(zhǎng)隨著巨尾桉精油質(zhì)量濃度的增加而減小。根據(jù)方差分析，各處理組間2種種子幼苗的苗高、根長(zhǎng)存在顯著差異（P<0.05），說(shuō)明巨尾桉精油對(duì)黑麥草、小麥幼苗的生長(zhǎng)有一定的抑制作用。

圖1 巨尾桉精油對(duì)種子幼苗生長(zhǎng)的影響Figure 1 Effect of Eucalyptus grandis×E.urophylla essential oil on the seedling growth

2.1.3 巨尾桉精油對(duì)幼苗葉綠素、丙二醛含量的影響

葉綠素含量與光合作用緊密相關(guān)，光合作用的強(qiáng)弱又影響到植物的生長(zhǎng)。如表3所示，不同質(zhì)量濃度的巨尾桉精油對(duì)2種種子幼苗葉綠素a、b含量產(chǎn)生影響。黑麥草葉綠素a的含量除了在0.250 mg/mL質(zhì)量濃度外，其他質(zhì)量濃度間與對(duì)照相比，差異顯著（P<0.05），其中0.125 mg/mL質(zhì)量濃度下表現(xiàn)出促進(jìn)作用，而其他質(zhì)量濃度均為抑制作用。小麥葉綠素a含量最低出現(xiàn)于1.000 mg/mL質(zhì)量濃度處，與對(duì)照相比，顯著降低了29.1%（P<0.05）。但從表3可見(jiàn)，黑麥草葉綠素b含量變化沒(méi)有明顯的規(guī)律可循，與對(duì)照相比，只有0.500 mg/mL質(zhì)量濃度存在差異（P<0.05）；但小麥的葉綠素b含量除了0.125 mg/mL質(zhì)量濃度下不存在顯著差異，其他處理組與對(duì)照差異顯著（P<0.05）。

表3 巨尾桉精油對(duì)幼苗葉綠素、丙二醛含量的影響Table 3 Effect of Eucalyptus grandis×E.urophylla essential oil on chlorophyll and malondialdehyde content in seedlings

丙二醛含量是植物細(xì)胞膜質(zhì)過(guò)氧化程度的體現(xiàn)，如表3所示，黑麥草幼苗在不同精油質(zhì)量濃度處理下，丙二醛的含量隨著質(zhì)量濃度的增加而增大，與對(duì)照組相比差異顯著（P<0.05），而小麥幼苗僅在0.500～2.000 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與對(duì)照組存在顯著差異（P<0.05），說(shuō)明巨尾桉精油處理后，2種植物細(xì)胞膜質(zhì)過(guò)氧化程度升高，細(xì)胞膜受到的傷害隨著質(zhì)量濃度的升高逐漸加重。

2.1.4 巨尾桉精油對(duì)2種種子的化感響應(yīng)指數(shù)

化感響應(yīng)指數(shù)（RI）是衡量化感作用強(qiáng)度的指標(biāo)，RI>0，為促進(jìn)，RI<0，為抑制[27]。由圖 2 可見(jiàn)，巨尾桉精油對(duì)黑麥草（圖2A）、小麥（圖2B）種子的不同生理指標(biāo)有不同的化感響應(yīng)指數(shù)。除葉綠素a、b個(gè)別情況以及丙二醛含量外，2種種子的其他生理指標(biāo)化感響應(yīng)指數(shù)均為負(fù)值，化感響應(yīng)指數(shù)的大小與質(zhì)量濃度的大小呈依賴關(guān)系。而2種種子的丙二醛化感響應(yīng)指數(shù)為正值，則說(shuō)明丙二醛含量增加，代表2種植物的細(xì)胞膜質(zhì)過(guò)氧化程度升高，細(xì)胞膜受到的傷害逐漸增大。

圖2 巨尾桉精油對(duì)2種種子化感響應(yīng)指數(shù)Figure 2 Allelopathic response index of Eucalyptus grandis×E.urophylla essential oil to two seeds

3 討論與結(jié)論

本研究在巨尾桉葉精油化學(xué)成分分析中發(fā)現(xiàn)桉葉油醇（19.843%）、蒎烯（15.517%）和 α-松油醇（10.294%）等萜類物質(zhì)相對(duì)含量占總精油的61.372%，是巨尾桉葉精油的主要組成成分，除此之外還有乙酸松油酯（24.604%）、植酮（0.405%）及醇類等。Zhou L.J.等[22]采用超臨界CO2流體萃取法對(duì)3年生的巨尾桉葉提取8 h，其主要成分為桉葉油醇（45.57%）和α-蒎烯（24.78%）；A.Lucia等[28]評(píng)估了阿根廷巨桉的主要成分是α-蒎烯（52.71%）和桉葉油醇（18.38%），這些差異可能是由于生長(zhǎng)環(huán)境，提取方法甚至生長(zhǎng)年限和收獲季節(jié)引起的。先前報(bào)道稱，萜類[13，29-31]、酯類[32]等次生代謝物是具有化感作用的物質(zhì)。馬瑞君等[33]研究結(jié)果表明，黃帚橐吾（Ligularia virgaurea（Maxim.）Mattf.ex Rehd.&Kobuski）的揮發(fā)物（含有大量的萜類物質(zhì)）對(duì)5種牧草種子均有化感作用，并證明其化感作用與萜類物質(zhì)有關(guān)。S.Benchaa等[13]對(duì)檸檬桉（Eucalyptus citriodora）葉精油化學(xué)成分及化感作用進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)檸檬桉葉精油主要以萜類成分為主，其中香茅醛是最豐富的化合物（64.7%），香茅醇（10.9%）次之，并且其檸檬桉葉精油對(duì)雜草種子呈現(xiàn)化感抑制作用；N.Zahed等[31]對(duì)柔毛肖乳香（Schinus molle L.）葉和果精油成分和化感活性進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)這兩種精油成分也是以萜類為主，其對(duì)小麥的化感作用呈現(xiàn)濃度效應(yīng)，且對(duì)小麥萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)抑制效果較強(qiáng)；G.A.Ben等[6]同樣研究發(fā)現(xiàn)桉樹(shù)（Eucalyptus erythrocorys）粗提物對(duì)小麥及雜草種子的萌發(fā)、幼苗生長(zhǎng)均有抑制作用，抑制作用強(qiáng)度隨提取物質(zhì)量濃度呈劑量效應(yīng)；張曉芳等[32]研究表明白三葉草（Trifolium repens L.）揮發(fā)物對(duì)雜草有化感作用，其揮發(fā)性成分以烯和酯類化合物為主；有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，用精油處理植物會(huì)使其葉綠素含量減少[2，34]，丙二醛含量增加[34]，結(jié)合本研究發(fā)現(xiàn)，在不同質(zhì)量濃度的巨尾桉葉精油處理下，黑麥草、小麥幼苗的葉綠素含量隨著濃度增加而減少，并且黑麥草、小麥幼苗的丙二醛含量隨著濃度的增大而增大；同時(shí)，經(jīng)巨尾桉葉精油處理后黑麥草、小麥種子的最終發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)以及幼苗的生長(zhǎng)總體上均低于對(duì)照，各指標(biāo)均隨巨尾桉葉精油質(zhì)量濃度的增加不斷減小，這都與先前的研究結(jié)果相一致。

綜上所述，本研究初步證實(shí)巨尾桉葉精油對(duì)黑麥草、小麥具有化感作用，然而具體是巨尾桉葉精油中的何種化合物或是幾種化合物的協(xié)同導(dǎo)致的化感作用還需進(jìn)一步深入研究，以此來(lái)充分發(fā)掘巨尾桉葉精油在生物除草應(yīng)用方面的潛力。